Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzenie
Makrofagi są pierwszą linią obrony immunologicznej i odgrywają rolę w organizowaniu odpowiedzi immunologicznych przeciwko patogenom i obcym materiałom, w tym komórkom rakowym. Są wyspecjalizowanymi fagocytami, które niszczą i pozbywają się niechcianych cząstek z organizmu. Makrofagi pełnią funkcje obronne, takie jak usuwanie komórek apoptotycznych i mikroorganizmów oraz rekrutacja innych komórek odpornościowych1. Makrofagi mogą różnicować się na dwa różne typy, makrofagi M1 i M2, w odpowiedzi na sygnały środowiskowe2. Makrofagi spolaryzowane M1 (tj. klasycznie aktywowane makrofagi) są aktywowane przez cytokiny interferon-γ (IFN-γ) i lipopolisacharydy (LPS) i biorą udział w odpowiedzi zapalnej, usuwaniu patogenów, skutecznej fagocytozie i odporności nowotworobójczej3,4. Makrofagi M2 są ściśle spokrewnione z makrofagami związanymi z nowotworem (TAM) i mają właściwości przeciwzapalne i promujące nowotwór4.
Fagocytoza, wywodząca się ze starożytnej greki (phagein), oznaczająca "pożerać", (kytos), oznaczająca "komórkę" i -osis, oznaczająca "proces"5. Fagocytoza to proces, w którym fagocyty (w tym makrofagi, monocyty i neutrofile) zabijają i pochłaniają atakujące patogeny, usuwają obce cząstki i usuwają apoptotyczne resztki komórek. Makrofagi związane z nowotworem (TAM) znajdują się w zrębie w różnych nowotworach, w tym w raku piersi, i pełnią funkcje pronowotworowe6,7, co skutkuje opornością na fagocytozę. Szczegółowy mechanizm fagocytozy komórek nowotworowych przez makrofagi nie jest jeszcze poznany.
To badanie przedstawia dwuetapową metodę: 1) komórki raka sutka myszy 4T1 i makrofagi spolaryzowane M1 są hodowane, oraz 2) aktywność fagocytarna makrofagów jest oceniana za pomocą mikroskopii wideo z żywymi komórkami. Barwnik fluorescencyjny CFSE użyto do barwienia komórek raka sutka myszy 4T1. Barwienie oznacza komórki 4T1 w celu odróżnienia ich od współhodowanych makrofagów M1 w jednym naczyniu do obrazowania. Makrofagi RAW 264.7 są spolaryzowane za pomocą LPS i IFN-γ do fenotypu M1. Aby zapewnić pełną polaryzację, przeprowadzono barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-iNOS sprzężonym z FITC. Następnie uzyskano wielopunktową serię zdjęć poklatkowych w celu obserwacji wielu zdarzeń, w tym fagocytozy, w kokulturze.
Lepsze zrozumienie interakcji między komórkami nowotworowymi a makrofagami może prowadzić do potencjalnej immunoterapii raka. Obrazowanie żywych komórek oferuje szczegółowy wgląd w dynamikę komórkową w czasie rzeczywistym i zostało wykorzystane do badania migracji komórek, fenotypowych badań przesiewowych, apoptozy i cytotoksyczności8,9 w neurobiologii, biologii rozwojowej i odkrywaniu leków. Chociaż proponowanym nowotworem w tym badaniu jest rak piersi, metoda może być również stosowana do wielu komórek docelowych i odrębnych komórek efektorowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Sekcje 1−6 opisują model kokultury komórek raka sutka myszy 4T1 i makrofagów myszy RAW 264.7. Sekcja 7 opisuje ocenę poklatkową komórek 4T1 z makrofagami M1
.1. Hodowla komórek raka sutka myszy 4T1 i makrofagów myszy RAW 264.7
- Rozmrozić fiolkę z kriogenicznie zakonserwowanymi 4T1 i RAW 264.7 przechodzącymi przez 6 komórek przez delikatne mieszanie w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C lub normalnej dla linii komórkowych.
UWAGA: Rozmrażanie powinno odbywać się szybko, w ciągu około 2 minut. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy wyjąć fiolkę z łaźni wodnej i odkazić ją poprzez spryskanie 70% etanolem. Aby uniknąć dryfu genetycznego, szczególnie w przypadku makrofagów, należy użyć niskiej liczby pasaży (tj. mniejszej niż 20). - Rozcieńczyć rozmrożone komórki w 10 ml kompletnej pożywki DMEM w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 600 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórek.
UWAGA: W całym protokole stosuje się kompletną pożywkę DMEM uzupełnioną o 10% (v/v) płodową surowicę bydlęcą (FBS), 200 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy. - Ostrożnie odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 8 ml kompletnego podłoża i przenieść do kolby o długości 25cm2 poddanej działaniu hodowli tkankowej. Hodowla komórek 4T1 i RAW 264,7 w kompletnym podłożu DMEM w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
UWAGA: Delikatnie zawiesić osady komórkowe i kropla po kropli dodawać zawiesinę komórek do kolby hodowlanej, aby uniknąć zabicia komórek. - Po 1 tygodniu hodowli, aby umożliwić przyleganie komórek, codziennie monitoruj kolbę i w razie potrzeby dodaj 8 ml kompletnej pożywki DMEM.
2. Barwienie immunologiczne makrofagów RAW 264.7 spolaryzowanych M1
- Gdy zbieg komórek RAW 264,7 osiągnie 70−80%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie spłucz 2x co najmniej 2 ml PBS.
UWAGA: Przed wysiewem komórek RAW 264.7 upewnij się, że nie doszło do różnicowania komórek (tj. fenotypu podobnego do dendrytu i/lub zwiększonego rozmiaru komórki). Jeśli widoczne są zmiany morfologii komórek, należy odrzucić hodowlę i rozmrozić nową linię komórkową z wcześniejszej fiolki z pasażem. - Przygotuj makrofagi do pobrania, delikatnie usuwając przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę komórek 1 x 105 komórek/naczynie, używając kompletnego podłoża DMEM.
- Wysiewaj 2 ml zawiesiny makrofagów do dwóch szalek do obrazowania. Inkubować komórki przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić przyleganie komórek.
- Przygotuj pożywkę polaryzacyjną M1, dodając 100 ng/ml LPS i 20 ng/ml IFN-γ do kompletnego medium DMEM10,11.
- Odrzucić supernatant hodowlany z makrofagów i ostrożnie umyć monowarstwy w naczyniu 2x co najmniej 1 ml PBS.
- Dodać 2 ml pożywki polaryzacyjnej M1 do jednej z naczyń do obrazowania, pozwolić komórkom RAW 264.7 indukować fenotyp makrofagów M1 i inkubować 2-3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
UWAGA: Nasiona RAW 264.7 makrofagów w naczyniu do obrazowania z DMEM uzupełnionym 10% FBS jako kontrola barwienia przeciwciałami anty-iNOS. Oznacz naczynia obrazowania odpowiednio jako RAW (kontrola) i makrofagi M1 (spolaryzowane LPS i IFN-γ). - Przed barwieniem immunologicznym utrwalić komórki makrofagów RAW 264.7 i M1 za pomocą 2 ml 4% paraformaldehydu i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C (temperatura pokojowa, RT).
- Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek 1 ml PBS co najmniej 3 razy.
- Stłumić 2 ml 50 mM chlorku amonu w PBS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Permeabilizować za pomocą 2 ml 0,3% Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek 1 ml PBS co najmniej 3 razy.
- Blokuj za pomocą 2 ml 10% FBS w PBS przez 30 minut w RT.
UWAGA: Etapem blokowania barwienia immunologicznego jest zminimalizowanie nieswoistego wiązania przeciwciała w komórce. - Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek 1 ml PBS co najmniej 3 razy.
- Inkubować z 2 ml anty-iNOS-FITC w PBS i 1% FBS przez noc w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Oznacz komórki odpowiednim rozcieńczeniem przeciwciał zgodnie z zaleceniami producenta. Chroń naczynia przed światłem, przykrywając je od tego momentu folią aluminiową. - Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek 1 ml PBS co najmniej 3 razy.
- Inkubować 1 ml 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) o stężeniu 300 nM w naczyniach do obrazowania przez 10 minut w temperaturze 37 °C, w ciemności, przykrywając folią aluminiową.
- Umyj komórki 1 ml PBS co najmniej 3x i dodaj 1 ml kompletnej pożywki DMEM do naczyń do obrazowania.
UWAGA: Komórki są teraz gotowe do obrazowania fluorescencyjnego. Konfiguracja mikroskopu będzie wymagała odwróconego stolika i filtrów wzbudzenia dla wybranych barwień (w tym przypadku FITC i DAPI). - Włącz mikroskop i załaduj oprogramowanie do obrazowania. Zamontuj czaszę obrazowania na mikroskopie i dostosuj ostrość, aby obserwować makrofagi RAW 264.7 i M1. Zoptymalizuj wygląd obrazów FITC i DAPI z kontrastem fazowym, dostosowując przechodzące światło i czasy ekspozycji.
UWAGA: Rozpocznij obrazowanie, gdy wszystkie punkty są ostre, a kanały są zoptymalizowane. - Przechwytywanie obrazów FITC i DAPI z kontrastem fazowym ( Rysunek 1).
3. Wysiewanie komórek raka sutka myszy 4T1
- Gdy zbieg komórek 4T1 osiągnie 70−80%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie spłucz 2x co najmniej 2 ml PBS. Dodać 1 ml podgrzanej trypsyny, aby oddzielić komórki i inkubować do 20 minut w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Obserwuj komórki pod mikroskopem. Odłączone komórki zostaną zaokrąglone. - Po odłączeniu komórek przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 2 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DMEM, aby dezaktywować trypsynę. Delikatnie rozprowadzić pożywkę, pipetując powierzchnię warstwy komórkowej w celu odzyskania komórek. Następnie odwirować przy 600 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DMEM.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 1 x 105 komórek 4T1 w 2 ml kompletnej pożywki DMEM w każdej z dwóch 35-milimetrowych naczyń obrazowych ze szklanym dnem poddanych hodowli tkankowej. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
UWAGA: Hoduj komórki 4T1 w jednej z naczyń obrazowania z pożywką polaryzacyjną M1 i oznacz induktorem 4T1 (kontrola). Ma to na celu zapewnienie prawidłowego wzrostu komórek 4T1 po wystawieniu na działanie induktorów.
4. Oznaczanie żywych komórek raka sutka myszy 4T1 za pomocą barwienia CFSE
- Najpierw usuń istniejące pożywki z naczyń do obrazowania komórek 4T1. Przemyj monowarstwę komórek co najmniej 2x 1 ml PBS.
- Przygotować 5 μM roztworu barwiącego CFSE, rozcieńczając CFSE w 1 ml PBS. Dodać 1 ml 5 μM roztworu barwiącego CFSE do każdej płytki obrazowania i inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 37 °C, w ciemności.
UWAGA: Oznacz komórki przy użyciu odpowiedniego stężenia roboczego CFSE zgodnie z zaleceniami producenta i wstępnymi eksperymentami, aby uzyskać optymalne stężenie barwienia CFSE. Wydajność etykietowania będzie wyższa, jeśli CFSE zostanie rozcieńczony w PBS. - Ugasić barwienie, dodając równą objętość kompletnego podłoża DMEM zawierającego 10% FBS i roztwór barwiący do komórek i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Odrzucić roztwór zawierający CFSE i przemyć komórki 1x równą objętością pożywki hodowlanej.
UWAGA: Komórki 4T1 są teraz znakowane fluorescencyjnie. - Przywróć komórki 4T1-CFSE do standardowych warunków hodowli w RT z 5% CO2 .
5. Wysiewanie makrofagów myszy RAW 264.7 i kokultura z 4T1
- Gdy zbieg RAW 264,7 osiągnie 70−80%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie spłucz 2x co najmniej 2 ml PBS.
- Przygotuj makrofagi do pobrania, delikatnie usuwając przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę komórek 1 x 105 komórek/ml, rozcieńczając pozostały roztwór kompletnym podłożem DMEM zgodnie z gęstością wysiewu.
UWAGA: Nadmiernie zlewające się komórki w kokulturach mogą poważnie zmniejszyć fagocytozę. W tym badaniu stosunek wysiewu makrofagów: komórek rakowych dostosowano do stosunku 1:1. Stosunek można dostosować w zależności od agresywności komórek nowotworowych i pochodzenia makrofagów. - Przed hodowlą należy wyrzucić supernatant hodowli z komórek 4T1 wysianych dzień wcześniej (krok 4.5) i ostrożnie umyć monowarstwy 2x co najmniej 1 ml PBS.
- Wysiewaj 1 x 105 RAW 264,7 komórek na 2 ml kompletnej pożywki DMEM do jednej z naczyń do obrazowania 4T1. Inkubować komórki przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić przyleganie komórek. Oznacz naczynie obrazowania 4T1-M1 coculture.
UWAGA: Komórki 4T1 (kontrolne) nie były hodowane wspólnie z makrofagami.
6. Polaryzacja M1 makrofagów RAW 264.7
- Przygotuj pożywkę polaryzacyjną M1, dodając 100 ng/ml LPS i 20 ng/ml IFN-γ do kompletnej pożywki DMEM uzupełnionej 10% (v/v) FBS10,11.
- Odrzucić supernatant hodowli z makrofagów inkubowanych wcześniej (etap 5.5) i ostrożnie umyć monowarstwy w naczyniu 2x z co najmniej 1 ml PBS.
- Następnie dodaj 2 ml pożywki polaryzacyjnej M1 do naczynia do obrazowania i pozwól komórkom RAW 264.7 indukować fenotyp makrofagów M1 przez inkubację w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
UWAGA: Komórki makrofagów M1 mogą potrzebować 2-3 godzin inkubacji, aby osiągnąć pełną polaryzację. Należy przeprowadzić wstępne eksperymenty, aby zapewnić odpowiedni okres inkubacji, aby umożliwić pełną polaryzację makrofagów.
7. Wideomikroskopia fagocytozy z żywymi komórkami
UWAGA: Podczas wykonywania obrazowania żywych komórek należy wziąć pod uwagę wiele czynników, aby uzyskać możliwe do wyprodukowania wideo, w tym optymalizację ekspozycji obrazu, pomiar czasu i automatyczną korekcję ostrości.
- Przed eksperymentem należy ustawić inkubator do hodowli komórkowych, włączając termostat na 37 °C i dostarczając 5% CO2,
UWAGA: Konfiguracja mikroskopu wymaga odwróconego stolika, inkubatora ze stopniem górnym, kontroli wilgotności (95%) i systemu inkubacji gazu. Ta konfiguracja ma kluczowe znaczenie dla utrzymania komórek w celu długoterminowej oceny pod mikroskopią wideo na żywych komórkach. - Włącz mikroskop, w tym stolik piezoelektryczny, i załaduj oprogramowanie do obrazowania mikroskopu.
- Umieść zasiane komórki kokultury w naczyniu do obrazowania ze szklanym dnem o średnicy 35 mm na środku stolika i delikatnie przykręć górną komorę. Użyj joysticka, aby zmotoryzować stolik, wybierając pozycję, która ma zostać zobrazowana.
- Aby wyświetlić próbkę, wybierz filtr kontrastu fazowego na wieżyczce. Po wstępnym obejrzeniu próbki zlokalizuj odpowiednie pola i ustaw ostrość próbki.
UWAGA: Oprogramowanie do obrazowania umożliwia korzystanie z w pełni zautomatyzowanego wyboru obiektywu, systemu Perfect Focus, serii poklatkowych, wielokanałowej akwizycji obrazu i wielopunktowej akwizycji obrazu. - Aby skonfigurować fluorescencję wielokanałową do znakowania CFSE i różnicowej akwizycji kontrastu interferencyjnego, otwórz okno dialogowe akwizycji oprogramowania do obrazowania i zaznacz pole wyboru zakładki [Lambda] (Rysunek 2).
UWAGA: W przypadku 13-godzinnego obrazowania poklatkowego należy użyć kanału kontrastu fazowego. - Wybierz zakładkę [Lambda] | [Konfiguracja optyczna] i wybierz [10X DIC] dla kontrastu zakłóceń różnicowych i [GFP-R] dla zielonego filtra fluorescencji. W ramach [Lambda] | [Ostrość], zaznacz pole wyboru [10X DIC], aby ustawić je jako odniesienie ostrości.
- Otwórz okno dialogowe pobierania oprogramowania do przetwarzania obrazu, kliknij przycisk [Czas XYZ ...] i wybierz zakładkę [XY].
- Przejdź do punktu akwizycji obrazu za pomocą joysticka na zmotoryzowanym stoliku podczas sprawdzania obrazu na żywo lub wybierz inną pozycję za pomocą okularów. Następnie kliknij pole wyboru pod kolumną [Nazwa punktu], aby ustawić każdy punkt w każdej lokalizacji do przechwytywania obrazu (patrz Rysunek 3).
UWAGA: Zautomatyzowany stolik umożliwia wielopunktowe pozyskiwanie obrazów o różnych współrzędnych XY w celu przechwycenia wielu pól. - Dostosuj ostrość dla każdej próbki wyświetlanej na ekranie. Użyj elementów sterujących Korekcja automatycznego ustawiania ostrości.
- Użyj oprogramowania, aby skonfigurować przechwytywanie zdjęć poklatkowych. W oknie dialogowym akwizycji oprogramowania do obrazowania sprawdź zakładkę [Czas] (patrz Rysunek 4).
- Określ [Interwał] (opóźnienie między początkiem jednego punktu czasowego a innym punktem czasowym) i [Czas trwania] (całkowity czas trwania eksperymentu). Jednostki czasu różnią się i można je wybrać w milisekundach (ms), sekundach (s), minutach (m) lub godzinach (h) z menu rozwijanego.
UWAGA: Długość okresu obrazowania dla obrazowania poklatkowego fluorescencji i wielokanałowej akwizycji poklatkowej DIC może się różnić w zależności od barwnika fluorescencyjnego użytego w tym teście. Fotowybielanie może wystąpić, jeśli znakowane komórki są wystawione na działanie promieni słonecznych zbyt długo. - Zaznacz pole wyboru [Zapisz do pliku], aby zapisać pobrane obrazy. Na karcie [Harmonogram] kliknij przycisk [Uruchom teraz], aby pobrać obrazy wielopunktowych szeregów czasowych (patrz Rysunek 5).
UWAGA: W oprogramowaniu do obrazowania obrazy są zapisywane w formacie pliku nd2. Każdy film poklatkowy można później indywidualnie zapisać w formacie pliku MP4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obrazy dwuwymiarowe (2D) w trybie poklatkowym z modelu kokultury linii komórkowych raka piersi myszy 4T1 pokazują pochłanianie komórek 4T1 przez makrofagi M1 w ciągu 13 h. Ważne jest zapewnienie pełnej polaryzacji makrofagów M1 poprzez wykonanie immunostainingu. Wyniki (Rycina 1) wskazują, że stężenie 100 ng/mL lipopolisacharydów (LPS) oraz 20 ng/mL IFN-γ spolaryzowało makrofagi RAW 264.7 do stanu M1. Oznakowanie komórek docelowych barwnikiem fluorescencyjnym i pozostawienie komórek efektoro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany protokół wymaga dwóch kroków: 1) kohodowli komórek raka sutka myszy 4T1 i makrofagów spolaryzowanych M1 oraz 2) oceny aktywności fagocytarnej makrofagów za pomocą mikroskopii poklatkowej. Kokultura żywych komórek jest szeroko stosowana w testach fagocytozy i migracji. Model kohodowli żywych komórek jest prostą, adaptowalną procedurą in vitro (ryc. 2), która wykorzystuje barwnik fluorescencyjny, CFSE, który jest używany do znakowania komórek docelowych 4T1. Służy to do prawidłowego śl...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana finansowo przez Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Serdecznie dziękujemy Instytutowi Agro-Biotechnologii, laboratoriom Malezji (ABI) oraz zakładowi obrazowania mikroskopowego. Specjalne podziękowania dla Mohda Daniela Hazima za pomoc w montażu i nagraniu eksperymentalnego wideo do tego utworu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało anty-INOS sprzężone z FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µ g w 1 ml |
| estru boksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/hyklon o wysokiej zawartości glukozy | SH30003.04 | 670.0 g | |
| Surowica bydlęca | płodu Tico Europe | FBSEU500 | 500 ml |
| Lipopolisacharydy | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mysi rekombinowany interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 &mikro; g |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny | Cellgro | 30-003-CI | 100 ml |
| sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 sztuk |
| Trypsyna EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 ml |
| 1000 &mikro; L końcówki do pipet | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 końcówek/opakowanie |
| Pipeta serologiczna 2 ml | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µ L końcówki do pipet | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20 000 tps/opakowanie |
| 25 cm2 kolba do hodowli komórkowych | Corning | CLS430639 | Hodowla tkankowa poddana działaniu |
| Wirówka stołowa | Dynamica | FA15C | Model: Prędkość 14R |
| Bezpieczny biologicznie dygestoria | Nuaire | NU-565-400 | Model: Strona główna/ LabGard® ES TE NU-565 Klasa II, typ B2 Bezpieczeństwo biologiczne |
| Mieszalnik CO2/powietrza | Chamlide (przyrząd do żywych komórek) | FC-R-20 | FC-5 (mieszalnik CO2/powietrza) z przepływomierzem |
| Skrobak do komórek | NEST 710001 | 220 mm | |
| Inkubator komórek CO2 | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Mikroskop konfokalny | Nikon Instruments Inc. | Nie dotyczy | Nikon Ti-Eclipse |
| Szklana miska dolna | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements oprogramowanie | Nikon Instruments Inc. | Dostępny do pobrania | |
| Kontroler do pipet | CappAid | PA-100 | Kontroler pipet CappController, 0,1-100 ml |
| Termostat | Shinko | Wycofane | JCS-33A 48 x 48 x 96,5 mm |
Bibliografia
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585(2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152(2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
