Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Streszczenie

Candida albicans jest grzybowym składnikiem mikrobioty jelitowej u ludzi i wielu innych ssaków. Chociaż C. albicans nie powoduje objawów u większości skolonizowanych żywicieli, rezerwuar komensalny służy jako repozytorium chorób zakaźnych, a obecność wysokich mian grzybów w jelitach jest związana z nieswoistym zapaleniem jelit. W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji morfologii i lokalizacji komórek C. albicans w mysim modelu stabilnej kolonizacji przewodu pokarmowego. Kolonizację ustala się przy użyciu pojedynczej dawki C. albicans u zwierząt, które były leczone doustnymi antybiotykami. Segmenty tkanki jelitowej są utrwalone w sposób, który zachowuje architekturę zawartości światła (mikroorganizmy i śluz), a także błonę śluzową gospodarza. Wreszcie, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest przeprowadzana przy użyciu sond przeciwko rRNA grzyba w celu barwienia C. albicans i strzępek. Kluczową zaletą tego protokołu jest to, że pozwala on na jednoczesną obserwację morfologii komórek C. albicans i jej przestrzennego powiązania ze strukturami gospodarza podczas kolonizacji przewodu pokarmowego.

Wprowadzenie

Candida albicans jest grzybem komensalnym, a także oportunistycznym ludzkim patogenem. Drożdże te nie mają zdefiniowanej niszy środowiskowej, a zamiast tego rozmnażają się w przewodzie pokarmowym (GI), skórze i układzie moczowo-płciowym ludzi i innych ssaków¹. Podczas gdy wczesne badania nad C. albicans koncentrowały się przede wszystkim na jego potencjale wirulencji, kilka ostatnich doniesień sugeruje, że organizmy rozmnażające się komensalnie w jelitach mogą odgrywać ważną rolę w prawidłowym zdrowiu, w tym w rozwoju immunologicznym gospodarza^2,3,4. Aby ułatwić badania komensalizmu C. albicans w jelicie ssaków, opracowaliśmy mysi model stabilnej kolonizacji przewodu pokarmowego i metodę opartą na fluorescencji hybrydyzacji in situ (FISH) do wizualizacji komórek drożdży i strzępek grzybów w świetle jelita.

Z pewnymi wyjątkami⁵, myszy wyhodowane w laboratorium zazwyczaj wykazują odporność na kolonizację przewodu pokarmowego przez grzyby. Uważa się, że w oporności na kolonizację pośredniczą określone gatunki bakterii; Można jednak temu zaradzić, traktując zwierzęta antybiotykami^6,7 lub stosując chemicznie zdefiniowaną dietę, która przypuszczalnie zmienia skład gatunkowy bakterii8^,9. Podobnie, u ludzi, stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania wiąże się z przerostem i rozprzestrzenianiem się C. albicans¹⁰. Nasz mysi model kolonizacji wykorzystuje antybiotyki o szerokim spektrum działania do ustanowienia kolonizacji C. albicans u immunokompetentnych, konwencjonalnie hodowanych myszy. Penicylina i streptomycyna są podawane zwierzętom w wodzie pitnej przez tydzień przed zgłębnikiem z 10⁸ jednostkami tworzącymi kolonie (CFU) C. albicans. Tak długo, jak woda z antybiotykiem jest kontynuowana, C. albicans będzie się rozprzestrzeniać w przewodzie pokarmowym, osiągając miano kału 10^{6-10 8} CFU/g. Pomimo wysokiego poziomu kolonizacji grzybów, zwierzęta pozostają zdrowe i przybierają na wadze w takim samym tempie jak niezakażone grupy kontrolne. Model ten został z powodzeniem wykorzystany do badania przesiewowego i scharakteryzowania wielu czynników komensalizmu C. albicans^11,12.

Podobnie jak inni członkowie królestwa grzybów, C. albicans jest zdolny do ogromnej plastyczności morfologicznej¹³. W warunkach in vitro wykazano, że przechodzi między co najmniej sześcioma jednokomórkowymi typami komórek drożdży, a także wielokomórkowymi strzępkami i pseudostrzępkami. Przejście drożdży do strzępek jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych atrybutów wirulencji, a strzępki i pseudostrzępki dominują w większości modeli chorób ssaków, a także w zakażonych tkankach ludzkich. Aby określić lokalizację i morfologię komórek C. albicans w mysim przewodzie pokarmowym, opracowaliśmy technikę FISH do barwienia drożdży i strzępek w ustalonych skrawkach histologicznych. Sondy składają się z fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów DNA, które hybrydyzują z rybosomalnym RNA (rRNA) grzyba 23S, który jest rozprowadzany w cytoplazmie grzyba. Ponieważ tkanki gospodarza są utrwalone w sposób, który zachowuje trójwymiarową architekturę jelita, w tym błonę śluzową gospodarza, materiał trawienny, mikrobiotę bakteryjną i śluz w świetle jelita, technika ta umożliwia lokalizację komórek grzybów w odniesieniu do tych punktów orientacyjnych po zabarwieniu. Technika FISH wypada korzystnie w porównaniu z tradycyjnymi barwieniami histologicznymi grzybów, takimi jak Periodic Acid Schiff (PAS) lub Methenamino-Silver Gomoriego (GMS), a także dostępnymi na rynku przeciwciałami przeciwgrzybiczymi, ponieważ odczynniki te nie są specyficzne dla C. albicans. Co więcej, standardowe utrwalacze usuwają warstwę śluzu i zakłócają pozostałą zawartość lumenu jelitowego ^14,15.

W tym artykule podajemy szczegółowe instrukcje dotyczące ustalenia wysokiej klasy kolonizacji przewodu pokarmowego myszy przez C. albicans, preparacji przewodu pokarmowego zwierząt poddanych eutanazji, utrwalenia tkanek w sposób zachowujący architekturę świetlną, oraz wykrywania C. albicans w tkankach gospodarza za pomocą FISH. Oprócz dzikich i zmutowanych szczepów C. albicans, technika gaveage może być stosowana do dostarczania innych mikroorganizmów. Technika fiksacji byłaby przydatna w każdym badaniu, w którym pożądane jest zachowanie treści jelitowej. Procedura FISH może zostać zakończona w ciągu jednego dnia i może być wykorzystana do lokalizacji wielu gatunków grzybów za pomocą wielu, różnie znakowanych sond.

Protokół

Kroki opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCSF (IACUC).

1. Kolonizacja przewodu pokarmowego myszy z C. albicans za pomocą zgłębnika doustnego

1. Zapewnij schronienie dla samców lub samic myszy o wadze 18-21 g (8-10 tygodni), zgodnie z aprobatą lokalnego IACUC. Używaj autoklawizowanej żywności i wody od pierwszego dnia.
   nuta: Stosowanie wysterylizowanych klatek, ściółki, żywności i wody zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia bakteriami środowiskowymi opornymi na antybiotyki, które mogą potencjalnie wypierać C. albicans z jelit. Ponadto, w zależności od pytania doświadczalnego, należy rozważyć indywidualne trzymanie zwierząt, ponieważ myszy są koprofagiczne, a zawartość jelit będzie dzielona między zwierzęta trzymane w jednym pomieszczeniu.
2. Następnego dnia zastąp autoklawowaną wodę pitną wodą autoklawowaną zawierającą 5% glukozy, 1,500 U/ml penicyliny G i 2 mg/ml streptomycyny.
3. Dla wygody należy wcześniej przygotować 200 roztworów podstawowych antybiotyków (Tabela 1), przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w temperaturze -20 °C.
4. Utrzymuj zwierzęta na antybiotykach przez tydzień.
   1. W 3 i 6 dniu po rozpoczęciu antybiotykoterapii należy ocenić kał każdego zwierzęcia pod kątem zanieczyszczenia bakteriami tlenowymi opornymi na antybiotyki. Trzymając zwierzę jedną ręką, umieść niezakorkowaną rurkę do mikrofuge w pobliżu odbytu i zbierz co najmniej jedną granulkę kału.
   2. Zawiesić każdą osadkę kału w 1 ml sterylnej wody i ułożyć 100 μl na bulionie Luria (LB), dekstrozie peptonu z ekstraktu drożdżowego (YEPD) lub naparze z sercem mózgu (BHI) oraz płytkach z agarem z krwią. Inkubować płytki przez noc w standardowym inkubatorze (nie beztlenowym) w temperaturze 37 °C i ocenić rozwój bakterii.
      nuta: Płytki powinny wykazywać minimalny wzrost (0−20 kolonii). Jeśli >20 kolonii bakterii zostanie odzyskanych od zwierząt leczonych penicyliną i streptomycyną, jest mało prawdopodobne, że zostanie ustanowiona kolonizacja C. albicans na wysokim poziomie i eksperyment powinien zostać przerwany.
5. Trzy dni przed zgłębkiem należy przesiać C. albicans z zamrożonego wywaru glicerolu na płytki agarowe YEPD + 2% i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
6. Na dzień przed zgłębnikiem zaszczepić jedną kolonię każdego szczepu C. albicans, który ma być przetestowany, w 5 ml płynnego YEPD. Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc, wstrząsając.
7. Rano w dniu zgłębnika rozcieńczyć nasyconą kulturę C. albicans do gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) 0,1 na 100 ml YEPD podgrzanej do 30 °C. Wstrząsnąć w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min w temperaturze 30 °C przez okres od 4 godzin do 5 godzin, aż OD₆₀₀ osiągnie 1 (mid-log growth).
8. Przenieść każdą 100 ml kultury do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   UWAGA: C. albicans rozmnaża się stosunkowo wolno w temperaturze pokojowej. W przypadku adaptacji tego protokołu dla innego gatunku, może być konieczne trzymanie szczepionki na lodzie, aby zapobiec dalszemu wzrostowi.
9. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulowane komórki w 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej na 50 ml kultury i połączyć zduplikowane zawieszone osadki w pojedynczych stożkowych probówkach. Wirować przy 3 000 x g przez 5 min.
10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 20 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej. Krótko przemieszać i usunąć 20 μl do pomiaru OD₆₀₀. Rozcieńczyć w stosunku 1:50 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Odwirować pozostałe zawieszone komórki w stężeniu 3 000 x g przez 5 minut.
11. Odrzucić supernatant. W przypadku inokulum o wielkości 1 x 10⁸ jtk, ponownie zawiesić granulowane komórki do około 5 x 10⁸ jtk/ml w sterylnej normalnej soli fizjologicznej na podstawie szacowanego stężenia określonego na podstawie pomiaru OD₆₀₀.
    nuta: Zazwyczaj OD₆₀₀ wynoszący 1 odpowiada ~1 x 10⁷ komórek drożdży / ml. Wartość ta może się różnić w zależności od spektrofotometru i należy ją zweryfikować. Jeśli pożądana jest zmiana stężenia w przypadku zakażeń innym mikroorganizmem, należy zaplanować objętość inokulum wynoszącą ≤10 μl/g myszy, aby zminimalizować dyskomfort zwierzęcia.
12. Sprawdź stężenie inokulum, licząc rozcieńczenie 1:1000 za pomocą hemocytometru. Dostosuj objętość komórek do zgrubienia na podstawie stężenia określonego za pomocą hemocytometru.
13. Za pomocą igły do karmienia zwierząt (Rysunek 1A), zdalnik każdemu zwierzęciu z obliczoną objętością danego inokulum. Zobacz kroki 1.13.1−1.13.8, aby zapoznać się z procedurą zgłębnika.
    UWAGA: Szkolenie w zakresie gajnikowania powinno być odbyte od doświadczonego praktyka, a procedurę należy opanować z wyprzedzeniem. Udany zabieg u jednego zwierzęcia trwa zazwyczaj nie dłużej niż 1 minutę.
    1. Podłączyć autoklawowaną igłę do karmienia zwierząt do strzykawki o pojemności 1 ml i napełnić strzykawkę jedną objętością zgłębnika, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza, aby uniknąć niedokładnej dawki. Umieść na sterylnej powierzchni.
    2. Zabezpiecz zwierzę na zgłębnik. Przytrzymaj zwierzę u nasady ogona ręką dominującą i przesuń rękę niedominującą w górę grzbietu zwierzęcia do luźnej skóry tuż za uszami.
    3. Używając palca wskazującego i kciuka ręki niedominującej, mocno zbierz luźną skórę razem; to jest "kark". Podnieś zwierzę za kark i owiń mały palec tej samej (niedominującej) ręki wokół ogona, aby unieruchomić zwierzę przy dłoni. Delikatnie wyprostuj głowę zwierzęcia tak, aby jego głowa i tułów (a tym samym szyja i przełyk) znajdowały się w linii prostej.
       nuta: Próba zgłębnika, gdy ciało zwierzęcia jest zgięte lub skręcone, może spowodować komplikacje, takie jak perforacja przełyku i śmierć zwierzęcia.
    4. Podnieś strzykawkę dominującą ręką i trzymaj prostopadle do zwierzęcia, z zakrzywioną igłą skierowaną w dół (Rysunek 1B). Za pomocą kulki igły delikatnie zaczepić wewnętrzny kącik ust, delikatnie przesunąć igłę wzdłuż boku jamy ustnej do tylnej części gardła, a na koniec przesunąć igłę do środka.
       nuta: Wprowadzenie igły wzdłuż ścieżki bocznej pomaga uniknąć oporu ze strony zębów i języka zwierzęcia.
    5. Gdy kłębek igły znajdzie się z tyłu gardła, przechyl igłę do góry tak, aby była równoległa do linii ciała zwierzęcia (Rysunek 1C).
       nuta: W tym momencie zwierzę będzie wykazywać odruch wymiotny. Jest to dobry znak, który wskazuje, że igła jest prawidłowo umieszczona, a ruch krztuszący pomaga skierować igłę w dół przełyku. Jeśli nie ma odruchu wymiotnego, igła może znajdować się w tchawicy, a nie w przełyku. Delikatnie wyjąć igłę i powrócić do kroku 1.13.1.
    6. Pozwól zwierzęciu połknąć inokulum do momentu, gdy pozostanie tylko kilka milimetrów widocznych (Rysunek 1D). Płynnie przesuwać igłę.
       nuta: Jeśli igła nie się naprzód, unikaj używania siły, która może uszkodzić przełyk. Czasami przesunięcie się o ostatnie pół centymetra będzie wymagało od zwierzęcia bardzo dużego knebla. Jeśli wydaje się, że igła utknęła, powoli ją wyjmij i spróbuj ponownie od kroku 1.13.4.
    7. Sprawdzić, czy kulka igły znajduje się we właściwym miejscu (żołądek), delikatnie przesuwając tłok. Jeśli nie ma oporu, kontynuuj podawanie inokulum. Po podaniu inokulum powoli wycofaj igłę.
    8. Umieść zwierzę w klatce i kontynuuj monitorowanie zwierzęcia przez 5-10 minut pod kątem oznak utrudnionego oddychania lub niepokoju. Sprawdź, czy zwierzę wznawia normalną aktywność wkrótce po zgłębniku.
    9. Jeśli ten sam inokulum zostanie użyty z następnym zwierzęciem, wyczyść igłę chusteczką nasączoną alkoholem. Wróć do kroku 1.13.1. Jeśli zostanie użyte inne inokulum, użyj nowej igły i wróć do kroku 1.13.1.
       nuta: Ważne jest, aby sprawdzić zwierzęta następnego dnia po zgłębniku. Zwierzęta wykazujące oznaki niepokoju (np. zgarbiona postawa, trudności w oddychaniu) powinny zostać humanitarnie poddane eutanazji, ponieważ prawdopodobnie doznały pęknięcia przełyku, uszkodzenia płuc lub innego urazu wewnętrznego, z którego wyzdrowienie jest mało prawdopodobne.
14. Po pobraniu przez zwierzęta przez zwierzętom rozcieńczenia inokulu na płytce w celu sprawdzenia dawki.
    1. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia do 1:10⁵. Nałożyć jedną objętość zgłębnika w rozcieńczeniu 1:10⁵ na 100 mm płytkę z agarem dekstrozowym Sabouraud.
    2. Inkubować płytkę przez 2 dni w temperaturze 30 °C. Policz jtk, aby potwierdzić dawkę inokulum.

2. Przygotowanie tkanek przewodu pokarmowego do badania histologicznego

UWAGA: Ta sekcja protokołu jest zaadaptowana z Johansson and Hansson¹⁶.

1. Przygotuj 500 ml roztworu metakarny (60% metanolu, 30% chloroformu, 10% lodowatego kwasu octowego) w dużym plastikowym słoiku z zakrętką na każde 2 wycięte zwierzęta.
   ostrożność: Metanol i chloroform są szkodliwe w przypadku wdychania i należy nimi manipulować w okapie chemicznym. Lodowaty kwas octowy może być i należy się z nim obchodzić przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Metanol, chloroform i lodowaty kwas octowy należy wyrzucać jako odpady niebezpieczne.
2. W eksperymentalnym punkcie końcowym poddać zwierzęta eutanazji w sposób humanitarny, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez lokalną IACUC.
   nuta: U zwierząt leczonych antybiotykami kolonizacja C. albicans zwykle waha się od ~10⁶ CFUs/g w 5 dniu do ~5 x 10⁷ CFUs/g w 25 dniu.
3. Wysterylizuj narzędzia preparacyjne 10% wybielaczem i spłucz 70% etanolem.
4. Przymocuj każde zwierzę do powierzchni rozwarstwienia, stroną brzuszną skierowaną do góry. Użyj igieł 30 G, aby przymocować kończyny do powierzchni rozwarstwienia (Rysunek 2A). Spryskaj zwierzę 70% etanolem, aby oczyścić sierść i zminimalizować przyklejanie się do narzędzi.
5. Za pomocą kleszczy z końcami uszczypnij fragment skóry brzucha ręką niedominującą. Używając nożyczek z dominującą ręką, naciąć skórę i leżącą pod nią powięź w pobliżu podstawy miednicy. Przedłuż nacięcie w kształcie litery U wzdłuż każdej strony jamy otrzewnej i aż do klatki piersiowej. Usuń skórę z drogi.
6. Za pomocą ołówka wstępnie oznacz kasety histologiczne dla segmentów przewodu pokarmowego, które mają być oceniane. Na przykład dla każdego zwierzęcia oznacz oddzielne kasety jako "żołądek", "proksymalne jelito cienkie", "środkowe jelito cienkie", "dystalne jelito cienkie", "jelito ślepe" i "jelito grube". Umieść piankową podkładkę na spodzie każdej kasety (Rysunek 2A).
   UWAGA: Rysunek 2B przedstawia sugerowane sekcje do umieszczenia w kasetach.
7. Za pomocą kleszczy z końcami delikatnie wyciągnij jelito ślepe z jamy otrzewnej. Użyj nożyczek, aby przeciąć połączenia między jelitem ślepym a jelitem cienkim i grubym.
   nuta: Tkanka jelita ślepego jest bardzo delikatna i łatwo ulega pęknięciu. Zachowaj ostrożność podczas manipulacji.
8. Umieść całe jelito ślepe w kasecie histologicznej tak, aby było odkręcone i leżało płasko (Rysunek 2C). Umieść drugą podkładkę piankową na górze i zamknij kasetę. Umieść kasetę w zakręcanym słoiku zawierającym metakarnę.
9. Wyciąć odcinek jelita grubego, który zawiera 1−2 granulki kału, o długości mniejszej niż długość kasety.
10. Umieść wycinek tkanki w kasecie, utrzymując tkankę płasko i nieskręconą. Nałóż na drugą podkładkę piankową i zamknij kasetę. Umieść kasetę w metakarnie.
11. Dla każdego odcinka jelita cienkiego, z którego ma zostać pobrane próbki, należy wyciąć 1-2 cm segment, który zawiera pewną ilość materiału trawiennego.
12. Umieść segment w kasecie histologicznej, utrzymując tkankę płaską i nieskręconą. Nałóż na drugą podkładkę piankową i zamknij kasetę. Umieść kasetę w metakarnie.
13. W przypadku żołądka przeciąć połączenia z przełykiem i jelitem cienkim. Umieść w kasecie, trzymając chusteczkę płasko i nieskręconą. Nałóż na drugą podkładkę piankową i zamknij kasetę. Umieść kasetę w metakarnie.
14. Pozostawić kasety w roztworze metakarnu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny i krócej niż 2 tygodnie.
    nuta: Istnieje kilka punktów, w których stałe segmenty przewodu pokarmowego mogą zostać przekazane do komercyjnej usługi histologicznej. Tkanki te mogą być trudne do przekrojenia bez zakłócenia zawartości światła, a optymalne wyniki uzyska doświadczony technik. Jeśli serwis handlowy jest skłonny do wykonania płukania przed zatopieniem tkanek w parafinie, kasety mogą zostać wysłane na tym etapie wraz z instrukcją dla kroku 2.16.
15. Rozpocząć topienie wosku parafinowego w ilości wystarczającej do pokrycia wszystkich kaset z tkankami w dużej zlewce w piecu do hybrydyzacji nagrzanym do 70 °C.
16. Po utrwaleniu usuń podkładki piankowe i włóż każdy nienaruszony fragment tkanki z powrotem do kasety. Przemyć chusteczki następującymi roztworami w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem: dwa razy przez 35 minut w 100% metanolu, dwa razy przez 25 minut w 100% etanolu, dwa razy przez 20 minut w ksylenie.
    ostrożność: Ksylen jest łatwopalny, toksyczny i może powodować uszkodzenia w przypadku wdychania. Stosować w kapturze chemicznym z odpowiednią ochroną. Utylizacja ksylenu w ramach procedur odpadów niebezpiecznych.
17. Osusz kasety na ręczniku papierowym i umieść w stopionym wosku parafinowym na 2 godziny w temperaturze 70 °C w piecu do hybrydyzacji. Upewnij się, że kasety są wypełnione parafiną i nie pozostały żadne bąbelki.
    nuta: Ten etap pozwala woskowi naciekać segment przewodu pokarmowego i stabilizować tkankę i zawartość.
18. Wyjmij kasety z wosku, pozwól nadmiarowi wosku spłynąć i przechowuj w temperaturze pokojowej, aż zostaną osadzone w blokach wosku. Wosk zawierający śladowe ilości ksylenów należy wyrzucić jako odpad niebezpieczny.
    nuta: Noble Lab korzysta z komercyjnej usługi histologicznej do zatapiania i cięcia tkanek. Do standardowej wizualizacji drożdży i strzępek C. albicans stosuje się sekcje 4 μm. Aby ocenić łączność segmentów strzępek, które zwykle rozciągają się na wielu płaszczyznach, można użyć odcinków 8 μm. W zależności od zdolności sond FISH do wnikania w próbkę, możliwe jest użycie jeszcze grubszych odcinków.

3. Walidacja nowo zaprojektowanych sond

UWAGA: Następujący protokół walidacji sond C. albicans został zaadaptowany z Swidsinski et al.¹⁷.

1. Smuga C. albicans SC5314 i blisko spokrewnione gatunki porównawcze (np. Candida dubliniensis, Candida tropicalis) do YEPD + 2% płytek agarowych. Inkubować przez 1-2 dni w temperaturze 30 °C.
2. Zaszczepić 5 ml płynnej pożywki YEPD pojedynczą kolonią.
3. Odpipetować 1 ml zawieszonych komórek do probówki mikrowirówkowej i wirować przy stężeniu 3 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
4. Zawiesić osad w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
5. Odpipetować 5−10 μl zawieszonych komórek i narysować na szkiełku podstawowym. Rozprowadź na większy okrąg i pozostaw do wyschnięcia.
   nuta: Jeśli komórki nie przylegają, użyj szkiełek pokrytych poli-L-lizyną.
6. Zakreśl plamkę komórki pisakiem PAP i przykryj 50 μl 2,5% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
   ostrożność: PFA jest łatwopalny i może powodować problemy zdrowotne w przypadku wdychania lub kontaktu ze skórą. Przedmioty zanieczyszczone PFA należy wyrzucać jako odpady niebezpieczne.
7. Umyj 3x PBS. Wyciśnij płyn na ręcznik papierowy i zalej 100 μl PBS. Powtórz dwa razy. Wyrzuć końcowe pranie.
8. Przygotuj preparaty do przechowywania przez wiele dni. Jeśli wykonujesz FISH tego samego dnia, przejdź do kroku 3.9 bez kroków opisanych w tej sekcji.
   UWAGA: Zaleca się natychmiastowe wykonanie hybrydyzacji, ale jeśli masz mało czasu, wykonaj krok 3.8 przed przechowywaniem. Szkiełka można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C.
   1. Przykryj miejsce 60% etanolem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Wyrzuć roztwór.
   2. Przykryj miejsce 80% etanolem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Wyrzuć roztwór.
   3. Przykryj miejsce 100% etanolem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Wyrzuć roztwór. Przejdź do kroku 3.9.
9. Umieścić odkryte szkiełka w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 50 °C na 1 godzinę. Jeśli wykonano krok 3.8, przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C. Jeśli nie, przejdź do kroku 4.2, aby wykonać protokół hybrydyzacji.

4. Barwienie RYB w tkankach przewodu pokarmowego

1. Odwoskować skrawki histologiczne zatopione w parafinie.
   1. W piecu do hybrydyzacji podgrzej słoik Coplin wypełniony ksylenem do 60 °C.
   2. Włóż szkiełka do słoika wypełnionego ksylenem. Umieszczać w temperaturze 60 °C przez 10 min. Wyrzuć pranie z ksylenu. Trzymaj szkiełka w słoiku i odlej ksylen do pojemnika na odpady.
   3. Wlej świeży ksylen RT do słoika i inkubuj w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Wyrzuć drugie płukanie ksylenu.
   4. Napełnij słoik 100% etanolem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wyjmij szkiełka ze słoika i wysusz na powietrzu.
   5. Ustawić piec do hybrydyzacji na 50 °C dla czynności opisanych w rozdziale 4.2.
2. Zabarwić C. albicans sondą FISH.
   1. Przygotuj 1 ml świeżego roztworu hybrydyzacyjnego (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,1% dodecylosiarczanu sodu [SDS], 1% formamidu w wodzie wolnej od RNaz). Przykładowe obliczenia przedstawiono w tabeli 1.
   2. Wymieszaj razem 50 μl roztworu hybrydyzacyjnego z 1 μl sondy C. albicans (5' Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3'; 50 μg/ml w wodzie wolnej od RNaz), aby uzyskać końcową ilość sondy 0,5 μg na szkiełko.
      nuta: Wiele myszy wyhodowanych w laboratorium nie zawiera żadnych grzybów w swojej mikrobiocie. W takim przypadku możliwe jest podstawienie sondy pan-grzybiczej (5' Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3'), która rozpoznaje 23S rRNA większości gatunków grzybów, nie tylko C. albicans. Z doświadczenia autorów wynika, że sonda pangrzybicza daje jaśniejsze zabarwienie niż sonda specyficzna dla C. albicans.
   3. Chronić roztwór przed światłem i ogrzać go do temperatury 50 °C.
   4. Za pomocą pisaka PAP narysuj okrąg wokół przekroju tkanki z sekcji 4.1.
   5. Odpipetować 50 μl roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego sondę na utrwaloną tkankę i delikatnie rozprowadzić na wycinku tkanki za pomocą końcówki pipety. Pokryj płyn szkiełkiem nakrywkowym do hybrydyzacji, upewniając się, że zapobiegasz powstawaniu pęcherzyków.
   6. Uszczelnić szkiełka w wodoszczelnej komorze hybrydyzacyjnej i inkubować sekcje przez 3 godziny w temperaturze 50 °C w ciemności w piecu do hybrydyzacji.
   7. W międzyczasie przygotuj 50 ml roztworu do płukania FISH (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl w wodzie wolnej od RNaz). Przykładowe obliczenia przedstawiono w tabeli 1.
   8. Przesunąć roztwór myjący do 50 °C, aby się podgrzał.
   9. Po 3 godzinach dodaj roztwór myjący do słoika Coplin. Następnie ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe z szkiełka za pomocą kleszczy i umieść szkiełko w roztworze myjącym.
   10. Przykryj słoik folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 50 °C przez 20 minut.
   11. Podczas tej inkubacji przygotować roztwór do barwienia jąder mucyny (20 ng/ml 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu [DAPI], 1,6 μg/ml izotiocyjanianu fluoresceiny [FITC]-lektyny w PBS). Przykładowe obliczenia przedstawiono w tabeli 1. W przypadku żołądka i jelita grubego należy stosować aglutyninę 1 (UEA-1) FITC-Ulex europaeus. W przypadku jelita cienkiego i jelita ślepego należy stosować kombinację FITC-UEA-1 i aglutyniny z kiełków pszenicy FITC (WGA).
       nuta: Lektyny z różnych gatunków rozpoznają różne modyfikacje cukrów glikoprotein, takich jak mucyna. Zalecane tutaj kombinacje lektyn zostały określone empirycznie w celu optymalnego zabarwienia śluzu w różnych przedziałach przewodu pokarmowego.
   12. Umyj szkiełka, wylewając roztwór myjący FISH i ponownie napełniając słoik RT PBS. Natychmiast odlej PBS i ponownie napełnij PBS. Odlej PBS na łącznie 2 prania.
   13. Odetnij PBS delikatną tkanką wycieraczki i okrąż odcinek tkanki jelitowej pisakiem PAP. Umieścić szkiełka w nieprzezroczystym plastikowym pojemniku i dodać 50 μl roztworu do barwienia jąder mucyny do wycinka tkanki. Przykryj pojemnik folią aluminiową, aby chronić przed światłem. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut.
   14. Umieść szkiełka w słoiku Coplin i szybko umyj dwukrotnie w PBS przy RT.
   15. Stuknij nadmiar PBS na ręczniku papierowym, a następnie odchodź ostatnie krople PBS chusteczką.
   16. Umieść jedną kroplę podłoża montażowego na każdej sekcji i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym, zapobiegając powstawaniu pęcherzyków. Pozwól, aby podłoże montażowe rozprowadziło się pod całym szkiełkiem nakrywkowym. W celu natychmiastowego obrazowania zakotwicź szkiełko nakrywkowe w miejscu z lakierem do paznokci w rogach. W przypadku długotrwałego przechowywania uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.
   17. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Wyniki

Zgodnie z podanymi instrukcjami, wynikiem tej techniki będzie fluorescencyjne znakowanie jąder w nabłonku gospodarza, śluzu i C. albicans w wyciętych tkankach przewodu pokarmowego. Komórki Candida albicans typu dzikiego powinny pojawiać się jako okrągłe, jednokomórkowe komórki drożdży lub wysoce wydłużone, czasem rozgałęzione, wielokomórkowe strzępki (podziały komórka-komórka nie będą widoczne w strzępkach). Mutanty C. albicans mogą dodatkowo występować jako mniejsze, lekko wydłużone "szare" drożdże lub jako większe, lekko wydłużone drożdże "GUT" (przejście wywołane przez przewód pokarmowy) lub "nieprzezroczyste".

Rysunek 1 przedstawia igłę do karmienia używaną do podawania przez zgłębnik, jak również kluczowe pozycje igły podczas procedury podawania przez zgłębnik. Rysunek 2 przedstawia typowy układ używany do sekcji organów i wyglądu segmentów GI myszy.

Rysunek 3 przedstawia barwienie RYB różnych typów komórek C. albicans po rozmnażaniu in vitro i w modelu mysim. Rysunek 3A pokazuje obrazy fluorescencji i fazy stałych, przepuszczalnych, rozmnażanych in vitro strzępek. Tworzenie strzępek indukowano za pomocą płynu Lee's medium¹⁸ z 2% N-acetyloglukozaminą, pH 6,8 w temperaturze 37 °C. Rysunek 3B pokazuje obrazy fluorescencji i faz stałych, przepuszczalnych, rozmnażanych in vitro komórek drożdży. Rysunek 3C,D pokazuje odpowiednio stałe, permeabilizowane, rozmnażane in vitro komórki GUT i komórki nieprzezroczyste. Typy komórek GUT i nieprzezroczystych są morfologicznie nie do odróżnienia, z wyjątkiem sytuacji, gdy są wizualizowane za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Należy pamiętać, że barwienie RYB w komórkach rozmnażanych in vitro będzie nieoptymalne, jeśli komórki nie są dobrze przepuszczalne. Przykład słabego i rozproszonego barwienia jest pokazany w Rysunek 3C. Aby uzyskać najlepsze wyniki, warunki utrwalania i przepuszczalności komórek należy określić empirycznie dla każdego typu i gatunku komórek, które mają być badane. Na szczęście zalecany protokół wizualizacji C. albicans w pociętych tkankach zapewnia bardziej spójną przepuszczalność.

Rysunek 3E-G przedstawia C. albicans w jelicie grubym myszy, wybarwionym sondą specyficzną dla C. albicans (Rysunek 3E) lub sondą panfungową (Rysunek 3F,G). C. albicans wydaje się czerwony na tych zdjęciach, jądra komórek gospodarza są niebieskie, a warstwa śluzu jest zielona. W jelicie grubym występują zarówno okrągłe drożdże, jak i silnie wydłużone strzępki (białe groty strzał). Należy pamiętać, że barwienie jest jaśniejsze w przypadku sondy pangrzybiczej. Rysunek 3G przedstawia mutanta ume6 w tym samym pomieszczeniu, wybarwionego sondą panfungalną. Ume6 koduje czynnik transkrypcyjny, który jest niezbędny do tworzenia strzępek w warunkach in vitro¹⁹. Co ciekawe, fenotyp zablokowany przez drożdże wykazywany przez tego mutanta w warunkach in vitro nie jest rekapitulowany w jelitach, co sugeruje, że zbędny czynnik musi być aktywowany w host¹². Rysunek 4 przedstawia wygląd dzikiego typu C. albicans w różnych segmentach mysiego przewodu pokarmowego, w tym w regionach bezpośrednio przylegających do błony śluzowej gospodarza i bardziej centralnych obszarach światła jelita.

Rycina 1: Kluczowe pozycje igły do karmienia podczas zgłębnika. (A) Igła do karmienia. (B) Kulka igły do karmienia włożona z boku języka. (C) Igła do karmienia w pozycji pionowej z wprowadzeniem do przełyku. (D) Igła do karmienia wkłuwana w żołądek z widocznym na kilka milimetrów powyżej nosa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykładowy układ sekcji. (A) Podkładka i narzędzia do preparacji. (B) Wycięty przewód pokarmowy. Sekcje proksymalne (przełyk) do dystalnych (odbytu): I. Żołądek. II. Proksymalne jelito cienkie. III. Jelito cienkie przyśrodkowe. IV. Dystalne jelito cienkie. V. Jelito ślepe. VI. Jelito grube. Różowe przerywane obramowanie wskazuje tkanki do naprawienia. (C) Tkanki umieszczone w kasetach. Cyfry rzymskie są takie same jak w panelu B. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Reprezentatywne obrazy C. albicans barwionego RYBAMI. (A) RYBY strzępek C. albicans wyhodowane w płynnym pożywce Lee¹⁸ z 2% N-acetyloglukozaminą, pH 6,8. (B) RYBY z C. albicans okrągłe komórki drożdży wyhodowane na płytkach agarowych YEPD + 2%. (C) RYBY z komórek jelitowych C. albicans (ySN1045) wyhodowane na płytkach agarowych YEPD + 2%. (D) RYBY z nieprzezroczystych komórek C. albicans hodowanych na płytkach agarowych YEPD + 2%. (E) Dziki typ C. albicans (ySN250) w jelicie grubym, barwiony sondą specyficzną dla C. albicans. (F) Dziki typ C. albicans w jelicie grubym, zabarwiony sondą pangrzybiczą. (G) Mutant Ume6 (ySN1479) w jelicie grubym, barwiony sondą pangrzybiczą: czerwony to C. albicans, niebieski to jądra nabłonka gospodarza, a zielony to mucyna. Groty strzałek wskazują strzępki. Strzałki wskazują drożdże. Podziałka = 20 μm. Obrazy F i G są zaadaptowane z Witchley et al.¹². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Pojawienie się C. albicans barwionych RYBAMI w różnych przedziałach jelitowych. Dziki typ C. albicans jest pokazany we wskazanych segmentach przewodu pokarmowego myszy. W każdym przedziale obrazy przedstawiają obszar przylegający do błony śluzowej gospodarza i centralny obszar światła jelita. Barwienie przeprowadzono za pomocą sondy grzybiczej. Podziałka = 20 μm. Obrazy są zaczerpnięte z Witchley et al.¹². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

. szt. szt. Rozdział szt. szt. TGL

Zapasy antybiotyków (200x)
Penicylina G	181 mg/ml
Streptomycyny	400 mg/μL
Methacarn
skład	Końcowe stężenie	głośność	Jednostek
metanol	60 proc	300	Ml
chloroform	30%	150	Ml
Lodowaty kwas octowy	10%	50	Ml
Rozwiązanie hybrydyzacyjne
skład	Końcowe stężenie	głośność	Jednostek
1 M Tris-HCl, pH 7,4	20 mM	20	μL
5 M NaCl	0,9 mln	180	μL
10% SDS	0,10%	10	μL
100% formamid	1,00%	10	μL (przechowywany w małych porcjach w temperaturze -20 °C między użyciami)
Woda wolna od RNaz		780	μL
roztwór do mycia RYB
1 M Tris-HCl, pH 7,4	20 mM	1	Ml
5 M NaCl	0,9 mln	9	Ml
Woda wolna od RNaz		Rozdział 40	Ml
Roztwór do barwienia jąder mucyny
DAPI, 10 μg/ml	20 ng/ml	cyfra arabska	μL
lektyna, 40 μg/ml	1,6 μg/ml	Rozdział 40	μL
PBS, pH 7,4		Okręg wyborczy 958	μL

Tabela 1: Typowe objętości i stężenia roztworów stosowanych w tym protokole.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda pozwala na wizualizację drożdży i strzępek C. albicans w przewodzie pokarmowym komensywnie skolonizowanych myszy dowolnej płci i szczepu. Sonda FISH hybrydyzuje z 23S rRNA, które jest rozprowadzane w cytoplazmie grzyba. Nasza metoda została zaadaptowana z wcześniej opisanego protokołu wizualizacji bakterii jelitowych²⁰. Ponieważ C. albicans zmienia swoją morfologię w organizmie gospodarza, metoda ta jest przydatna do monitorowania kształtu komórek grzyba, a także ich lokalizacji. Na przykład użyliśmy tej metody, aby obalić hipotezę, że drożdże dominują w całym przewodzie pokarmowym i ujawnić rozbieżności między fenotypami in vivo i in vitro niektórych mutantów z "wadliwym filamentem"¹².

Istnieje kilka modeli myszy dla kolonizacji komensalnej C. albicans . Mikrobiota myszy laboratoryjnych i ludzi jest odrębna, a u myszy do ustanowienia stabilnej kolonizacji wymagane jest stosowanie antybiotyków lub specjalistycznej diety. Leczenie antybiotykami zwiększa również kolonizację C. albicans u ludzi i jest głównym czynnikiem ryzyka choroby rozsianej¹⁰. Antybiotyki stosowane w tym badaniu są stosunkowo niedrogie i powodują wiarygodne zmniejszenie mikrobioty bakteryjnej. Należy pamiętać, że antybiotyki są stosowane w celu zmniejszenia obciążenia antagonistycznymi gatunkami bakterii, a nie w celu wyeliminowania wszystkich bakterii ze zwierząt. Jeśli naukowcy chcą badać interakcje C. albicans-gospodarz przy braku bakterii lub aby uniknąć stosowania antybiotyków lub specjalnej diety, zwierzęta wolne od zarazków mogą zostać zastąpione zwierzętami hodowanymi konwencjonalnie; Jednak myszy gnotobiotyczne wykazują pewne nieprawidłowości immunologiczne i anatomiczne, dlatego mogą nie być odpowiednie do wszystkich celów.

Dla udanego barwienia RYB ważne jest kilka kroków: Zalecana metoda utrwalania ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności strukturalnej tkanek przewodu pokarmowego, w szczególności delikatnej zawartości światła jelita, takiej jak warstwa śluzu i trójwymiarowa organizacja grzybów i bakterii¹⁶. Należy pamiętać, że wiele powszechnie stosowanych roztworów mocujących, które zawierają wodę, jest wysoce szkodliwych dla architektury światła. Utrwalacze i roztwory do mycia po utrwaleniu zalecane w niniejszym protokole nie zawierają wody i ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia wodą. Kolejnym krytycznym etapem jest etap hybrydyzacji, w którym ważne jest, aby uniknąć odparowania roztworu hybrydyzacyjnego podczas inkubacji szkiełek w piecu do hybrydyzacji. Sugerujemy umieszczenie zjeżdżalni w wodoszczelnym pojemniku, aby uniknąć tego problemu. Alternatywnie można użyć wodoszczelnych komór hybrydyzacyjnych, takich jak te pierwotnie używane do hybrydyzacji mikromacierzy.

Sonda FISH specyficzna dla C. albicans jest opisana w tym protokole. Ponieważ jednak wiele myszy hodowanych w laboratorium nie zawiera C. albicans ani innych grzybów jako części swojej naturalnej mikroflory jelitowej, sonda pangrzybicza może specyficznie zabarwić C. albicans u eksperymentalnie skolonizowanych zwierząt. Zastąpienie sondy pangrzybiczej może być pożądane ze względu na jej lepsze właściwości hybrydyzacyjne i wyższy stosunek sygnału do szumu. Jeśli sonda pangrzybicza jest używana jako sonda pseudospecyficzna dla C. albicans, ważne jest, aby udokumentować brak barwienia u niezakażonych zwierząt (tj. leczonych antybiotykami, ale nie C. albicans). Barwienie nieskolonizowanego zwierzęcia kontrolnego jest również przydatne do oceny barwienia tła, które może wynikać z przylegania sond FISH do cząstek pokarmu. Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie sond FISH zapewnia lepszą specyficzność w porównaniu z większością innych metod barwienia grzybów, takich jak Calcofluor white (który barwi chitynę, składnik ściany komórkowej, który może się różnić w zależności od typu komórki), GMS lub dostępne na rynku przeciwciała przeciwgrzybicze. Co więcej, barwienie FISH pozwala na kobarwienie wielu organizmów za pomocą różnie znakowanych sond FISH do specyficznych dla gatunku rRNA.

Jednym z zastrzeżeń tej techniki jest to, że niektóre typy komórek drożdży C. albicans wydają się bardzo podobne do FISH (na przykład typy komórek nieprzezroczystych i GUT). Aby rozróżnić te typy komórek, przydatne byłoby opracowanie sond hybrydyzacyjnych do mRNA grzybów specyficznych dla typu komórki. Niemniej jednak, w swojej obecnej formie, technika FISH ujawniła już zaskakujące rozbieżności między zachowaniami in vivo i in vitro mutantów C. albicans ocenianych w obu warunkach¹², wskazując na złożone interakcje w naturalnym środowisku komensalnym, które nie są odpowiednio naśladowane przez istniejące testy in vitro. Dalsze badania różnych barwników C. albicans u dodatkowych dzikich i zmutowanych gospodarzy prawdopodobnie dostarczą dodatkowych informacji na temat interakcji między grzybem a gospodarzem. W szczególności pouczające będzie profilowanie C. albicans w modelach nieswoistego zapalenia jelit, które jest związane z wysokimi mianami C. albicans u ludzi²¹, oraz innych modelach przerostu i choroby C. albicans . Technika FISH może być również połączona z immunohistochemią w celu barwienia określonych komórek gospodarza. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiona tutaj metoda zapewnia dość szybki i niezawodny sposób określania lokalizacji i morfologii C. albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 ml strzykawka	BD	309659	może być zastąpiona od dowolnego dostawcy
Agar			można zastąpić od dowolnego dostawcy
C. albicans Sonda FISH	IDT DNA Technologies	na zamówienie
Komora do inkubacji			wodoszczelna komora przeznaczona do redukcji parowania
Chloroform	Sigma	C2432	>=99,5%
DAPI	Roche	10236276001	można zastąpić od dowolnego dostawcy
Delikatne chusteczki do wycierania	Kimberley-Clark	34256CT	Kimwipes
D-glukoza	Sigma	G7021-5KG	można zastąpić u dowolnego dostawcy
Etanol	Sigma	E7023	klasa biologii molekularnej
Igły do karmienia	Kadencja, Inc.	7910	metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; może być sterylizowany w autoklawie w celu sterylizacji
FITC-UEA-1	Sigma	L9006-1MG	dostępne inne fluorofory
FITC-WGA	Sigma	L4895-2MG	dostępne inne fluorofory
Podkładki piankowe	Fisher	22038221	Zamów podkładki piankowe, które zmieszczą się w kasetach
Formamid	Sigma	47671	klasa biologii molekularnej
Lodowaty kwas octowy	Macron Fine Chemicals	MK881746	odczynnik ACS, >=99,5%
Szklany słoik z kopliny	Fisher	08-815	mieści do 10 szkiełek tyłem do siebie
Kasety histologiczne	Simport	M512	Głębokie kasety, dzięki którym jelito ślepe nie jest zgniecione
Szkiełka nakrywkowe do hybrydyzacji	Sigma	GBL712222	bez RNaz
Piec	do hybrydyzacji		może być zastąpiony od dowolnego dostawcy
LB			może być zastąpiony od dowolnego dostawcy
Pożywka			przygotowana zgodnie z opisem w Lee et al. 1975
Metanol	Sigma	179337	odczynnik ACS, >=99,8%
Myszy	Charles River Laboratories	028	dorosły BALB/c; 18-21 gramów (8-10 tygodni)
Paraformaldehyd	Fisher	50-980-487	16% roztwór
Wosk parrafinowy	Sigma	P3558-1KG	Paraplast do zatapiania tkanek
PBS, pH 7,4	UCSF Zakład Hodowli Komórkowych Jednostka Produkcji Pożywek	CCFAL003	wapń, magnez; można zastąpić od dowolnego dostawcy
Penicylina G	Sigma	PENNA-100MU
Agar			może być zastąpiony od dowolnego dostawcy
Saline	Baxter	2F7123	sterylny, może być zastąpiony od dowolnego dostawcy
Chlorek sodu (NaCl)		Sigma S3014	może być zastąpiony od dowolnego dostawcy; utrzymywać
dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma	L3771	może być zastąpiony od dowolnego dostawcy; utrzymywać streptomycynę wolną od RNaz
	Sigma	S9137-100G
Długopis Super PAP	Life Technologies	8899	można zastąpić od dowolnego dostawcy
Tris-HCl	Sigma	T3253	można zastąpić u dowolnego dostawcy; utrzymywać wolne od RNaz
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	nie zawiera DAPI
Ksyleny	Sigma	214736	odczynnik
klasy YEPD			może być podstawiony od dowolnego dostawcy