Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania biomechaniczne ścięgien myszy

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60280

⸱

15 października 2019

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Columbia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje skuteczne i powtarzalne metody testowania biomechanicznego rozciągania ścięgien mysich za pomocą specjalnie dopasowanych uchwytów drukowanych w 3D.

Streszczenie

Zaburzenia ścięgien są powszechne, dotykają ludzi w każdym wieku i często są wyniszczające. Standardowe metody leczenia, takie jak leki przeciwzapalne, rehabilitacja i naprawa chirurgiczna, często kończą się niepowodzeniem. Aby określić funkcję ścięgien i wykazać skuteczność nowych metod leczenia, należy dokładnie określić właściwości mechaniczne ścięgien z modeli zwierzęcych. Mysie modele zwierzęce są obecnie szeroko stosowane do badania zaburzeń ścięgien i oceny nowych metod leczenia tendinopatii; Jednak określenie właściwości mechanicznych ścięgien myszy było wyzwaniem. W tym badaniu opracowano nowy system do testów mechanicznych ścięgien, który obejmuje wydrukowane w 3D mocowania, które dokładnie pasują do anatomii kości ramiennej i piętowej, aby mechanicznie przetestować odpowiednio ścięgna nadgrzebieniowe i ścięgna Achillesa. Oprawy te zostały opracowane przy użyciu rekonstrukcji 3D natywnej anatomii kości, modelowania bryłowego i produkcji addytywnej. Nowe podejście wyeliminowało niedoskonałości chwytu (np. awarię płytki wzrostowej, a nie ścięgna), skróciło całkowity czas testowania i zwiększyło odtwarzalność. Co więcej, ta nowa metoda jest łatwo adaptowana do testowania innych ścięgien myszy i ścięgien innych zwierząt.

Wprowadzenie

Zaburzenia ścięgien są powszechne i bardzo rozpowszechnione wśród starzejących się, wysportowanych i aktywnych populacji1,2,3. W Stanach Zjednoczonych każdego roku zgłaszanych jest 16,4 miliona urazów tkanki łącznej4 i stanowią one 30% wszystkich wizyt w gabinecie lekarskim związanych z urazami3,5,6,7,8. Do najczęściej dotkniętych miejsc należą stożek rotatorów, ścięgno Achillesa i ścięgno rzepki9. Chociaż zbadano różne metody leczenia nieoperacyjnego i operacyjnego, w tym leki przeciwzapalne, rehabilitację i naprawę chirurgiczną, wyniki pozostają słabe, z ograniczonym powrotem do funkcji i wysokimi wskaźnikami niepowodzeń5,6. Te słabe wyniki kliniczne zmotywowały do badań podstawowych i translacyjnych mających na celu zrozumienie tendinopatii i opracowanie nowych metod leczenia.

Właściwości biomechaniczne przy rozciąganiu są podstawowymi wynikami ilościowymi definiującymi funkcję ścięgien. Dlatego laboratoryjna charakterystyka tendinopatii i skuteczności leczenia musi obejmować rygorystyczne badania właściwości rozciągania ścięgien. W licznych badaniach opisano metody określania właściwości biomechanicznych ścięgien z modeli zwierzęcych, takich jak szczury, owce, psy i króliki10,11,12. Jednak niewiele badań testowało właściwości biomechaniczne ścięgien mysich, głównie ze względu na trudności w chwytaniu małych tkanek do próby rozciągania. Ponieważ modele mysie mają wiele zalet w mechanistycznym badaniu tendinopatii, w tym manipulację genetyczną, szerokie opcje odczynników i niskie koszty, konieczne jest opracowanie dokładnych i wydajnych metod biomechanicznego badania tkanek myszy.

Aby prawidłowo przetestować właściwości mechaniczne ścięgien, tkanka musi być skutecznie uchwycona, bez poślizgu lub sztucznego rozdarcia na styku uchwytu lub złamania płytki wzrostu. W wielu przypadkach, szczególnie w przypadku krótkich ścięgien, kość jest chwytana na jednym końcu, a ścięgno jest chwytane na drugim końcu. Kości są zazwyczaj zabezpieczane poprzez osadzenie ich w materiałach takich jak żywica epoksydowa 13 i polimetakrylan metylu14,15. Ścięgna są często umieszczane między dwiema warstwami papieru ściernego, sklejane cyjanoakrylanem i zabezpieczane za pomocą zacisków zaciskowych (jeśli przekrój jest płaski) lub w zamrożonym podłożu (jeśli przekrój jest duży)15,16,17. Metody te zostały zastosowane do biomechanicznego testowania ścięgien mysich, ale pojawiają się wyzwania ze względu na mały rozmiar próbek i podatność płytki wzrostowej, która nigdy nie kostnieje18. Na przykład średnica mysiej głowy kości ramiennej wynosi zaledwie kilka milimetrów, co utrudnia chwytanie kości. W szczególności próba rozciągania próbek ścięgna nadgrzebieniowego myszy od ścięgna do kości często kończy się niepowodzeniem na płytce wzrostowej, a nie na ścięgnie lub przyczepie ścięgnistej ścięgna. Podobnie wyzwaniem są badania biomechaniczne ścięgna Achillesa. Chociaż ścięgno Achillesa jest większe niż inne ścięgna myszy, kość piętowa jest mała, co utrudnia chwytanie tej kości. Kość można usunąć, a następnie chwycić za dwa końce ścięgien; Wyklucza to jednak badanie przyczepu ścięgna do kości. Inne grupy donoszą o chwytaniu kości piętowej za pomocą niestandardowych uchwytów19,20, kotwienie za pomocą zacisków21, mocowanie w samoutwardzalnym cemencie z tworzywa sztucznego22 lub przy użyciu szczeliny o kształcie stożkowym22, jednak te wcześniejsze metody pozostają ograniczone przez niską powtarzalność, wysoki wskaźnik niepowodzeń chwytania i żmudne wymagania przygotowawcze.

Celem obecnego badania było opracowanie dokładnej i efektywnej metody biomechanicznego testowania ścięgien mysich przy rozciąganiu, skupiając się na przykładach ścięgien nadgrzebieniowych i ścięgna Achillesa. Wykorzystując kombinację rekonstrukcji 3D z natywnej anatomii kości, modelowania bryłowego i wytwarzania przyrostowego, opracowano nowatorską metodę chwytania kości. Oprawy te skutecznie zabezpieczały kości, zapobiegały uszkodzeniu płytki wzrostowej, skracały czas przygotowania próbki i zwiększały powtarzalność testów. Nowa metoda jest łatwo adaptowana do testowania innych ścięgien myszy, a także ścięgien u szczurów i innych zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Columbia. Myszy użyte w tym badaniu pochodziły z C57BL/6J i zostały zakupione w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Trzymano je w warunkach barierowych wolnych od patogenów i dostarczano im pożywienie i wodę ad libitum.

1. Opracowanie indywidualnie dopasowanych drukowanych w 3D uchwytów do chwytania kości

  1. Akwizycja obrazu kości i budowa modelu kości 3D
    1. Przeanalizuj kość będącą przedmiotem zainteresowania w ramach przygotowań do tworzenia modelu 3D i drukowania 3D z użyciem uchwytu kostnego; kość ramienna i piętowa są używane jako przykłady w obecnym protokole.
      UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące preparowania próbek kości, ścięgien i mięśni do badań mechanicznych znajdują się w kroku 2.1.1. Należy wykonać następujące kroki, aby wyizolować kości w celu stworzenia uchwytów kostnych wydrukowanych w 3D.
      1. Rozwarstwienie kości ramiennej: Poddaj mysz eutanazji zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC. Usuń skórę kończyny górnej, usuń wszystkie mięśnie nad kością ramienną, rozłącz staw łokciowy i ramienny oraz ostrożnie usuń wszystkie tkanki łączne przyczepione do kości ramiennej.
      2. Rozwarstwienie kości piętowej: Eutanazja myszy zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC. Usuń skórę kończyny dolnej, rozłącz staw ścięgna Achillesa i kość piętową oraz stawy między kością piętową a innymi kośćmi stopy, a następnie ostrożnie usuń wszystkie tkanki łączne przyczepione do kości piętowej.
    2. Wykonaj tomografię mikrokomputerową całej kości, np. skanuj próbki kości ramiennej i piętowej.
      UWAGA: W zależności od używanego skanera ustawienia będą się różnić. Dla skanera wykorzystywanego w bieżącym badaniu (Tabela Materiałów) zalecane ustawienia to: skanowanie z energią 55 kVP, filtr Al 0,25, w rozdzielczości 6 μm.
      1. Wymieszaj proszek agarozy w ultraczystej wodzie i kuchence mikrofalowej przez 1-3 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Pomocne jest podgrzewanie w kuchence mikrofalowej przez 30-45 sekund, zatrzymanie się i wirowanie, a następnie kontynuowanie w kierunku wrzenia. Napełnij krioprobówki do trzech czwartych agarozą. Pozwól agarozie ostygnąć przez około 5-10 minut.
      2. Włóż kość do żelu agarozowego (zapobiegnie to artefaktom ruchu podczas skanowania). Włóż krioprobówkę z kością do skanera.
        UWAGA: W przypadku skanera używanego w bieżącym badaniu do wszystkich skanów użyto 16-pozycyjnego automatycznego zmieniacza próbek. Ten skaner może automatycznie wybierać powiększenie w zależności od rozmiaru i kształtu próbki.
    3. Rekonstrukcja obrazów projekcyjnych ze skanu mikrokomputerowego w obrazy przekrojowe. Użyj zalecanych parametrów dla kombinacji skanera i oprogramowania eksperymentatora.
      UWAGA: Dla programu wykorzystywanego w bieżącym opracowaniu (Tabela materiałów) zaleca się stosowanie następujących parametrów rekonstrukcji: Wygładzanie: 0-2, Korekcja utwardzania wiązki: 45, Redukcja artefaktów pierścieniowych: 4-9 oraz rekonstrukcja wycinków w 16-bitowym formacie TIFF.
    4. Utwórz model 3D i zapisz go w standardowym formacie STL kompatybilnym z większością drukarek 3D i szybkim prototypowaniem. Dla programu używanego w bieżącym badaniu (Tabela materiałów) wykonaj następujące czynności:
      1. Wybierz polecenie File > Open, aby otworzyć zestaw danych pliku. Otwórz okno dialogowe Plik > Preferencje i wybierz kartę Zaawansowane.
      2. Użyj algorytmu renderowania adaptacyjnego, aby skonstruować modele 3D. Algorytm ten minimalizuje liczbę trójkątów fasetkowych i zapewnia gładsze szczegóły powierzchni. Użyj 10 jako parametru lokalizacji; Ten parametr określa odległość w pikselach do sąsiedniego punktu używaną do znajdowania obramowania obiektu. Zminimalizuj tolerancję do 0,1, aby zmniejszyć rozmiar pliku.
        UWAGA: Po otwarciu zestawu danych obrazy są wyświetlane na stronie "Obrazy RAW".
      3. Aby określić głośność zainteresowania (VOI), ręcznie wybierz dwa obrazy, które chcesz ustawić jako górę i dół wybranego zakresu VOI.
      4. Przejdź do drugiej strony, Region zainteresowania. Ręcznie wybierz obszar zainteresowania na pojedynczym obrazie przekroju poprzecznego.
        UWAGA: Wybrany obszar zostanie podświetlony na czerwono (tj. pole przekroju kości ramiennej).
      5. Powtarzaj poprzedni krok co 10–15 obrazów przekrojów.
      6. Przejdź do trzeciej strony Wybór binarny. W menu histogramu kliknij polecenie Z zestawu danych. Zostanie pokazany rozkład jasności histogramu ze wszystkich obrazów zestawu danych. Również w menu histogramu kliknij menu Utwórz plik modelu 3D.
    5. Zapisz model 3D kości w formacie pliku STL.
    6. Udoskonalanie siatki: Manipuluj siatką, aby zmniejszyć rozmiar pliku STL i uczynić go zgodnym z dowolnym programem do projektowania wspomaganego komputerowo do modelowania brył. W przypadku programu używanego w bieżącym badaniu (Tabela materiałów) należy postępować zgodnie z poniższymi krokami:
      1. Zaimportuj siatkę i wybierz wszystko do edycji. Wybierz opcję Zmniejsz z zestawu narzędzi Edytuj. Następnie wybierz pozycję Triangle Budget (Budżet trójkąta) z zestawu narzędzi Reduce Target (Zmniejsz wartość docelową). Zmniejsz liczbę trzech elementów i zaakceptuj zmiany. Zapisz ponownie nowo zredukowany plik w formacie STL, wybierając opcję Eksportuj jako...
  2. Projektowanie indywidualnie dopasowanych opraw kostnych
    1. Kość ścięgnisto-ramienna nadgrzebieniowa
      1. Użyj programu do komputerowego wspomagania modelowania brył, aby stworzyć niestandardowy model uchwytu do chwytania kości ramiennej (Rysunek 1, pliki uzupełniające).
        UWAGA: Program używany w bieżącym badaniu jest wymieniony w Tabeli Materiałów.
      2. Otwórz plik w formacie STL kości ramiennej w programie do modelowania brył i zapisz jako plik części.
        UWAGA: W przypadku oprogramowania używanego w bieżącym badaniu (Tabela materiałów) obiekt kości 3D został zapisany w formacie SLDPRT.
      3. Otwórz plik części i ręcznie utwórz trzy anatomicznie istotne płaszczyzny (tj. strzałkową, czołową, poprzeczną).
        1. Ręcznie zdefiniuj płaszczyznę strzałkową, aby przeciąć przyczep ścięgna nadgrzebieniowego przy większej guzowatości. Upewnij się, że blok 3D zawiera płaszczyznę strzałkową jako płaszczyznę symetrii. Aby to osiągnąć, w razie potrzeby dodaj lub wytnij materiał z bloku.
          UWAGA: Ta płaszczyzna symetrii zapewnia, że po włożeniu próbki do uchwytów ścięgno i przyczep ścięgna znajdują się w centralnej osi uchwytu.
      4. Zmierz wymiary kości wzdłuż każdej z trzech płaszczyzn (tj. wysokość, szerokość, długość).
      5. Zmierz wymiary uchwytów do testowania mechanicznego, do których zostanie przymocowany uchwyt wydrukowany w 3D.
      6. Zacznij od zaprojektowania bryłowej części blokowej (np. bryły walca).
        1. Upewnij się, że każdy wymiar bloku jest co najmniej 5 mm większy niż wymiary kości ramiennej.
        2. Uwzględnij ograniczenia projektowe związane z uchwytami do testowania mechanicznego (tj. upewnij się, że uchwyt wydrukowany w 3D można swobodnie montować i demontować w uchwytach do testowania mechanicznego).
      7. Utwórz model zespołu z dwoma komponentami: bryłą blokową oraz prawą lub lewą kością ramienną. Określ orientację kości w bloku (tj. kąt między ścięgnem a kością). Upewnij się, że cała objętość kości mieści się w bloku.
      8. Utwórz wgłębienie w bloku, używając kości ramiennej jako formy. Jeśli korzystasz z oprogramowania określonego w Tabeli materiałów, wykonaj następujące czynności:
        1. Włóż część konstrukcyjną (kość ramienną) i podstawę formy (blok cylindrów) do zespołu pośredniego. W oknie zespołu wybierz blok i kliknij Edytuj komponent na pasku narzędzi Zespół.
        2. Kliknij Wstaw > elementy > gniazda. Wybierz opcję Skalowanie jednolite i wprowadź 0% jako wartość, która ma być skalowana we wszystkich kierunkach.
      9. Wygasić część kostną i zapisać zespół jako część.
      10. Część otwarta (cylinder z wnęką). Wytnij część wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, aby utworzyć dwa symetryczne elementy, które pasują do kości z przodu i z tyłu (np. dwa półcylindry, jak widać na Rysunek 1).
        UWAGA: Zaprojektowano dwa elementy, które pasują do kości z przodu i z tyłu. Komponent przedni obejmuje półkulistą jamę przedłużoną od przedniej strony głowy kości ramiennej aż do przyczepu ścięgna nadgrzebieniowego. Jama elementu tylnego ma kształt tylnej części kości ramiennej (tj. Tylna strona głowy kości ramiennej, guzowatość naramienna oraz nadkłykieć przyśrodkowy i boczny).
      11. Zapisz każdy komponent jako oddzielną część pliku.
      12. W przypadku części przedniej upewnij się, że głowa kości ramiennej jest osadzona we wnęce części, określając odpowiednie tolerancje.
        UWAGA: W obecnym badaniu, przy użyciu oprogramowania określonego w Tabeli Materiałów, zaleca się wykonanie poniższych czynności:
        1. Utwórz cięcie obrócone, aby wygładzić geometrię siatki gniazda. Utwórz szkic cięcia, emulując geometrię gniazda i dodając prześwit lokalizacyjny.
          UWAGA: Luz pozwala na swobodny montaż i demontaż pomiędzy kością a elementem przednim.
      13. Zmodyfikuj komponent tylny, aby imitował geometrię wnęki, aby utworzyć cięcie, które zwiększa prześwit, jak opisano powyżej dla komponentu przedniego.
      14. Wykonaj cięcie w płaszczyźnie poprzecznej, zaczynając od góry tylnego składnika aż do grzbietu większego/mniejszego guzka.
        UWAGA: Jak widać na Rysunek 1 i Rysunek 2, tylny komponent zawiera nacięcie, które tworzy otwór w przyczepie ścięgna.
      15. Stwórz dokładne dopasowanie między dwoma komponentami, aby umożliwić swobodny montaż i demontaż.
        UWAGA: Dla opraw w bieżącym badaniu utworzono pasowanie otwor-wał z luźnym luzem roboczym
        16. .
      16. Twórz modele lustrzane 3D dla każdego komponentu uchwytu dla przeciwległej kończyny (tj. lewej lub prawej).
      17. Dodaj wytrawianie na spodzie opraw, aby rozróżnić lewą i prawą stronę.
      18. Zapisz wszystkie części osprzętu w standardowym formacie pliku STL w ramach przygotowań do druku 3D.
    2. Kość ścięgna Achillesa i kości piętowej
      1. Wykonaj te same czynności, jak opisano powyżej dla mocowania głowy nadogrzebno-ramiennej.
        UWAGA: Dla kości piętowej Achillesa potrzebny jest tylko jeden zestaw mocowań, ponieważ anatomia lewej i prawej kości piętowej jest prawie symetryczna.

2. Badania biomechaniczne ścięgien myszy

  1. Przygotowanie próbki i pomiar pola przekroju poprzecznego
    1. Przeprowadź sekcję mięśnia, ścięgna i kości będącej przedmiotem zainteresowania, przygotowując się do prób mechanicznych na rozciąganie. W obecnym badaniu próbki mięśnia nadgrzebieniowego - ścięgna - kości ramiennej (N = 10, 5 samców, 5 kobiet) i mięśnia brzuchatego łydki - kości piętowej Achillesa (N = 12, 6 samców, 6 samic) izolowano od 8-tygodniowych myszy C57BL / 6J.
      1. Rozwarstwienie mięśnia nadgrzebieniowego - ścięgna - próbki kości ramiennej
        1. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC. Ustaw mysz w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie w skórze od wysokości powyżej łokcia przedniej łapy w kierunku ramienia.
        2. Ostrożnie usuń skórę rozwarstwieniem, tak aby widoczna była muskulatura ramienia. Usuń tkankę otaczającą kość ramienną, aż kość zostanie odsłonięta i będzie można ją bezpiecznie przytrzymać kleszczami.
        3. Przytrzymaj kość ramienną kleszczami i ostrożnie usuń mięśnie naramienne i czworoboczne, aby odsłonić łuk kruczo-ramienny. Zidentyfikuj staw barkowo-obojczykowy i ostrożnie oddziel obojczyk od wyrostka barkowego za pomocą ostrza skalpela.
        4. Uważając, aby nie uszkodzić ścięgna nadgrzebieniowego i jego kostnego przyczepu, usuń mięsień z przyczepu łopatki za pomocą ostrza skalpela. Uważając, aby nie uszkodzić ścięgna nadgrzebieniowego i jego kostnego przyczepu, odłącz głowę kości ramiennej od panewki; Za pomocą ostrza skalpela rozerwij torebkę stawową oraz ścięgna podgrzebieniowe, podłopatkowe i teres minor.
        5. Odłącz staw łokciowy, aby oddzielić kość ramienną od łokciowej i promieniowej. Odizoluj kość ramienną - ścięgno nadgrzebieniowe - mięsień i oczyść nadmiar tkanek miękkich na kości ramiennej i głowie kości ramiennej.
      2. Rozwarstwienie ścięgna Achillesa - próbka kości piętowej
        1. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC. Ustaw mysz w pozycji leżącej. Uważając, aby nie uszkodzić ścięgna Achillesa i jego kostnego przyczepu, należy usunąć skórę rozwarstwieniem, tak aby odsłonięte były mięśnie wokół stawów skokowych i kolanowych.
        2. Za pomocą ostrza skalpela, zaczynając od przyczepu ścięgna Achillesa - kości piętowej, ostrożnie odłącz mięsień brzuchaty łydki od jego bliższych przyczepów.
        3. Ostrożnie odłącz kość piętową od różnych sąsiednich kości. Odizoluj ścięgno Achillesa - próbkę kości piętowej i oczyść nadmiar tkanek miękkich.
    2. Określ pole przekroju poprzecznego ścięgna za pomocą tomografii mikrokomputerowej.
      UWAGA: Dla skanera wykorzystywanego w bieżącym badaniu (Tabela materiałów) zalecane ustawienia to: skanowanie z energią 55 kVP, filtr Al 0,25, w rozdzielczości 5 μm.
      1. Wymieszaj proszek agarozy w ultraczystej wodzie i kuchence mikrofalowej przez 1-3 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Pomocne jest podgrzewanie w kuchence mikrofalowej przez 30-45 sekund, zatrzymanie się i wirowanie, a następnie kontynuowanie w kierunku wrzenia. Napełnij krioprobówki do trzech czwartych agarozą. Pozwól agarozie ostygnąć przez około 5-10 minut.
      2. Zawieś próbkę w krioprobówce, wkładając kość do góry nogami.
        UWAGA: W żelu agarozowym powinna znajdować się tylko kość. Ścięgno i mięsień powinny być zawieszone na zewnątrz.
    3. Po skanowaniu delikatnie usuń mięsień ze ścięgna za pomocą ostrza skalpela. Włóż próbkę do uchwytu wydrukowanego w 3D.
      UWAGA: Uchwyty są wielokrotnego użytku do każdego testu. Nie używaj kleju ani żywicy epoksydowej w oprawie; Kość jest trzymana w pasowaniu wciskanym.
    4. Włóż i przyklej ścięgno między złożoną cienką bibułkę (2 cm x 1 cm) i zaciśnij konstrukcję za pomocą uchwytów z cienkiej folii. Przymocuj wydrukowany w 3D uchwyt z próbką do uchwytów testowych.
    5. Umieścić próbkę i uchwyty w kąpieli testowej z roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 37 °C (tj. temperatura ciała myszy23).
  2. Próba rozciągania
    1. Wykonaj próbę mechaniczną rozciągania na ramie do prób materiałowych.
      UWAGA: Dla ramy testowej stosowanej w bieżącym badaniu (Tabela materiałów) zalecany protokół to:
      1. Określ długość miernika jako odległość od przyczepu ścięgna do górnego uchwytu.
      2. Warunek wstępny z 5 cyklami w zakresie od 0,05 N do 0,2 N.
      3. Przytrzymaj przez 120 s.
      4. Użyj napięcia do uszkodzenia 0,2%/s.
    2. Zbieraj dane obciążenia-odkształcenia.
    3. Oblicz odkształcenie jako przemieszczenie w stosunku do początkowej długości ścięgna.
    4. Oblicz naprężenie jako siłę podzieloną przez początkową powierzchnię przekroju poprzecznego ścięgna (mierzoną z mikroCT).
    5. Jeśli interesuje nas zachowanie lepkosprężyste, należy przeprowadzić relaksację naprężeń przed próbą rozciągania na uszkodzenie i wykorzystać dane do obliczenia parametrów, takich jak A, B, C, TAU1 i tau2 z quasiliniowego modelu lepkosprężystości24.
    6. Na podstawie krzywej odkształcenia obciążenia oblicz sztywność (nachylenie liniowej części krzywej), maksymalną siłę i pracę do plastyczności (obszar pod krzywą do siły plastyczności).
      1. Zidentyfikuj część liniową, wybierając okno punktów na krzywej obciążenia-odkształcenia, które maksymalizuje wartość R2 dla liniowej regresji metodą najmniejszych kwadratów25.
      2. Określ sztywność jako nachylenie części liniowej krzywej obciążenia-przemieszczenia25,26.
    7. Na podstawie krzywej naprężenie odkształcenie oblicz moduł (nachylenie liniowej części krzywej), wytrzymałość (maksymalne naprężenie) i sprężystość (obszar pod krzywą do granicy plastyczności).
      UWAGA: Korzystając z algorytmu RANSAC, odkształcenie plastyczności (wartość x) definiuje się jako pierwszy punkt, w którym dopasowanie y odchyliło się o więcej niż 0,5% od oczekiwanej wartości naprężenia (wartość y). Granica plastyczności to odpowiadająca jej wartość y odmiany plonowania.
      UWAGA: Oprócz monotonicznego obciążenia rozciągającego do uszkodzenia opisanego w niniejszym badaniu, obciążenie cykliczne może dostarczyć ważnych informacji na temat zmęczenia ścięgien i/lub właściwości lepkosprężystości. Na przykład Freedman i wsp. opisali właściwości zmęczeniowe mysich ścięgien Achillesa 27.
    8. Po zakończeniu próby rozciągania należy wykonać tomografię mikrokomputerową całej kości, np. zeskanować próbki kości ramiennej i piętowej.
      UWAGA: Dla skanera wykorzystywanego w bieżącym badaniu (Tabela materiałów) zalecane ustawienia to: skanowanie z energią 55 kVP, filtr Al 0,25, w rozdzielczości 6 μm.
      1. Powtórz kroki 1.1.2.1–1.1.2.2.
    9. Powtórz krok 1.1.3.
    10. Użyj programu do wizualizacji 3D kompatybilnego ze skanerem, aby utworzyć model 3D skanowanego obiektu renderowany objętościowo.
      UWAGA: Program używany w bieżącym badaniu jest wymieniony w Tabeli Materiałów.
    11. Określ tryb awarii i obszar miejsca awarii, sprawdzając obiekt 3D.
  3. Analiza statystyczna: Pokazuje wszystkie wyniki próbek jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Dokonuj porównań między grupami za pomocą testów t uczniów (dwustronnych i niesparowanych). Ustaw istotność jako p < 0,05,
    UWAGA: Oprogramowanie statystyczne wykorzystane w bieżącym badaniu jest wymienione w Tabeli Materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do badania ścięgien nadgrzebieniowych i ścięgien Achillesa myszy w wieku 8 tygodni wykorzystano uchwyty wydrukowane w technologii 3D. Wszystkie próbki poddane testom mechanicznym uległy przerwaniu w obrębie entezji, co potwierdzono za pomocą skanów microCT, inspekcji wizualnej oraz analizy wideo po próbach rozciągania. Porównanie jeden do jednego poprzedniej i obecnej metody badania ścięgien nadgrzebieniowych w naszym laboratorium przedstawiono na Rysunku 3. W poprzedniej metodzie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mysie modele zwierzęce są powszechnie używane do badania zaburzeń ścięgien, ale charakterystyka ich właściwości mechanicznych jest trudna i rzadka w literaturze. Celem niniejszego protokołu jest opisanie efektywnej czasowo i powtarzalnej metody badania rozciągania ścięgien myszy. Nowe metody skróciły czas potrzebny na przetestowanie próbki z godzin do minut i wyeliminowały główny artefakt chwytania, który był częstym problemem w poprzednich metodach.

Kilka kroków opisanych w tym protokole ma k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaFisher ScientificBP160-100Dissovle 1g w 100 ml ultraczystej wody, aby uzyskać 1% agarozy 
Mikrotomograf komputerowy firmy Bruker Bruker BioSpin CorpSkyscan 1272 Wykorzystywane przez autorów
Siła elektryczna TA Instruments3200Platforma testowa
Etanol 200 ProofFisher ScientificA4094Rozcieńczyć do 70% i użyć zgodnie z sugestią w protokole
Przyrząd do mocowania uchwytówWykonaneUżywane przez autorów
KimwipesKimberly-Clark  S-8115Zgodnie z sugestią w protokole
MicroCT CT-Analyser (Ctan)Bruker BioSpin CorpUżywany przez autorów do wizualizacji i analizy skanów mikro-CT 
Woda MilliQ (Ultraczysta woda)Millipore SigmaQGARD00R1 (lub pokrewny oczyszczacz)100 ml 
MeshmixerAutodeskhttp://www.meshmixer.com/Darmowe oprogramowanie inżynierskie używane przez autorów do udoskonalania siatki
Objet EDEN 260VS Stratasys LTDPrecyzyjne prototypowanie
Objet StudioStratasys LTDUżywane przez autorów z drukarką 3D
PBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermoFisher Scientific100100312,5 l 10% PBS 
S& T KleszczeNarzędzia Fine Science00108-11Używane przez autorów
Ostrze skalpela - #11Narzędzia Fine Science10011-00Używane przez autorów
Rękojeść skalpela - #3Narzędzia Fine Science10003-12Używane przez autorów
SkyScan 1272Bruker BioSpin CorpUżywane przez autorów do wizualizacji i analizy skanów mikro-CT 
Skyscan CT-VoxBruker BioSpin CorpUżywany przez autorów do wizualizacji i analizy skanów mikro-CT 
SkyScan NReconBruker BioSpin CorpUżywany przez autorów do wizualizacji i analizy skanów mikro-CT 
SolidWorks CADDassault Systè mesSolidWorks Research SubsriptionModelowanie bryłowe projektowanie wspomagane komputerowo wykorzystywane przez autorów
SuperGlueLoctite234790Zgodnie z sugestią w protokole
Kąpiel testowaWykonaneUżywane przez
autorów Uchwyty cienkowarstwowe WykonaneUżywane przez autorów
VeroWhitePlusStratasys LTDNAMateriał do druku 3D używany przez autorów
WinTest OprogramowanieUżywane przez autorów do zbierania danych
na zamówienie na zamówienie na zamówienie WinTest

Bibliografia

  1. Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
  2. Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
  3. Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
  4. Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
  5. Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
  6. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
  7. Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
  8. Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
  9. Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
  10. Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
  11. West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
  12. Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
  13. Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
  14. Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019(2013).
  15. Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
  16. Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
  17. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
  18. Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, Springer. (2013).
  19. Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
  20. Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
  21. Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120(2018).
  22. Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
  23. Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
  24. Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
  25. Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
  26. Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
  27. Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
  28. Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
  29. Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
  30. Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
  31. Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
  32. Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
  33. Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003(2017).
  34. Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
  35. Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
  36. Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
  37. Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
  38. Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
  39. Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
  40. Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy - Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
  41. Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
  42. Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ci gna mysiewydrukowane w 3D uchwytyw a ciwo ci mechaniczne ci gienmikrotomografia komputerowaci gno mi nia nadgrzebieniowegoci gno Achillesauchwyty dopasowane indywidualniebadanie wytrzyma o ci na rozci ganieuszkodzenie p ytki wzrostu
Badania biomechaniczne ścięgien myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.