Artykuł metodologiczny

Niezawodna izolacja mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego w pięciu grupach kręgowców

DOI:

10.3791/60291

⸱

12 stycznia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest odizolowanie mikronaczyń z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego kręgowców lizencefalicznych i gyrencefalicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja mikronaczyń z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest zwykle wykonywana poprzez połączenie tkanki korowej wielu zwierząt, najczęściej gryzoni. Takie podejście ogranicza badanie właściwości bariery krew-mózg (BBB) do kory mózgowej i nie pozwala na indywidualne porównanie. Projekt ten koncentruje się na opracowaniu metody izolacji, która pozwala na porównanie jednostki nerwowo-naczyniowej (NVU) z wielu obszarów OUN: kory, móżdżku, płata wzrokowego, podwzgórza, przysadki mózgowej, pnia mózgu i rdzenia kręgowego. Co więcej, protokół ten, pierwotnie opracowany dla próbek mysich, został z powodzeniem zaadaptowany do stosowania na tkankach OUN małych i dużych gatunków kręgowców, z których jesteśmy również w stanie wyizolować mikronaczynia z istoty białej półkuli mózgowej. Ta metoda, w połączeniu z immunoznakowaniem, pozwala na ilościowe określenie ekspresji białek i statystyczne porównanie między osobami, typem tkanki lub leczeniem. Udowodniliśmy tę przydatność, oceniając zmiany w ekspresji białek podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), mysiego modelu choroby neurozapalnej, stwardnienia rozsianego. Ponadto mikronaczynia wyizolowane tą metodą mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak między innymi qPCR, sekwencjonowanie RNA i Western blot. Mimo że nie jest to pierwsza próba wyizolowania mikronaczyń OUN bez użycia ultrawirowania lub dysocjacji enzymatycznej, jest wyjątkowa pod względem biegłości w porównywaniu pojedynczych osób i wielu regionów OUN. W związku z tym pozwala na badanie szeregu różnic, które w przeciwnym razie mogłyby pozostać niejasne: części OUN (kora, móżdżek, płat wzrokowy, pień mózgu, podwzgórze, przysadka mózgowa i rdzeń kręgowy), typ tkanki OUN (istota szara lub biała), osoby, eksperymentalne grupy leczenia i gatunki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz mózg jest najważniejszym organem w naszym ciele. Z tego powodu priorytetem jest utrzymanie homeostazy mózgu pomimo czynników zewnętrznych, które mogą wywołać odchylenie od normalności. Według niektórych badaczy, około 400–500 milionów lat temu1, kręgowce rozwinęły to, co obecnie znamy jako barierę krew-mózg (BBB)2,3. To ochronne "ogrodzenie" wywiera największy wpływ na homeostazę i funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) poprzez ścisłą regulację transportu jonów, cząsteczek i komórek między krwią a miąższem OUN. Kiedy bariera krew-mózg zostaje zakłócona, mózg staje się podatny na ekspozycję na toksyny, infekcje i stany zapalne. Dlatego dysfunkcja BBB jest związana z wieloma, jeśli nie wszystkimi, zaburzeniami neurologicznymi i neurorozwojowymi4,5,6.

Wyrafinowana funkcja BBB jest przypisywana unikalnemu mikrokrążeniu OUN zgodnemu z jednostką nerwowo-naczyniową (NVU)2,3. Wysoce wyspecjalizowane komórki śródbłonka, perycyty i astrocytarne stopy końcowe są składnikami komórkowymi klasy NVU2,< klasy sup = "xref">3. Macierz zewnątrzkomórkowa generowana przez te komórki jest również niezbędna dla fizjologii NVU i BBB2,3. Chociaż podstawowe składniki komórkowe i molekularne NVU są zachowane wśród kręgowców, niejednorodność jest zgłaszana między rzędami i gatunkami7,8. Jednak ograniczenia techniczne utrudniają nam pełne uwzględnienie tych różnic w badaniach neurobiologicznych, biomedycznych lub translacyjnych.

Z tego powodu rozszerzyliśmy metodę izolacji mikronaczyń dla regionu CNS, aby można ją było zastosować do wielu gatunków ze wszystkich pięciu grup kręgowców: ryb,,, ptaków i ssaków. Protokół jest opisany do stosowania w odniesieniu do kręgowców z małą i dużą zakrętoczaszką, w tym gatunków o znaczeniu translacyjnym9. Dodatkowo uwzględniamy inne regiony OUN, które nie były wcześniej badane w tym kontekście, ale są istotne dla neurofizjologii i mają ogromne implikacje kliniczne: podwzgórze, przysadka mózgowa i istota biała. Na koniec przetestowaliśmy zdolność tej metody izolacji jako niezawodnego narzędzia do identyfikacji zmian w ekspresji białek wzdłuż NVU i/lub BBB9,10,11. Jako dowód słuszności koncepcji pokazaliśmy, jak określić zmiany w ekspresji VCAM-1 i JAM-B podczas EAE przy użyciu metody izolacji, a następnie immunofluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury niniejszego badania są zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Uniwersytet Kalifornijski (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Opieka nad zwierzętami na UC Davis jest regulowana przez kilka niezależnych źródeł i jest w pełni akredytowana przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) od 1966 roku. Tkanki OUN świń uzyskano z Zakładu Nauk o Zwierzętach UCD, Laboratorium Nauk o Mięsie. Tkanki OUN makaków rezusów uzyskano z California National Primate Research Center Patology Department (NIH P51OD011107). Personel laboratoryjny nie przeprowadził znieczulenia, eutanazji ani sekcji zwłok świń i makaków. W związku z tym nie ma szczególnych zaleceń dotyczących tych kwestii.

UWAGA: Ta metoda została zatwierdzona dla wielu gatunków, ale dostarczony protokół odpowiada bardziej bezpośrednio tkankom myszy i świń. Szczegóły dotyczące płata wzrokowego nie mają zastosowania w przypadku korzystania z okazów ssaków. Wszystkie materiały niebezpieczne biologicznie muszą być obsługiwane w obiekcie o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL). Wszystkie materiały silnie toksyczne muszą być przenoszone pod wyciągiem. Wszystkie odpady medyczne niebezpieczne biologicznie i odpady ostro toksyczne muszą być odpowiednio utylizowane.

1. Przygotowanie

  1. Roztwory (Tabela 1) należy przygotować co najmniej jeden dzień wcześniej.
    UWAGA: Bardzo trudno jest rozpuścić dekstran o masie cząsteczkowej 70 kDa (MW). Bardziej efektywne jest pozostawienie roztworu na wymieszanie przez noc przykrytego folią parafinową lub folią. Protokół wymaga użycia dwóch różnych roztworów MV-2 w zależności od badanej próbki. 18% dekstran skutecznie oddziela mielinę od osadu mikronaczynia podczas wykonywania protokołu na małych próbkach lizencefalicznych. Jednak rozwija rozmaz mieliny w obrębie granicy tkanek OUN z dużych próbek gyrencefalicznych, a także podwzgórza i przysadki mózgowej z małych próbek. Temu rozmazowi zapobiega się, stosując 20% dekstranu.
  2. Przygotować szkiełka podstawowe, ładując 50 μl poli-D-lizyny na studzienkę i pozostawić do wyschnięcia na 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), najlepiej w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2 (BSC-2). Nie przesuszać. Spłucz dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i przechowuj w lodówce do momentu użycia.

2. Wycięcie tkanki CNS z małego próbki kręgowców Lissencephalicz

UWAGA: Artykuł demonstruje zastosowanie protokołu na myszy męskiej C57BL6/J, 10 tygodniowej, ~25 g.

  1. Przygotować dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml i probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,7 ml z odpowiednio 5 ml i 1 ml roztworu MV-1 na próbkę. Trzymaj probówki na lodzie.
  2. Znieczulenie
    1. Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy, ksylazyny i acepromazyny koktajlu znieczulającego w dawce 100/10/3 mg na kg masy ciała i spryskać 70% etanolem. Potwierdź znieczulenie, oceniając brak odruchów powiekowych i odruchów pedałowania, odpowiednio dotykając oka i szczypiąc stopę.
    2. Znieczulenie gołębi poprzez inhalację 5% izofluranu za pomocą indukcyjnego pudełka do znieczulenia.
    3. Znieczulenie ryb i żab w 1% trikainy w zbiorniku wodnym dla ryb lub roztworze Ringera (tabela materiałów).
    4. Znieczulenie jaszczurek należy schłodzić w temperaturze 4 °C przed eutanazją.
  3. Odetnij głowę zwierzęcia nożyczkami chirurgicznymi, oderwij skórę kleszczami, aby odsłonić czaszkę, i przetnij nożyczkami LaGrange otwór wielki (Ryc. 1 A).
  4. Wyciąć mózg szpatułką i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z roztworem MV-1. Trzymaj probówkę na lodzie.
  5. Pobrać przysadkę mózgową z siodła tureckiego czaszki za pomocą kleszczy i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml z roztworem MV-1. Trzymaj probówkę na lodzie.
  6. Usuń skórę i mięśnie, aby odsłonić kręgosłup. Wytnij kończyny, klatkę piersiową i narządy wewnętrzne (Rysunek 1B).
  7. Wypreparuj rdzeń kręgowy jedną z dwóch metod opisanych poniżej. Następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 5 ml z roztworem MV-1. Trzymaj probówkę na lodzie.
    1. Wykonaj laminektomię, przecinając nożyczkami LaGrange w kierunku rostralnym do ogonowego, zaczynając od otworu kręgowego szyjnego, aż do rdzenia lędźwiowego.
    2. Wykonaj płukanie w kierunku doogonowym do rostralnego w całym otworze kręgowym lędźwiowym za pomocą igły 18 G i strzykawki 10 ml załadowanej roztworem MV-1 (Rysunek 1C,D).
      UWAGA: Ta metoda działa tylko w przypadku bardzo małych okazów, głównie gryzoni (<100 g).
  8. Za pomocą lunety preparacyjnej odetnij worek oponowy od rdzenia kręgowego nożyczkami sprężynowymi i usuń pozostałe opony mózgowe za pomocą dwuzębnego kilofa (Ryc. 2).
  9. Przenieś mózg na szalkę Petriego i za pomocą lunety preparacyjnej usuń opony mózgowe za pomocą dwuzębnego kilofa (Ryc. 2 A–C).
  10. Wytnij opuszki węchowe i wzgórze za pomocą kleszczy, nożyczek do tęczówki i nożyczek sprężynowych. Za pomocą dwuzębnego kilofa usuń splot naczyniówkowy ze wszystkich komór mózgu. Upewnij się, że usunąłeś cały splot naczyniówkowy.
    UWAGA: Splot naczyniówkowy i opuszki węchowe są ogromnym źródłem zanieczyszczenia. W przeciwieństwie do BBB, naczynia te są wysoce fenestrowane, a wyniki kolejnych eksperymentów będą zagrożone, jeśli nie zostaną usunięte.
  11. Za pomocą kleszczy oddziel różne obszary OUN: korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy (nie u osobników ssaków) i podwzgórze.

3. Wycięcie tkanki CNS z dużego okazu kręgowca gyrencefalicznego

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje tkanki OUN świń uzyskane z rzeźni. Dlatego nie jest tu opisane ani pokazane żadne znieczulenie, eutanazja ani sekcja zwłok.

  1. Transportuj tkanki OUN świń w pojemniku histologicznym o pojemności 0,946 l (32 uncje) załadowanym roztworem MV-1 w skrzyni / wiadrze z lodem.
  2. Za pomocą lunety preparacyjnej usuń opony mózgowe za pomocą dwuzębnego kilofa, kleszczy, nożyczek do tęczówki i nożyczek sprężynowych z każdej tkanki OUN. Upewnij się, że usunąłeś wszelkie kawałki splotu naczyniówkowego z komór mózgu.

4. Homogenizacja tkanek OUN

UWAGA: Jest to bardziej efektywne, gdy dwóch badaczy angażuje się w proces homogenizacji: jeden preparuje opony mózgowe pod stereoskopem, a drugi homogenizuje zmielone tkanki. W ten sposób chusteczki są szybko wkładane z powrotem do pojemnika na lód i utrzymywane w niskiej temperaturze.

  1. Umieść każdy obszar OUN na szalce Petriego z ~1 ml roztworu MV-1. Za pomocą ostrza o pojedynczej krawędzi zmiel tkankę, aby uzyskać kawałki o średnicy 1–2 mm.
    1. W przypadku małego okazu kręgowca należy użyć szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm.
    2. W przypadku dużego okazu kręgowca należy użyć szalki Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm.
  2. Homogenizacja próbki małego kręgowca (tabela 2 i tabela 3)
    1. Przenieś korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy i rdzeń kręgowy do ~1 ml roztworu MV-1 w indywidualnym młynku do tkanek szklanych Potter-Elvehjem o pojemności 10 ml za pomocą tłuczka PTFE za pomocą pipety transferowej. Dodaj 5 ml roztworu MV-1 i homogenizuj każdą tkankę (~10 uderzeń). Przenieść do pojedynczych probówek stożkowych o pojemności 15 ml. Utrzymuj probówki na lodzie.
      UWAGA: W przypadku małych kręgowców, odpowiednio 5 lub 4, z płatem optycznym lub bez, potrzebne są młynki Potter-Elvehjem o pojemności 10 ml i probówki stożkowe o pojemności 15 ml.
    2. Przenieś podwzgórze i przysadkę za pomocą kleszczy do ~100 μl roztworu MV-1 w pojedynczej probówce o pojemności 1,7 ml i ostrożnie homogenizuj szklanym mikrotłuczkiem. Opłucz każdy mikrotłuczek ~1 ml roztworu MV-1. Trzymaj rurkę na lodzie.
      UWAGA: W przypadku małego kręgowca potrzebne są 2 szklane mikrotłuczki i probówki o pojemności 1,7 ml.
  3. Homogenizacja dużego okazu kręgowca (tabela 4 i tabela 5)
    1. Za pomocą pipety transferowej przenieś zmieloną tkankę do szklanego młynka do tkanek Potter-Elvehjem o pojemności 55 ml za pomocą tłuczka z PTFE i przymocuj do mieszadła nad głową. Dodać połowę zalecanej objętości roztworu MV-1, zgodnie z konkretną homogenizowaną porcją OUN (Tabela 5).
    2. Włącz mieszadło górne na bardzo niskich obrotach (~150 obr./min) i ostrożnie przesuwaj szklaną rurkę w górę iw dół przez około 30 s.
    3. Wyłączyć mieszadło górne, dodać więcej roztworu MV-1 i powtarzać krok 4.3.2 aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny.
    4. Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Trzymaj probówkę na lodzie.
    5. Umyj młynek wodą dejonizowaną między każdą homogenizacją tkanek OUN.
      UWAGA: W przypadku dużych kręgowców 5 lub 4, odpowiednio z istotą białą lub bez, potrzebne są stożkowe probówki o pojemności 50 ml. Podobnie, potrzebne są dwie (2) stożkowe rurki o pojemności 15 ml dla podwzgórza i przysadki mózgowej.

5. Oczyszczanie mikronaczyń

  1. Odwirować homogenaty tkanek wynikające z etapów 4.2.1, 4.2.2 lub 4.3.4 przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Duży biały interfejs mieliny utworzy się na wierzchu czerwonawych granulek mikronaczyń. Odrzucić supernatanty.
    1. Okaz małego kręgowca (tabela 2 i tabela 3)
      1. Zawiesić korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy i rdzeń kręgowy w 5 ml lodowatego roztworu MV-2 za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml (~10 rzutów). Dodaj 5 ml lodowatego roztworu MV-2 do każdej zawiesiny i ostrożnie wymieszaj, obracając probówki.
      2. Zawiesić podwzgórze i przysadkę mózgową w 1 ml roztworu MV-2.
    2. Okaz dużych kręgowców (tabela 4 i tabela 5)
      1. Dodaj 20 ml lodowatego roztworu MV-2 do kory mózgowej, móżdżku, pnia mózgu i granulek mikronaczyń rdzenia kręgowego. Ponownie zawiesić granulki, mieszając na rurowym wytrząsarce rewolwerowej, mieszając z prędkością 40 obr./min przez ~5 min. Zrównoważyć objętość stożkowych rurek korowych, móżdżku, pnia mózgu i zawiesin rdzenia kręgowego, dodając więcej roztworu MV-2.
      2. Zawiesić granulki mikronaczyń podwzgórza i przysadki mózgowej w 5 ml roztworu MV-2 za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml (~10 płukań). Dodaj 5 ml lodowatego roztworu MV-2 do zawiesiny i ostrożnie wymieszaj, obracając probówkę.
  2. Wirować przy 4 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Ostrożnie oderwij grubą i gęstą warstwę mieliny na granicy faz cieczy od ścianek każdej probówki, powoli obracając rurki i pozwalając supernatantowi przejść wzdłuż ścianek.
  4. Wyrzuć granicę mieliny i cieczy i osusz wewnętrzną ściankę każdej probówki szpatułką owiniętą papierową chusteczką o niskiej zawartości włókien. W przypadku małych próbek kręgowców należy usunąć warstwę mieliny z każdego podwzgórza i rurki przysadki mózgowej, ostrożnie odsysając pipetą transferową.
  5. Zetrzyj nadmiar płynu skręconą, niestrzępiącą się papierową chusteczką. Zawiesić każdą osadkę z 1 ml roztworu MV-3 za pomocą końcówek o niskim stopniu wiązania. Trzymaj probówki na lodzie.

6. Elucja i filtracja mikronaczyń

  1. Wlać lodowaty roztwór MV-3 do indywidualnych zlewek dla każdego regionu OUN. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    1. W przypadku małych okazów kręgowców należy użyć 10 ml roztworu MV-3 na 50 ml zlewki. W sumie potrzeba 6–7 zlewek, w zależności od tego, czy uwzględniony jest płat wzrokowy, czy nie.
    2. W przypadku dużych okazów kręgowców należy użyć 30 ml roztworu MV-3 na 100 ml zlewki. W sumie potrzeba 6-7 zlewek, w zależności od tego, czy zawiera się istotę białą, czy nie.
  2. Umieść sitko do komórek na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Użyj jednego na region CNS. Użyj sitka 100 μm do kory, pnia mózgu, płata wzrokowego, rdzenia kręgowego i przysadki mózgowej. Użyj sitka komórkowego o wielkości 70 μm do móżdżku i podwzgórza.
  3. Zwilż każde sitko 1 ml lodowatego roztworu MV-3.
  4. Dodać więcej roztworu MV-3 do zawiesin przygotowanych w kroku 5.5 za pomocą pipety serologicznej podczas mieszania, aby uniknąć tworzenia się agregatów. Ostrożnie załaduj mikronaczynia na sitko. Spłucz lodowatym roztworem MV-3.
    1. W przypadku próbek małych kręgowców (Tabela 2 i Tabela 3) dodać 10–15 ml roztworu MV-3 za pomocą pipety serologicznej i przepłukać 5 ml roztworu MV-3.
    2. W przypadku dużych próbek kręgowców dodać 20 ml roztworu MV-3 za pomocą pipety serologicznej i przepłukać 10 ml roztworu MV-3.
  5. Zmontuj jednostkę filtrującą, umieszczając nylonowy filtr siatkowy o grubości 20 μm na zmodyfikowanym uchwycie filtra (Rysunek 2D), po jednym na region CNS.
    1. W przypadku małych okazów kręgowców (Tabela 2 i Tabela 3) należy użyć zmodyfikowanych uchwytów filtrów 25 mm do kory mózgowej, móżdżku, pnia mózgu, płata wzrokowego i rdzenia kręgowego. Użyj zmodyfikowanych uchwytów filtrów 13 mm do podwzgórza i przysadki mózgowej.
    2. W przypadku dużych okazów kręgowców (Tabela 4 i Tabela 5) należy użyć zmodyfikowanych uchwytów filtrów 47 mm dla kory, móżdżku, pnia mózgu i rdzenia kręgowego. Użyj 25 mm na podwzgórze i przysadkę.
  6. Umieść filtr na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilż filtr 5 ml lodowatego roztworu MV-3, upewniając się, że bufor wylewa się z uchwytu filtra do stożkowej rurki.
  7. Przenieś eluowane mikronaczynia (z kroku 6.4) na wierzch nylonowego filtra siatkowego o grubości 20 μm i przepłucz mikronaczynia 5–10 ml lodowatego roztworu MV-3.
  8. Odzyskać filtr za pomocą czystych kleszczyków i zanurzyć go w zlewce zawierającej lodowaty roztwór MV-3 przygotowany w kroku 6.1.
  9. Odłącz mikronaczynia od filtra, delikatnie nim potrząsając przez około 30 sekund. W przypadku małych okazów kręgowców zawartość zlewki wlać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. W przypadku dużych okazów kręgowców zawartość zlewki należy wlać do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  10. Wirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego roztworu MV-3 za pomocą końcówki pipety o niskiej wiązce.
    1. W przypadku próbek małych kręgowców przenieść zawiesinę (z kroku 6.10) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i wirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: To wirowanie jest wykonywane na wirówce stołowej z maksymalną prędkością (~20 000 x g), aby zapewnić solidną wydajność.
    2. W przypadku dużych próbek kręgowców przenieść zawiesinę z etapu 6.10 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 5,0 ml, dodać 4 ml roztworu MV-3 i odwirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

7. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) zostało przeprowadzone na próbkach, i ryb jako dowód wykonalności protokołu. Dlatego nie ma zaleceń dotyczących znakowania immunologicznego dla tych próbek.

  1. Usunąć supernatant z probówek do mikrowirówek.
  2. Zawiesić osad w 1x sterylnym PBS za pomocą słabo wiążącej końcówki pipety (tabela materiałów). Nie dopuścić do tworzenia się agregatów w mikronaczyniach poprzez wielokrotne pipetowanie. W przypadku małych okazów kręgowców (tabela 3) należy użyć ~100 μL–2,000 μL w zależności od wielkości osadu. W przypadku dużych okazów kręgowców (Tabela 5) należy użyć ~1,000 μL–4,000 μL w zależności od wielkości osadu.
  3. Używając słabo wiążącej końcówki pipety, przenieś mikronaczynia do szkiełek studzienkowych, uważając, aby dodać je do środka każdej studzienki, unikając ścianek bocznych.
  4. Umieść szkiełka studzienne bez przykrycia w BSC-2 i pozostaw do wyschnięcia na 20 do 30 minut w RT.
    UWAGA: Aby uniknąć tworzenia się kruszywa, stosuje się stosunkowo dużą objętość 1x PBS. Z tego powodu konieczne jest pozostawienie szkiełek do wyschnięcia przed utrwaleniem, aby upewnić się, że mikronaczynia są utrzymywane przez powłokę poli-D-lizyny.
  5. Usunąć resztki 1x PBS przez pipetowanie pipetą transferową, dodać 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odpipetować roztwór utrwalający i przemyć 3x 200 μl 1x PBS przez 5 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: W tym momencie przeprowadzono barwienie H&E na mikronaczyniach ośrodkowego układu nerwowego ryb, i.
  7. Dodać 200 μl buforu blokującego do szkiełka studzienkowego i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Usunąć bufor blokujący za pomocą pipety transferowej i dodać 200 μl pierwszorzędowego koktajlu przeciwciał do rozcieńczalnika przeciwciał (tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  9. Odpipetować koktajl przeciwciał pierwotnych i przemyć 3x 200 μl 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Załadować drugorzędowy koktajl przeciwciał (tabela materiałów) rozcieńczony w 1x PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  11. Odpipetować wtórny koktajl przeciwciał i przemyć 3x 200 μl 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po ostatnim praniu odczep ramę szkiełka i osusz nadmiar 1x PBS za pomocą papierowej chusteczki o niskiej ilości kłaczków.
  12. Dodaj szkiełko nakrywkowe, płynne podłoże mocujące zapobiegające blaknięciu i 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do barwienia jądrowego. Pozostaw do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  13. Po wyschnięciu przechowywać chronić przed światłem na szkiełku w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do mikroskopii konfokalnej i akwizycji danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikronaczynia wyizolowane z mysiego OUN pokazały wszystkie wewnętrzne składniki komórkowe jednostki nerwowo-naczyniowej2,3. Za pomocą cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM, znanej również jako CD31) lub izolektyny IB4 (glikoproteiny wiążącej glikokaliks komórek śródbłonka) dla komórek śródbłonka, płytkowego czynnika wzrostu-β (PDGFRβ) lub antygenu glejowego neuronu 2 (NG2) dla perycytów i akwaporyny-4 (AQP4...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera krew-mózg obejmuje unikalne właściwości komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu w połączeniu z wyrafinowaną architekturą połączeń ścisłych, przylegających, "kołkowo-gniazdowych" i blaszek adhezyjnych krytycznych dla homeostazy OUN 2,3,19. Właściwości komórek śródbłonka są indukowane i utrzymywane przez perycyty i otaczające je procesy astrogleju i końca stopy 2,3,19

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Cruz-Orengo był wspierany przez Uniwersytet Kalifornijski w Davis, Szkołę Medycyny Weterynaryjnej (University of California, Davis, School of Veterinary Medicine).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X PBSThermoFisherBP39920Służy do blokowania i rozcieńczalnika przeciwciał.
20%Mikroskopia elektronowa15713-SUżywany jako utrwalacz (4% PFA)
70 000 MW DextranMillipore Sigma9004-54-0Używany do roztworu MV-2
Kleszcze AdsonaNarzędzia do nauki (FST)11006-12Używany do usuwania mięśni i skóry
Kleszcze Adson, jakość studenckaFST91106-12Taki sam jak powyżej, ale tańszy
Surowica bydlęca albumina (BSA)Millipore SigmaA7906-100GStosowany do roztworu MV-3, bloku i rozcieńczalnika przeciwciał
Corning 100 μ m Sitko do komórekMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m Sitko do komórekMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork końcówki o niskim wiązaniuMillipore SigmaCLS4151Taki sam jak poniżej, ale tańszy.
Cultrex Poli-D-lizynaR& D3439-100-01Używany do powlekania ślizgowego
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555ThermoA21432Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Osioł anty-mysz IgG-ALEXA 488ThermoA21202Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Osioł anty-królik IgG-ALEXA 488ThermoA21206Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Osioł anty-Rabbit IgG-ALEXA 647ThermoA31573Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Osioł anty-Rat IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Dwuzębny pickdo tkanek FST18067-11Służy do usuwania opon mózgowych i splotu naczyniówkowego
Dumont #3c KleszczeFST11231-20Używany do delikatniejszego i/lub małego transportu tkanek OUN (takich jak przysadka)
Dumont #7 KleszczeFST11274-20Używany do rozwarstwiania i obsługi CNS Kleszcze Dumont
#7, studentFST91197-00Tak samo jak powyżej, ale tańsze
ep Dualfilter T.I.P.S. Końcówki LoRetentionEppendorf22493008Lepsza jakość niż powyższe końcówki (droższe).
Bardzo drobne kleszczyki Graefe, ząbkowaneFST11151-10Używane do usuwania kości
Cienkie nożyczki, ostreFST14060-09Używane do usuwania worka oponowego świń i makaków
Szklany tłuczek 1,5 ml Probówka do mikrowirówek Homogenizator do mielenia tkanek, opakowanie 10 sztukChang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Używany do małych podwzgórz i przysadki weterynaryjnej.
Kozioł anty-CXCL12, biotynylowanyPeproTech500-P87BGBTStosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie: 1:20.
Kozioł anty-JAM-BR& DAF1074Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do oceny zapalenia nerwów. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Kozioł anty-mysi IgG-ALEXA 488ThermoA11001Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Kozioł anty-mysi IgG-ALEXA 555ThermoA21424Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Koza anty-PDGFRβR& DAF1042Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Kozia anty-królicza IgG-ALEXA 555ThermoA21249Stosowana jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Kozia anty-królicza IgG-DyLight 488Thermo35552Stosowana jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Kozioł anty-Rat IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Graefe Kleszcze, zakrzywiona końcówka, 1X2 zębyFST11054-10Służy do nylonowej siatki filtracyjnej przytrzymującej i wytrząsającej
HBSS, 1X bufor z wapniem i magnezemCorning21-022-CMUżywany do roztworu MV-1
HEPES, 1M bufor płynnyCorning25-060-CIUżywany do roztworu MV-1
Izolektyna GS-IB4-Biotyna-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Glikoproteina wyizolowana z rośliny strączkowej Griffonia simplicifolia, która wiąże reszty D-galaktozylu glikokalizylu komórek śródbłonka. Stosowany do mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego ptaków i świń. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Nożyczki LaGrange, ząbkowaneFST14173-12Używane do preparowania czaszki i laminektomii (z wyjątkiem świń i makaków)
Millicell EZ slide 8-dołkowa jednostka MilliporeSigmaPEZGS0816
Mouse anty-CLDN5Thermo35-2500Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Mysi anty-GGT1Abcamab55138Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Mysz anty-ludzka CD31R& DBBA7Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało na mikronaczyniach OUN naczelnych. Zalecane stężenie: 16,5 μ g/ml.
Mysi anty-NFMThermoRMO-270Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Mysi anty-&alfa;SMAThermoMA5-11547Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Nylonowa siatka filtracyjna, rolkaMillipore SigmaNY6000010Wycinane laserowo tarcze z siatki filtracyjnej o średnicy 13 mm. Stosowany do małych wetebrów, podwzgórza i przysadki mózgowej.
Nylonowe siatki filtracyjne, 25 mmMillipore SigmaNY2002500Stosowany na większości tkanek OUN małych kręgowców, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej. Stosowany do podwzgórza makaków i świń oraz przysadki mózgowej.
Nylonowe siatki filtracyjne, 47 mmMillipore SigmaNY2004700Stosowany do tkanek OUN makaków i świń, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej.
Odczynnik zapobiegający blaknięciu ProLong Gold z DAPIThermoFisherP36935Służy do szkiełek nakrywkowych.
Królik anty-AQP4Millipore SigmaA5971Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Królik anty-LSRMillipore Sigma SAB2107967Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Królik anty-NG2Millipore SigmaAB5320Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Królik anty-OSPAbcamab53041Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 1 μ g/ml.
Królicza anty-VE-KadherynaAbcamab33168Stosowana jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Królik anty-ZO-1Thermo61-7300Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Szczurzy anty-CD31Becton DickinsonBD 550274Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało dla mysich mikronaczyń OUN. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Szczurzy anty-GFAPThermo13-0300Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie 1:200.
Szczurzy anty-VCAM-1Becton DickinsonBD 553329Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do oceny zapalenia nerwów. Zalecane stężenie: 5 μ g/ml.
Sterylny roztwór Ringera, FrogAldon CorporationIS5066Stosowany do znieczulenia amfibiowego
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355Stosowany jako przeciwciało wtórne do znakowania biotynylowanych przeciwciał pierwotnych. Zalecane rozcieńczenie 1:500.
Streptawidyna-ALEXA 647ThermoS32357Stosowana jako przeciwciało drugorzędowe do znakowania biotynylowanych przeciwciał pierwszorzędowych. Zalecane rozcieńczenie 1:500.
Nożyczki chirurgiczne, ostreFST14002-12Używane do usuwania mięśni i skóry
Nożyczki chirurgiczne, ostro-FST14001-16Używane do dekapitacji (z wyjątkiem świń i makaków)
Uchwyt filtra Swinnex, 13 mmMillipore SigmaSX0001300Zmodyfikowane przez cięcie laserowe. Stosowany do małych wetebrów, podwzgórza i przysadki mózgowej.
Uchwyt filtra Swinnex, 25 mmMillipore SigmaSX0002500modyfikowany przez cięcie laserowe. Stosowany na większości tkanek OUN małych kręgowców, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej. Stosowany do podwzgórza makaków i świń oraz przysadki mózgowej.
Uchwyt filtra Swinnex, 47 mmMillipore SigmaSX0004700Zmodyfikowany przez cięcie laserowe. Stosowany do tkanek OUN makaków i świń, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277Służy do blokowania i rozcieńczalnika przeciwciał.
Mieszadło napowietrzne Wheaton 120 VacVWR (Dostawca DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)Służy do tkanek OUN makaków i świń za pomocą młynka do tkanek o pojemności 55 ml, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej.
Młynek do tkanek Wheaton Potter-Elvehjem z tłuczkiem PTFE, 10 mlVWR (dostawca DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)Stosowany na większości tkanek OUN małych kręgowców, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej. Stosowany do podwzgórza makaków i świń oraz przysadki mózgowej.
Młynek do tkanek Wheaton Potter-Elvehjem z tłuczkiem PTFE, 55 mlVWR (Dostawca DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)Stosowany do tkanek OUN makaków i świń, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej.
PFA Nauki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

W a ciwo ci bariery krew m zgpor wnanie jednostki naczyniowo nerwowejtechnika izolacji mikronaczysekcja tkanek OUNhomogenizacja w roztworze MV 1protok oczyszczania mikronaczymetody detekcji immunoznakowaniaeksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie m zgu i rdzeniailo ciowe oznaczanie ekspresji bia ek

Powiązane artykuły