Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60282

⸱

2 czerwca 2020

 , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Parc Científic de Barcelona, 2The Francis Crick Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Streszczenie

W organizmach wielokomórkowych dojrzałe tkanki i organy wykazują wysoki stopień uporządkowania w przestrzennym układzie swoich komórek składowych. Niezwykłym przykładem jest nabłonek czuciowy, w którym komórki o tej samej lub odrębnej tożsamości są łączone ze sobą poprzez adhezję komórka-komórka, wykazując wysoce zorganizowane wzorce płaskie. Komórki są wyrównywane względem siebie w tym samym kierunku i wykazują równoważną polaryzację na duże odległości. Ta organizacja dojrzałego nabłonka ustala się w trakcie morfogenezy. Aby zrozumieć, w jaki sposób uzyskuje się płaskie ułożenie dojrzałego nabłonka, kluczowe jest śledzenie orientacji komórek i dynamiki wzrostu z dużą wiernością czasoprzestrzenną podczas rozwoju in vivo. Solidne narzędzia analityczne są również niezbędne do identyfikacji i charakteryzowania przemian z lokalnego na globalny. Poczwarka Drosophila jest idealnym systemem do oceny zorientowanych zmian kształtu komórek leżących u podstaw morfogenezy nabłonka. Nabłonek rozwijający się poczwarki stanowi zewnętrzną powierzchnię nieruchomego ciała, umożliwiając długotrwałe obrazowanie nienaruszonych zwierząt. Opisany tutaj protokół ma na celu obrazowanie i analizowanie zachowań komórek zarówno na poziomie globalnym, jak i lokalnym w naskórku brzusznym poczwarki w miarę jego wzrostu. Opisaną metodologię można łatwo dostosować do obrazowania zachowań komórek na innych etapach rozwoju, tkanek, struktur subkomórkowych lub organizmów modelowych.

Wprowadzenie

Aby spełnić swoje role, tkanki nabłonkowe w pełni polegają na organizacji przestrzennej swoich komponentów komórkowych. W większości nabłonków komórki są nie tylko upakowane względem siebie, tworząc precyzyjną warstwę kostki brukowej, ale także orientują się względem osi ciała.

Funkcjonalne znaczenie precyzyjnej organizacji tkanek jest oczywiste w nabłonkach czuciowych, takich jak ucho wewnętrzne kręgowców i siatkówka. W pierwszym przypadku włosy i komórki nośne ustawiają się w określonym kierunku osiowym, aby skutecznie wykrywać bodźce mechaniczne, takie jak dźwięk i ruch1,2. Podobnie, organizacja przestrzenna komórek fotoreceptorów jest niezbędna do osiągnięcia optymalnych właściwości optycznych przez siatkówkę3. Przestrzenna kontrola położenia i orientacji komórki ma zatem szczególne znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania fizjologicznego.

Drosophila to holometaboliczny owad, który przechodzi całkowitą transformację struktur swojego ciała larwalnego poprzez metamorfozę, dając początek swoim dorosłym tkankom. Poczwarka Drosophila jest doskonałym modelem do nieinwazyjnego obrazowania na żywo różnych dynamicznych zdarzeń, w tym rozwojowej migracji komórek4, dynamiki podziału i wzrostu komórek5, skurcz mięśni6, śmierć komórki7, naprawa ran8 i orientacja komórki9. U dorosłej Drosophila nabłonek zewnętrzny wykazuje wysoki stopień porządku. Można to łatwo zaobserwować na układach trichomów (tj. wypukłości komórek pochodzących z pojedynczych komórek nabłonkowych) i włosiu czuciowym na całej powierzchni ciała muchy10. Rzeczywiście, trichomy są ustawione w równoległych rzędach, kierując przepływem powietrza11. Morfogeneza dorosłego nabłonka i uporządkowane ułożenie poszczególnych komórek rozpoczyna się podczas embriogenezy i osiąga kulminację w stadiach poczwarki. Podczas gdy w zarodkach podziały komórek, interkalacje i zmiany kształtu zmniejszają porządek tkanek12,13, jest to odwracane na późniejszych etapach rozwoju, zwłaszcza w stadiach poczwarki, gdy mucha zbliża się do dojrzałości9.

Nieruchoma poczwarka Drosophila stanowi idealny system do oceny zmian kształtu i orientacji komórek. Szczególną zaletą jest naskórek poczwarkowy brzuszny. Podczas gdy prekursory dorosłej głowy, klatki piersiowej, genitaliów i przydatków rosną i stają się wzorzyste od stadiów larwalnych, histoblasty, które są zintegrowane z naskórkiem larwy, zaczynają rosnąć i różnicować się dopiero w momencie poczwarkowania14. Ta funkcja umożliwia śledzenie wszystkich zdarzeń czasoprzestrzennych związanych z ustalaniem porządku tkanek w całości9.

Histoblasty są określane podczas rozwoju embrionalnego w pozycjach przeciwległych w każdym przypuszczalnym segmencie brzucha. Grzbietowy naskórek brzuszny dorosłego osobnika wywodzi się z grzbietowo-bocznie położonych gniazd histoblastowych obecnych w przedziale przednim i tylnym15,16. W miarę rozszerzania się histoblastów, zastępując larwalne komórki nabłonkowe (LEC), przeciwległe gniazda łączą się na grzbietowej linii środkowej, tworząc zlewający się arkusz17,18,19,20.

Ta praca opisuje 1) metodologię sekcji, montażu i długoterminowego obrazowania na żywo poczwarek Drosophila oraz 2) metody analityczne do badania dynamiki orientacji i wzrostu komórek w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej. Szczegółowy protokół znajduje się tutaj, obejmujący wszystkie wymagane etapy od wstępnego przygotowania poczwarki (tj. oceny stopnia zaawansowania i obrazowania) do ekstrakcji i kwantyfikacji cech kierunkowości i orientacji. Opisujemy również, jak wywnioskować lokalne właściwości tkanek na podstawie analizy klonów komórek. Wszystkie opisane kroki są minimalnie inwazyjne i pozwalają na długoterminowe analizy na żywo. Opisane tutaj metody można łatwo zaadaptować i zastosować do innych etapów rozwoju, tkanek lub organizmów modelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ten protokół jest podzielony na pięć kroków: (1) inscenizacja poczwarek, (2) przygotowanie poczwarek do obrazowania, (3) obrazowanie na żywo rosnącego nabłonka brzusznego, (4) generowanie mozaik genetycznych, (5) przetwarzanie i analiza danych (w tym sekcje opisujące, jak analizować dynamikę orientacji komórek na podstawie konturów połączeń komórkowych i dynamikę wzrostu z klonów komórek).

1. Ocena losowania poczwarek Drosophila przed obrazowaniem

  1. Hodowla muszek o odpowiednim genotypie na pożywce wzorcowej w fiolkach z tworzywa sztucznego w temperaturze 25 °C przez 5 dni (±12 h) po złożeniu jaj (AEL).
    UWAGA: Metamorfoza rozpoczyna się w okresie uwięzienia larw w trzecim stadium rozwojowym w przypadku poczwarki po 120 godzinach AEL do 0 godzin po utworzeniu poczwarki (APF). To przejście jest łatwe do zidentyfikowania, ponieważ larwy przestają żerować i poruszać się, a obszar wieczkowy tworzy się (Rysunek 1A) po 0-12 godzinach APF. Poczwarka jest początkowo miękka i biała, ale stopniowo twardnieje i opala się.
  2. Przenieść białe poczwarki (0 h APF) do świeżej plastikowej fiolki za pomocą zwilżonego pędzla. Zwierzęta mogą być trzymane w różnych temperaturach w zależności od zaprojektowanego eksperymentu do pożądanego wieku.
    UWAGA: Formowanie się poczwarki (tj. przepoczwarzenie) następuje po 12 godzinach APF, kiedy głowa i przydatki dorosłej muchy są całkowicie odcięte (Ryc. 1A). W tym czasie koperta poczwarki jest całkowicie oddzielona od poczwarki, co pozwala na jej całkowite usunięcie (Rysunek 1A).

2. Przygotowanie poczwarek do obrazowania na żywo

UWAGA: Po inscenizacji, poczwarki są preparowane i montowane zgodnie z opisem poniżej (zobacz też Rysunek 1).

  1. Usunąć poczwarki w stadium ze ścianki fiolki za pomocą kleszczy.
  2. Przyklej brzuszną stronę każdej poczwarki na szkiełku pokrytym dwustronną taśmą klejącą. Delikatnie postukaj w przetchlinki głowy (tj. obszar wieczkowy) i grzbietową powierzchnię poczwarki końcami kleszczy, aby upewnić się, że etui poczwarki przylega do taśmy (Rysunek 1A,B).
    UWAGA: Powierzchnia grzbietowa powinna być skierowana do góry, aby ułatwić rozwarstwienie obudowy i odzyskanie poczwarki.
  3. Rozpocznij sekcję pod mikroskopem stereoskopowym, delikatnie usuwając wieczko z poczwarki za pomocą kleszczy (Rysunek 1C).
  4. Włóż jedną końcówkę kleszczy pod płytkim kątem między obudową poczwarki a powierzchnią poczwarki przez otwór wieczka. Rozerwij kopertę od głowy do ogona na boki jednym lub kilkoma ruchami, unikając uszczypnięcia poczwarki (Rysunek 1D). Złóż pękniętą obudowę poczwarki na boczne boki, przechodząc do tylnego końca (Rysunek 1E).
    UWAGA: Etui poczwarki jest dość sztywne i łatwo pęka. W przypadku dużej wilgotności lub w szczególności tła genotypowego, etui poczwarki staje się bardziej miękkie, a rozdarcie jest trudniejsze. W takich przypadkach pękaniu poczwarki można pomóc, nakłuwając jej wolne krawędzie obiema końcówkami kleszczy.
  5. Wyjmij poczwarkę z otwartego etui na poczwarkę, ostrożnie wkładając kleszcze pod zwierzę i delikatnie pociągając do góry (Rysunek 1F). Poczwarka przyklei się do czubka kleszczy (Rysunek 1G−H).
  6. Przenieś poczwarkę za pomocą kleszczy do naczynia ze szklanym dnem i umieść ją na małej kropli przepuszczalnego dla gazu oleju halowęglowego (Rysunek 1I). Trzymaj poczwarkę delikatnie za stronę brzuszną, aby uniknąć ewentualnego uszkodzenia tkanek.
    UWAGA: Kropla oleju halowęglowego musi być mała, o średnicy w przybliżeniu mniejszej niż połowa długości poczwarki. Taka ilość jest wystarczająca, aby przylgnąć poczwarkę do szkła za pomocą kapilarności i skorygować optykę dla obiektywów zanurzeniowych w olejku.
  7. Zwiń kawałek mokrej bibuły na krawędziach naczynia, aby utrzymać wilgotność. Przykryj naczynie, aby uniknąć odwodnienia poczwarek podczas obrazowania.
    UWAGA: Do obrazowania można wykorzystać zarówno poczwarki żeńskie, jak i męskie. Zalecamy wykorzystanie trzeciego segmentu brzusznego (AIII) jako referencyjnego metameru brzusznego, ponieważ jest on prawie identyczny u obu płci pod względem rozmiaru, kształtu i wzoru.

3. Obrazowanie na żywo rosnącego nabłonka brzusznego

UWAGA: Odwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny wyposażony w obiektyw 40x/1,3 NA został użyty do zobrazowania poczwarek w różnych stadiach rozwoju.

  1. Ustawić poczwarkę nad kroplą oleju na naczyniu ze szklanym dnem zgodnie z domeną i procesem, który ma być oceniany (np. grzbietowo-bocznie w celu długoterminowego obrazowania na żywo wczesnej ekspansji gniazd grzbietowych lub grzbietowo, aby zobrazować ich późną ekspansję i przebudowę tkanek). Zobacz Rysunek 1J,K i Rysunek 4.
  2. Przenieś naczynie ze szklanym dnem zawierające zamontowane poczwarki do stolika mikroskopowego i skup się na powierzchni brzucha za pomocą światła przechodzącego.
    UWAGA: Nawet jeśli ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem obrazowania w mikroskopach odwróconych, możliwe jest również wykonanie obrazowania pod mikroskopem pionowym. W takim przypadku próbkę umieszcza się na stoliku mikroskopu szklaną powierzchnią dna skierowaną do góry. Olej halowęglowy utrzymuje każdą poczwarkę na łąkotce.
  3. Ustaw parametry akwizycji: 1) liczba plastrów Z mieści się zwykle w przedziale 20−40, aby umożliwić odpowiednią dwuwymiarową (2D) rekonstrukcję naskórka brzusznego; 2) wielkość kroku między każdym plasterkiem (np. 1 mikron); 3) interwał czasowy dla zapisu (interwał 5-minutowy jest odpowiedni do analiz dynamiki orientacji komórek o wysokiej wierności); i 4) rozdzielczość klatki (np. 1024 x 1024).
  4. Włącz odpowiednie lasery (tj. 488 nm i 561 nm, aby odpowiednio wizualizować fluorofory GFP i RFP) i dostosuj ustawienia mocy lasera i wzmocnienia/przesunięcia, aby uwidocznić zaznaczone komórki. Używaj najniższej możliwej mocy lasera (w zakresie 5%-20%), aby zminimalizować fotowybielanie i fototoksyczność.
  5. Ręcznie ustaw pozycję i odpowiednie limity stosu Z dla wielu poczwarek za pomocą dołączonego zmotoryzowanego stolika i oprogramowania do akwizycji wielopozycyjnej mikroskopu.

4. Generowanie mozaik genetycznych w celu śledzenia zachowań klonów komórkowych

UWAGA: Stosujemy rekombinację mitotyczną do indukowania genetycznych mozaik w nabłonku brzusznym poprzez rekombinację specyficzną dla miejsca (system FLP/FRT21,22) (Rysunek 2).

  1. Krzyżowo dziewicze samice będące nosicielami indukowanego szokiem cieplnym transgenu Flippazy (hs-FLP), miejsca docelowego rozpoznawania FLP (FRT) w określonej lokalizacji genomowej (np. Miejsce FRT w pozycji 40A w ramieniu L chromosomu 2) i rozpoznawalnego markera komórkowego (np. Ubi-RFP.nls lub Ubi-GFP.nls) dystalnego do miejsca FRT, do zmutowanych samców posiadających miejsce FRT w równoważnej lokalizacji genomowej (Rysunek 2A−C).
    UWAGA: Autonomiczne i nieautonomiczne skutki w obrębie klonów lub na zewnątrz dla utraty funkcji genów mogą być badane przy użyciu specyficznych alleli recesywnych dystalnych do miejsca FRT.
  2. Wygenerowanie klonów somatycznych FLP / FRT w histoblastach poprzez szok cieplny w trzecim stadium larwalnym potomstwa krzyżówki. Odbywa się to poprzez zanurzenie plastikowych fiolek zawierających zwierzęta w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 45 minut do 1 godziny w stadium larw wędrownych (LIII).
    UWAGA: Wrażliwym okresem dla rekombinacji mitotycznej jest faza G2 cyklu komórkowego. Histoblasty są zatrzymywane w G2 podczas całego rozwoju larw.
  3. Oceniaj bliźniacze klony pod kątem braku (tj. komórek zmutowanych) lub zwiększonych (tj. komórek bliźniaczych typu dzikiego) poziomów markera białka fluorescencyjnego od 16 godzin APF wzwyż (Rysunek 2D).
    UWAGA: Średnio 45 minut do 1 godziny w temperaturze 37 °C daje tylko około 2-3 bliźniacze klony na obszar zainteresowania (np. półsegment brzuszny). Poczwarki wykazujące również duże zagęszczenie klonów (np. więcej niż cztery bliźniacze klony na półsegment) powinny zostać odrzucone z dalszych analiz ilościowych.
  4. Po zidentyfikowaniu klonu należy wyobrazić sobie żywe poczwarki w pożądanym stadium i przez żądany okres czasu, jak opisano w poprzedniej sekcji.

5. Przetwarzanie i analiza danych

UWAGA: Dane są przetwarzane za pomocą ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

  1. Rozróżnianie dynamiki orientacji komórki od konturów połączeń komórkowych.
    1. Rzutuj warstwy stosu Z uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej w 2D przy użyciu funkcji projekcji o maksymalnej intensywności (MIP) w ImageJ.
      UWAGA: Liczba plasterków w stosie powinna być ograniczona do minimum, aby uniknąć nieostrego hałasu generowanego przez makrofagi patrolujące pod naskórkiem.
    2. Ustaw płaski układ współrzędnych identyfikujący wiarygodne punkty orientacyjne tkanek (np. granice przedziałów A/P) do analizy każdego zestawu danych (Rysunek 3A).
      UWAGA: Zastosowanie tych samych odniesień planarnych dla każdego zestawu danych pozwoli na porównanie wielu pomiarów.
    3. Użyj wtyczki OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) klasy ImageJ23,24 na lokalnych krawędziach komórek, aby uzyskać jakościowe i ilościowe wartości orientacji. Wtyczka renderuje oznaczone kolorami nakładki na obrazach wejściowych w oparciu o orientacje lokalne i zapewnia wartości liczbowe, gdy jest używana w trybie ilościowym (Rysunek 3B−B'' i Rysunek C−C'''').
      UWAGA: Wtyczka OrientationJ jest oparta na tensorach struktury, macierzy 2 x 2 wartości własnych pochodzących z pochodnych gradientu i kierunku (szczegółowy opis znajduje się w references23,24).
    4. Użyj opcji OrientationJ Distribution, aby oznaczyć kolorami orientacje krawędzi komórek względem ustawionego płaskiego układu współrzędnych (tj. map orientacji krawędzi komórki) (Rysunek 3B). Opcja Dystrybucja znajduje się w menu wtyczki w ImageJ. Ustawienia, które należy zastosować, to: sigma okna Gaussa = 1 piksel; Splajn sześcienny = Nachylenie; minimalna spójność = 20%; Minimalna energia = 1%. Orientacje krawędzi komórek są wyświetlane jako obraz oznaczony kolorami z wykorzystaniem opcji Color Survey wtyczki (Hue = orientacja; Nasycenie = spójność; i Jasność = obraz wejściowy).
      UWAGA: Obszary, które zawierają fluorescencję tła, nie dostarczają żadnych informacji kierunkowych i muszą być ręcznie wykluczone z analizy. Ustawienia wysokiego progu zmniejszają liczbę pikseli uwzględnianych w przetwarzanych obrazach.
    5. Użyj opcji OrientationJ Measure, aby określić ilościowo orientacje komórkowe i kierunkowe wyrównanie komórka-komórka (tj. koherencja) (Rysunek 3C). Opcja Zmierz znajduje się w menu wtyczki w ImageJ. Wygeneruj małe, przylegające, nienakładające się obszary zainteresowania (ROI) o jednolitej wadze (64 x 64 piksele, około 20 μm x 20 μm) w obszarze zajmowanym przez histoblasty (Rysunek 3C).
    6. Oblicz dominującą orientację lokalną (tj. uśrednioną orientację między sąsiednimi komórkami - uśrednioną mapę orientacji krawędzi komórek) i spójność na podstawie ROI. Oprogramowanie oblicza dominującą orientację i lokalną spójność w ramach każdego ROI (Rysunek 3C).
      UWAGA: Największe i najmniejsze wartości własne tensora struktury oszacowane przez Orientację J są używane do obliczania koherencji jako stosunku między ich różnicą a ich sumą. Spójność jest ograniczona między wartościami 0−1. Wartość 1 oznacza pełną jednorodność wyrównania, a wartość 0 oznacza obszary izotropowe bez wyrównania.
    7. Analizuj statystycznie obliczone wartości orientacji i koherencji z wielu obrazów, korzystając z darmowych pakietów oprogramowania, takich jak PAST25. Dane osiowe, takie jak wartości orientacji (w stopniach), są odpowiednio opisane przez statystyki kierunkowe.
    8. Za pomocą oprogramowania można obliczyć średni kierunek i wariancję kołową dla każdego zestawu rozkładów orientacji. Istotność statystyczną różnicy między rozkładem orientacji między różnymi genotypami lub warunkami określa się za pomocą nieparametrycznego testu Mardia-Watsona-Wheelera (test W) dla rozkładów równych.
    9. Obliczyć istotność statystyczną różnicy w koherencji za pomocą nieparametrycznej próby Kołmogorowa-Smirnowa (próba K-S). Wyświetlaj dane graficznie zgodnie z potrzebami (wykresy biegunowe, wykresy słupkowe, wykresy pudełkowe itp.).
  2. Dynamika wzrostu z klonów komórkowych
    UWAGA: Poniższe kroki umożliwiają pobranie parametrów geometrycznych i kształtu komórek z obrazów 2D MIP zawierających interesujące klony. W przypadku porównań między wieloma klonami obrazy muszą być uzyskiwane z tymi samymi ustawieniami.
    1. Klonowane obszary można segmentować, rysując ich kontury za pomocą narzędzia Zaznaczanie odręczne ImageJ.
    2. Obliczanie parametrów geometrycznych i kształtu za pomocą narzędzia Ustaw pomiary w programie ImageJ w menu Analizuj. Uaktywnij opcje obszaru, obwodu, dopasowania elipsy i deskryptora kształtu.
      UWAGA: Umożliwi to pobranie różnych parametrów geometrycznych, w tym obszaru (sumy pikseli w obrębie klonu), obwodu (sumy pikseli obramowania klonu), współczynnika proporcji (AR, stosunek między osiami głównymi i pomocniczymi najlepiej dopasowanej elipsy Legendre'a wpisanej w obramowanie klonu) oraz kąta orientacji (tj. kąt głównej osi klonu względem granicy przednio-tylnej).
    3. Obliczanie stosunków niewymiarowych na podstawie tych pomiarów pozwala uzyskać parametry kształtu. Należą do nich okrągłość (4 x [obszar]/π x [oś główna]2), chropowatość (solidność - obszar/obszar wypukły) i okrągłość (4π x [obszar]/[obwód]2).
      UWAGA: Każdy z parametrów kształtu reprezentuje stopień odchylenia klonów od idealnych kształtów, takich jak okrąg lub ograniczona wypukła powłoka, i wszystkie są ograniczone między wartościami od 0 do 1. Wartości równe 1 wskazują maksymalną symetrię (tj. minimalną złożoność).
    4. Analizuj statystycznie parametry geometryczne i kształtowe między różnymi genotypami lub warunkami za pomocą programu Microsoft Excel i/lub PAST. Istotność statystyczną różnicy określa się za pomocą niesparowanego dwustronnego testu t-Studenta dla równej średniej lub nieparametrycznego testu K-S Kołmogorowa-Smirnowa dla równych rozkładów między warunkami. Dane mogą być wyświetlane graficznie zgodnie z potrzebami (np. wykresy słupkowe, wykresy pudełkowe itp.). Zobacz Rysunek 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany powyżej protokół obejmuje przygotowanie poczwarek Drosophila do długoterminowego obrazowania na żywo oraz procedury analizy orientacji komórek i dynamiki wzrostu nabłonka brzusznego. Zastosowanie tej metodologii pozwala na generowanie wysokorozdzielczych filmów z rozwijających się poczwarek przez okres do 48 h bez znaczącego fotoblaknięcia lub fototoksyczności. Zdjęcia przedstawiające nabłonek brzuszny (np. histoblasty i LEC) w różnych punktach czasowych oraz z poczwarek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Porządek dalekiego zasięgu jest podstawową cechą większości funkcjonalnych jednostek fizjologicznych. Podczas morfogenezy porządek osiąga się poprzez integrację złożonych instrukcji realizowanych z dużą precyzją czasową i przestrzenną. Wielorakie i wielopoziomowe ograniczenia są zintegrowane ze stereotypowymi układami tkankowymi.

Polaryzacja i kierunkowość mają kluczowe znaczenie dla uporządkowanego układu przestrzennego podczas rozwoju. Polaryzacja oznacza łamanie symetrii podczas rozwoju. Os...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Martín-Blanco za pomocne dyskusje. Dziękujemy również Nicowi Taponowi (The Crick Institute, Londyn, Wielka Brytania), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) i FlyBase (za adnotację genu Drosophila). Federica Mangione otrzymała stypendium przeddoktoranckie JAE-CSIC. Laboratorium Martín-Blanco zostało sfinansowane z Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P i BFU2017-82876-P) oraz z Fundación Ramón Areces.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprogramowanie do analizy-ImageJAnaliza danych
Drosophila>Atpa::GFP-Szczepy wykorzystywane do zbierania danych
Drosophilahsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls-Szczepy użyte do zbierania danych
Kleszcze Dumont 5FST11251-20o średnicy 1,5 mm do preparacji
Szklane płyty dolneMat TekP35G-0.170-14-CPoczwarki montażowe do zbierania danych
Olej halowęglowy 27Sigma-Aldrich9002-83-9poczwarki montażowe
Odwrócony mikroskop konfokalnyZeissLSM700Zbieranie danych
Mikroskop stereoskopowyLeicaDFC365FXWizualizacja poczwarek podczas sekcji

Bibliografia

  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
  3. Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
  4. Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
  5. Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
  6. Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
  7. Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
  8. Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
  9. Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
  10. Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
  11. Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
  12. Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
  13. Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
  14. Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
  15. Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
  16. Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
  17. Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
  18. Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
  19. Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
  20. Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
  21. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
  22. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
  23. Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
  24. Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
  25. Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
  26. Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
  27. Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
  28. Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
  29. Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
  30. Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
  31. Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
  32. Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, Suppl . 41-60 (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Epidermis poczwarki Drosophilaanaliza orientacji tkankidynamika wzrostu komórekobrazowanie konfokalnetechnika rekombinacji mitotycznejwtyczka Orientation Janaliza polarności planarnejśledzenie klonów histoblastówbadanie morfogenezy nabłonkaprotokół obrazowania na żywo
Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.