Method Article

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

DOI:

10.3791/60282

⸱

June 2nd, 2020

 , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Parc Científic de Barcelona, 2The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W organizmach wielokomórkowych dojrzałe tkanki i organy wykazują wysoki stopień uporządkowania w przestrzennym układzie swoich komórek składowych. Niezwykłym przykładem jest nabłonek czuciowy, w którym komórki o tej samej lub odrębnej tożsamości są łączone ze sobą poprzez adhezję komórka-komórka, wykazując wysoce zorganizowane wzorce płaskie. Komórki są wyrównywane względem siebie w tym samym kierunku i wykazują równoważną polaryzację na duże odległości. Ta organizacja dojrzałego nabłonka ustala się w trakcie morfogenezy. Aby zrozumieć, w jaki sposób uzyskuje się płaskie ułożenie dojrzałego nabłonka, kluczowe jest śledzenie orientacji komórek i dynamiki wzrostu z dużą wiernością czasoprzestrzenną podczas rozwoju in vivo. Solidne narzędzia analityczne są również niezbędne do identyfikacji i charakteryzowania przemian z lokalnego na globalny. Poczwarka Drosophila jest idealnym systemem do oceny zorientowanych zmian kształtu komórek leżących u podstaw morfogenezy nabłonka. Nabłonek rozwijający się poczwarki stanowi zewnętrzną powierzchnię nieruchomego ciała, umożliwiając długotrwałe obrazowanie nienaruszonych zwierząt. Opisany tutaj protokół ma na celu obrazowanie i analizowanie zachowań komórek zarówno na poziomie globalnym, jak i lokalnym w naskórku brzusznym poczwarki w miarę jego wzrostu. Opisaną metodologię można łatwo dostosować do obrazowania zachowań komórek na innych etapach rozwoju, tkanek, struktur subkomórkowych lub organizmów modelowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby spełnić swoje role, tkanki nabłonkowe w pełni polegają na organizacji przestrzennej swoich komponentów komórkowych. W większości nabłonków komórki są nie tylko upakowane względem siebie, tworząc precyzyjną warstwę kostki brukowej, ale także orientują się względem osi ciała.

Funkcjonalne znaczenie precyzyjnej organizacji tkanek jest oczywiste w nabłonkach czuciowych, takich jak ucho wewnętrzne kręgowców i siatkówka. W pierwszym przypadku włosy i komórki nośne ustawiają się w określonym kierunku osiowym, aby skutecznie wykrywać bodźce mechaniczne, takie jak dźwięk i ruch1,2. Podob....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół jest podzielony na pięć kroków: (1) inscenizacja poczwarek, (2) przygotowanie poczwarek do obrazowania, (3) obrazowanie na żywo rosnącego nabłonka brzusznego, (4) generowanie mozaik genetycznych, (5) przetwarzanie i analiza danych (w tym sekcje opisujące, jak analizować dynamikę orientacji komórek na podstawie konturów połączeń komórkowych i dynamikę wzrostu z klonów komórek).

1. Ocena losowania poczwarek Drosophila przed obrazowaniem

  1. Hodowla muszek o odpowiednim genotypie na pożywce wzorcowej w fiolkach z tworzywa sztucznego w temperaturze 25 °C przez 5 dni (±12 h) po złożeniu jaj (AEL).
    UWAG....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany powyżej obejmuje przygotowanie poczwarek Drosophila do długoterminowego obrazowania na żywo oraz procedury analizy orientacji komórek i dynamiki wzrostu naskórka brzusznego. Dzięki zastosowaniu tej metodologii możliwe jest generowanie filmów o wysokiej rozdzielczości rozwijających się poczwarek przez okres do 48 godzin bez znaczącego fotowybielania lub fototoksyczności. Migawki przedstawiające naskórek brzuszny (np. histoblasty i LEC) w różnych punktach czasowych.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porządek dalekiego zasięgu jest podstawową cechą większości funkcjonalnych jednostek fizjologicznych. Podczas morfogenezy porządek osiąga się poprzez integrację złożonych instrukcji realizowanych z dużą precyzją czasową i przestrzenną. Wielorakie i wielopoziomowe ograniczenia są zintegrowane ze stereotypowymi układami tkankowymi.

Polaryzacja i kierunkowość mają kluczowe znaczenie dla uporządkowanego układu przestrzennego podczas rozwoju. Polaryzacja oznacza łamanie symetrii podczas rozwoju. Os.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Martín-Blanco za pomocne dyskusje. Dziękujemy również Nicowi Taponowi (The Crick Institute, Londyn, Wielka Brytania), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) i FlyBase (za adnotację genu Drosophila). Federica Mangione otrzymała stypendium przeddoktoranckie JAE-CSIC. Laboratorium Martín-Blanco zostało sfinansowane z Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P i BFU2017-82876-P) oraz z Fundación Ramón Areces.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Oprogramowanie do analizy-ImageJAnaliza danych
Drosophila>Atpa::GFP-Szczepy wykorzystywane do zbierania danych
Drosophilahsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls-Szczepy użyte do zbierania danych
Kleszcze Dumont 5FST11251-20o średnicy 1,5 mm do preparacji
Szklane płyty dolneMat TekP35G-0.170-14-CPoczwarki montażowe do zbierania danych
Olej halowęglowy 27Sigma-Aldrich9002-83-9poczwarki montażowe
Odwrócony mikroskop konfokalnyZeissLSM700Zbieranie danych
Mikroskop stereoskopowyLeicaDFC365FXWizualizacja poczwarek podczas sekcji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Pupal EpidermisTissue Orientation AnalysisCell Growth DynamicsConfocal Microscopy ImagingMitotic Recombination TechniqueOrientation J PluginPlanar Polarity AnalysisHistoblast Clone TrackingEpithelial Morphogenesis StudyLive Imaging Protocol

Related Articles