Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy migracji, chemoprzyciągania i kohodowli komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60295

⸱

23 stycznia 2020

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy trzy proste testy in vitro - test migracji na duże odległości, test migracji kokulturowej i test przyciągania chemo-chemicznego - które wspólnie oceniają funkcje komórek śródbłonka okołokomorowego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i ich interakcję z interneuronami GABA-ergicznymi.

Streszczenie

Rola układu naczyniowego mózgu w rozwoju układu nerwowego i etiologii zaburzeń mózgu zyskuje coraz większą uwagę. Nasze ostatnie badania zidentyfikowały specjalną populację komórek naczyniowych, komórek śródbłonka okołokomorowego, które odgrywają kluczową rolę w migracji i dystrybucji interneuronów GABA-ergicznych w przodomózgowiu podczas rozwoju embrionalnego. To, w połączeniu z ich autonomicznymi funkcjami komórkowymi, nawiązuje do nowej roli komórek śródbłonka okołokomorowego w patologii zaburzeń neuropsychiatrycznych, takich jak schizofrenia, padaczka i autyzm. Tutaj opisaliśmy trzy różne testy in vitro, które łącznie oceniają funkcje komórek śródbłonka okołokomorowego i ich interakcję z interneuronami GABA-ergicznymi. Zastosowanie tych testów, szczególnie w kontekście człowieka, pozwoli nam zidentyfikować związek między komórkami śródbłonka okołokomorowego a zaburzeniami mózgu. Testy te są proste, tanie i powtarzalne oraz można je łatwo dostosować do dowolnego typu komórek przylegających.

Wprowadzenie

Komórki śródbłonka tworzą wyściółkę naczyń krwionośnych i pośredniczą w ważnych funkcjach, takich jak utrzymanie przepuszczalności ścian naczyń, regulacja przepływu krwi, agregacja płytek krwi i tworzenie nowych naczyń krwionośnych. W mózgu komórki śródbłonka stanowią część krytycznej bariery krew-mózg, która ściśle kontroluje wymianę materiałów między mózgiem a krwiobiegiem1. Nasze badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady zidentyfikowały nowe neurogenne role komórek śródbłonka mózgu, które mają znaczące implikacje dla rozwoju i zachowania mózgu2,3,4,5. Wykazaliśmy, że zarodkowe przodomózgowie myszy jest unaczynione przez dwa odrębne podtypy naczyń, naczynia pialne i naczynia okołokomorowe, które różnią się anatomią, pochodzeniem i profilem rozwojowym2. Komórki śródbłonka wyściełające te dwa podtypy naczyń wykazują wyraźne różnice w profilach ekspresji genów. Podczas gdy komórki śródbłonka pial w większości wyrażają geny związane ze stanem zapalnym i odpowiedzią immunologiczną, komórki śródbłonka okołokomorowego są wyjątkowo wzbogacone w ekspresję genów powszechnie związanych z neurogenezą, migracją neuronów, chemotaksją i przewodnictwem aksonów3. Komórki śródbłonka okołokomorowego zawierają również nowy szlak sygnałowy GABA, który różni się od tradycyjnego neuronalnego szlaku sygnałowego GABA5. Stwierdzono, że równolegle z ekspresją genów komórki śródbłonka okołokomorowego regulują migrację i dystrybucję interneuronów GABA-ergicznych w rozwijającej się korze nowej. Podczas rozwoju embrionalnego komórki śródbłonka okołokomorowego przechodzą migrację na duże odległości wzdłuż gradientu brzuszno-grzbietowego, aby utworzyć okołokomorową sieć naczyniową2,3. Ta trasa migracyjna jest odtwarzana dzień później przez interneurony. Migrujące interneurony fizycznie oddziałują z wcześniej uformowaną siecią naczyniową okołokomorową i wykorzystują ją jako prowadnicę, aby dotrzeć do miejsca docelowego w korze nowej. Oprócz działania jako podłoże fizyczne, komórki śródbłonka okołokomorowego służą jako źródło wskazówek nawigacyjnych dla migrujących neuronów. GABA wydzielany przez komórki śródbłonka okołokomorowego kieruje migracją interneuronów i reguluje ich końcowe wzorce dystrybucji4. Defekty w migracji i dystrybucji między neuronami są związane z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, takimi jak autyzm, epilepsja, schizofrenia i depresja6,7,8,9,10. Dlatego badanie funkcji komórek śródbłonka okołokomorowego i ich wpływu na migrację interneuronów w kontekście człowieka staje się kluczowe dla zajęcia się patogenezą tych zaburzeń.

Z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wygenerowaliśmy ludzkie komórki śródbłonka przypominające okołokomorowe komórki macierzyste z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych11, używając technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)12,13. Aby sprawdzić, czy ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego wiernie naśladują komórki śródbłonka okołokomorowego myszy i ocenić ilościowo ich wpływ na migrację interneuronów, opracowaliśmy trzy testy in vitro: test migracji na duże odległości, test migracji kokulturowej i test przyciągania chemicznego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły dla tych testów. Wszystkie trzy testy opierają się na użyciu silikonowych wkładek hodowlanych w celu stworzenia małego prostokątnego płata komórek (o stałych wymiarach) otoczonego przestrzenią wolną od komórek. Odległość migracji jest obliczana poprzez pomiar odległości między końcowymi pozycjami komórek od granicy prostokątnego obszaru, który został nakreślony w dniu 0. W teście migracji na duże odległości ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego są wysiewane jako łata w środku szalki o średnicy 35 mm i obliczane są odległości przebyte przez komórki w długim okresie czasu. W teście migracji kokulturowej ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego są współwysiewane z ludzkimi interneuronami jako jeden plaster w naczyniu o średnicy 35 mm. Taki układ pozwala na zbadanie wpływu bezpośrednich oddziaływań fizycznych tych dwóch typów komórek na szybkość migracji interneuronów. Test chemoprzyciągania mierzy migrację interneuronów w odpowiedzi na sygnały chemoatrakcyjne wydzielane przez ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego. Interneurony są wysiewane jako prostokątna plama, z ludzkimi komórkami śródbłonka okołokomorowego i kontrolnymi komórkami śródbłonka nieokołokomorowymi osadzonymi jako łaty o podobnej wielkości po obu stronach. Każda z łat komórkowych jest oddzielona bezkomórkową szczeliną 500 μm. Odpowiedź interneuronów ocenia się poprzez ilościowe określenie liczby komórek, które migrowały w kierunku komórek śródbłonka okołokomorowego w porównaniu z kontrolnymi komórkami śródbłonka nieokołokomorowego.

Te testy dostarczają solidnej oceny funkcji ludzkich komórek śródbłonka okołokomorowego i ich wpływu na migrację międzyneuronów. Nowatorska konfiguracja testu długodystansowego i testu migracji kokultur zapewnia wolną od komórek przestrzeń w zakresie centymetrów (~1-1,5 cm), aby umożliwić wykrycie migracji na duże odległości. Podsumowanie cech naszych testów w porównaniu z innymi popularnymi testami przedstawiono w tabeli 1. Łącznie opisane tutaj testy posłużą jako platforma do oceny "chorych" komórek śródbłonka okołokomorowego i interneuronów generowanych z iPSC zaburzeń mózgu, takich jak schizofrenia, autyzm czy padaczka. Testy te można również wykorzystać do określenia, w jaki sposób różne warunki (np. inhibitory, ligandy, RNAi) wpływają na migrację komórek. Wreszcie, testy te można zoptymalizować pod kątem innych typów komórek w celu pomiaru migracji na duże odległości, przyciągania chemologicznego lub migracji za pośrednictwem komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla i przechowywanie ludzkich komórek śródbłonka okołokomorowego

  1. Utrzymuj ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej (patrz tabela materiałów) w pożywce dla komórek śródbłonka okołokomorowego (pożywka E6 zawierająca 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 i 5 μM GABA) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj medium co drugi dzień.
  2. Rozmrozić matrycę membrany podstawnej w temperaturze 4 °C i przygotować roztwór w stosunku 1:100, rozcieńczając go w zimnym podłożu DMEM/F12. Pokryj każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 1 ml roztworu matrycowego. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
  3. Pozwól, aby ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego osiągnęły zbieg 80%-90%. Odessać podłoże ze studni. Umyj studzienki raz 1 ml sterylnego 1x PBS na studzienkę.
  4. Odłączyć komórki, dodając 1 ml roztworu do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) do studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 5 minutach dodać 1 ml pożywki z komórek śródbłonka okołokomorowego. Przenieść roztwór komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Używamy tutaj Accutazy do dysocjacji komórek, w przeciwieństwie do TrypLE w sekcjach 3 i 4.
  5. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml okołokomorowej pożywki komórkowej śródbłonka.
  6. Policz żywe komórki przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego. Komórki nasienne na świeżych płytkach pokrytych matrycą o gęstości 1,2 x 105 komórek/cm2. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Przechowuj ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego przez krioprezerwację w pożywce zamrażającej (90% pożywki z komórek śródbłonka okołokomorowego i 10% DMSO).
    1. Oddziel i zbierz komórki, wykonując kroki 1.3 i 1.4 powyżej. Policz komórki w roztworze metodą wykluczania błękitu trypanowego.
    2. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w temperaturze 5 x 106 komórek/ml pożywki do zamrażania.
    3. Dozować 1 ml pożywki zamrażającej plus komórki na kriowial. Umieścić fiolki w komorze wypełnionej izopropanolem i schłodzić przez noc w temperaturze -80 °C w temperaturze 1 °C/min. Następnego dnia przenieść fiolki do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

2. Przygotowanie ludzkich komórek śródbłonka okołokomorowego do oznaczania

  1. Pozwól ludzkim komórkom śródbłonka okołokomorowego osiągnąć zbieżność 70%-80%.
  2. Dysocjuj komórki, wykonując kroki od 1.3 do 1.5, jak opisano powyżej. Policz komórki przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego.

3. Przygotowanie ludzkich interneuronów GABA-ergicznych do testu

UWAGA: Interneurony GABA-ergiczne pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) oraz pożywka neuronalna zostały zakupione komercyjnie (patrz Tabela Materiałów). Neurony są generowane przez różnicowanie linii iPSC pochodzącej z ludzkich fibroblastów zgodnie z protokołem opracowanym przez producenta. Komórki zostały rozmrożone i wyhodowane zgodnie z protokołem producenta.

  1. Rozmrozić ludzkie interneurony GABA-ergiczne i hodować je na 12-dołkowej płytce przez dwa tygodnie do konfluencji 70%-80%.
  2. W dniu przeprowadzenia testu należy sporządzić ciepły roztwór do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) i podwielokrotność pożywki neuronalnej w temperaturze 37 °C przez 10 minut przed użyciem.
  3. Odessać pożywkę z każdej studzienki zawierającej komórki. Umyj komórki 1 ml sterylnego 1x PBS na studzienkę.
  4. Odłączyć komórki, dodając 0,5 ml wstępnie podgrzanego roztworu dysocjacyjnego do studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 1 ml pożywki neuronalnej na studzienkę. Przenieść roztwór komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie rozcierać, aby dysocjować grudki komórek.
  5. Odwirować komórki przy 380 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki neuronalnej. Policz żywe komórki przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego.

4. Przygotowanie kontrolnych komórek śródbłonka ludzkiego do badania

UWAGA: Kontrolne ludzkie komórki śródbłonka pochodzące z iPSC oraz pożywka dla komórek śródbłonka zostały zakupione komercyjnie (Tabela materiałów). Te komórki śródbłonka są generowane przez różnicowanie linii iPSC pochodzącej z ludzkich fibroblastów do losu śródbłonka zgodnie z protokołem opracowanym przez producenta. Komórki rozmrożono i wyhodowano na podłożu fibronektyny zgodnie z protokołem producenta. Płytki pokryte fibronektyną zostały przygotowane zgodnie z protokołem producenta.

  1. Rozmrozić kontrolować ludzkie komórki śródbłonka i hodować je na 6-dołkowej płytce do zbiegu 80%-90%.
  2. W dniu wykonania testu należy sporządzić ciepły roztwór do dysocjacji komórek (zob. tabela materiałów) i podwielokrotność podłoża śródbłonka w temperaturze 37 °C przez 10 minut przed użyciem.
  3. Odessać pożywkę z każdej studzienki zawierającej komórki. Umyj komórki 1 ml sterylnego 1x PBS na studzienkę.
  4. Odłącz komórki, dodając 0,5 ml wstępnie podgrzanego roztworu dysocjacyjnego do studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 1 ml pożywki z komórek śródbłonka na studzienkę, aby zneutralizować roztwór dysocjacyjny. Przenieść roztwór komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  5. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z komórek śródbłonka. Policz żywe komórki przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego.

5. Przygotowanie jednostudzienkowych wkładek hodowlanych

  1. Rozmrozić 1 mg/ml roztworu lamininy w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Pokryj odpowiednią liczbę szalek o średnicy 35 mm 0,01% roztworem poli-L-ornityny (1 ml na miskę). Inkubować naczynia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć 1 mg/ml roztworu lamininy w stosunku 1:300 w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 3,3 μg/ml.
  4. Całkowicie odessać poli-L-ornitynę z każdego naczynia. Dokładnie spłucz każde naczynie 3x sterylną wodą i całkowicie odessać, aby uniknąć toksyczności komórkowej wywołanej poli-L-ornityną.
  5. Dodać 1 ml 3,3 μg/ml roztworu lamininy do każdego naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc lub co najmniej 1 godzinę. Usunąć roztwór lamininy z naczynia bezpośrednio przed użyciem.
    UWAGA: Alternatywnie, należy przechowywać naczynia zawierające lamininę w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zrównoważyć szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
  6. Wytnij trzy boki jednego dołka dwudołkowej silikonowej wkładki hodowlanej (Rysunek 1A) za pomocą sterylnego ostrza, aby wygenerować wkładkę jednodołkową (Rysunek 1B).
    UWAGA: Podczas cięcia należy mocno przymocować wkładkę dwudołkową do powierzchni oryginalnego opakowania, aby zapewnić gładkie cięcie i chronić przyczepność wkładki.
  7. Odessać roztwór lamininy z naczyń.
    UWAGA: Nie myj naczyń sterylnym PBS ani wodą po inkubacji lamininy. Wilgotne powierzchnie zapobiegną szczelnemu przyleganiu wkładki hodowlanej.
  8. Wyjmij wkładkę jednodołkową za pomocą sterylnej pęsety i umieść ją na środku naczynia pokrytego poli-L-ornityną/lamininą. Naciśnij wzdłuż krawędzi wkładki, aby przymocować ją do powierzchni naczynia.
  9. Ostrożnie odwróć naczynie do góry nogami, aby sprawdzić, czy wkładka jest mocno przylegająca.
  10. Trzymaj naczynie do góry nogami i zaznacz granicę komory wkładu za pomocą trwałego czarnego markera z ultracienką końcówką (Rysunek 1C).

6. Test migracji na duże odległości

  1. Zawiesić ludzkie interneurony GABA-ergiczne w stężeniu 3 x 104 komórek/70 μl pożywki neuronalnej. Wysiewaj 70 μl roztworu komórkowego w każdej jednodołkowej wkładce hodowlanej.
    UWAGA: Gęstość wysiewu interneuronów jest zgodna z zaleceniami producenta.
  2. Zawiesić ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego w stężeniu 3 x 104 komórek/70 μl pożywki z komórek śródbłonka okołokomorowego. Wysiewaj 70 μl roztworu komórkowego w każdej jednodołkowej wkładce hodowlanej.
    UWAGA: Liczba ludzkich komórek śródbłonka okołokomorowego wysianych w stosunku 1:1 do liczby neuronów z nasionami.
  3. Dodaj 1 ml pożywki neuronalnej do naczynia neuronowego, aby wypełnić obszar wokół wkładki i zapobiec wysychaniu powłoki. Podobnie dodać 1 ml pożywki z komórek śródbłonka okołokomorowego do naczynia na komórki śródbłonka okołokomorowego.
    UWAGA: Pożywkę dodawaj powoli wzdłuż krawędzi naczynia, aby wkładka nie została zakłócona.
  4. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nie wyciekają z komory wkładki.
  5. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 24 godzinach inkubacji sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są prawidłowo przyczepione i czy nie ma wycieku przez noc.
  6. Po 48 godzinach od wysiewu delikatnie wyjąć wkładkę za pomocą sterylnej pęsety. Sprawdź pod mikroskopem, czy warstwa komórkowa pozostaje nienaruszona (dzień 0).
  7. Usuń pożywkę z naczynia neuronowego i dodaj 1 ml świeżej pożywki neuronalnej. Podobnie usunąć pożywkę z naczynia na komórki śródbłonka okołokomorowego i dodać 1 ml świeżej pożywki z komórek śródbłonka okołokomorowego.
    UWAGA: Odłóż na bok wymaganą liczbę naczyń i napraw 4% PFA dla obrazów dnia 0.
  8. Inkubować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 5 dniach usuń pożywkę, utrwal komórki 4% PFA przez 10 minut i przemyj 3x 1x PBS.
  9. Barwienie neuronów anty-ludzką β-tubuliną lub przeciwciałem anty-ludzkim MAP2, a komórki śródbłonka przeciwciałem anty-ludzkim CD31. Pod koniec barwienia immunologicznego dodaj 1 ml pożywki do klejenia zapobiegającego blaknięciu do każdego naczynia.

7. Test migracji międzykulturowej

  1. Zawiesić 3 x 104 interneurony GABA-ergiczne i 3 x 104 ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego w 70 μl pożywki do kohodowli (50% pożywki okołokomorowej bez GABA i 50% pożywki neuronalnej). Zasiej ten roztwór komórkowy w komorze na wkładkę jednodołkową. Przygotuj odpowiednią liczbę takich naczyń testowych.
    UWAGA: GABA nie został dodany do pożywki kokulturowej, aby wykluczyć wpływ egzogennego GABA na migrację.
  2. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nie wyciekają z komory wkładki.
  3. Powoli dodawaj 1 ml pożywki do kokultury wzdłuż boku naczynia, aby zapobiec wysychaniu powłoki.
    UWAGA: Pożywkę dodawaj powoli wzdłuż krawędzi naczynia, aby wkładka nie została zakłócona.
  4. Jako pierwszą kontrolę, wysiewaj 3 x 104 ludzkie interneurony GABA-ergiczne tylko w 70 μl pożywki do kokultury na wkładkę jednodołkową. Przygotuj odpowiednią ilość takich potraw.
  5. Jako druga kontrola, współwysiewanie 3 x 104 ludzkich interneuronów GABA-ergicznych z 3 x 104 kontroluje ludzkie komórki śródbłonka w 70 μl pożywki do kohodowli na wkładkę jednodołkową. Przygotuj odpowiednią ilość potraw.
  6. Inkubować szalki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 24 godzinach inkubacji sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są prawidłowo przyczepione i czy nie ma wycieku.
  7. Po 48 godzinach od wysiewu delikatnie wyjąć wkładkę za pomocą sterylnej pęsety. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że warstwa komórkowa nie jest naruszona (dzień 0).
  8. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml świeżej pożywki do współhodowli.
    UWAGA: Odłóż na bok odpowiednią liczbę potraw na zdobycie zdjęć z dnia 0.
  9. Inkubować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  10. Po 5 dniach usuń pożywkę, utrwal komórki 4% PFA przez 10 minut i przemyj 3x 1x PBS.
  11. Wybarwić anty-ludzką β-tubuliną lub przeciwciałem anty-ludzkim MAP2, aby oznaczyć neurony. Pod koniec barwienia immunologicznego dodaj 1 ml pożywki do klejenia zapobiegającego blaknięciu do każdego naczynia.

8. Test przyciągania chemicznego

  1. Umieść trzydołkową wkładkę hodowlaną na środku naczynia o średnicy 35 mm pokrytego poli-L-ornityną/lamininą za pomocą sterylnej pęsety.
  2. Odwróć naczynie do góry nogami. Zaznacz granicę wokół środkowej komory wkładu za pomocą trwałego czarnego markera z ultracienką końcówką.
  3. Nasiona 3 x 104 ludzkie interneurony GABA-ergiczne w środkowym przedziale w 70 μl pożywki neuronalnej (Rysunek 3A).
  4. Zasiew 104 ludzkie komórki śródbłonka okołokomorowego w 70 μl pożywki dla komórek śródbłonka okołokomorowego i 104 komórki śródbłonka kontrolnego w 70 μl pożywki dla komórek śródbłonka w dwóch zewnętrznych przedziałach odpowiednio w dwóch zewnętrznych przedziałach (Rysunek 3A).
  5. Dodaj 1 ml pożywki do kohodowli (50% pożywki okołokomorowej bez GABA i 50% pożywki neuronalnej) wzdłuż boku naczynia, aby zapobiec wysychaniu powłoki na szalce.
  6. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki nie wyciekają z komory wkładki.
  7. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 24 godzinach inkubacji sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są prawidłowo przyczepione i czy nie ma wycieku.
  8. Po 48 godzinach od wysiewu delikatnie wyjąć wkładkę za pomocą sterylnej pęsety. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że warstwa komórkowa nie jest naruszona (dzień 0).
  9. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml świeżej pożywki do współhodowli.
    UWAGA: Odłóż na bok wymaganą liczbę potraw na dzień 0 obrazów.
  10. Inkubować komórki przez 36 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 36 godzinach odessać pożywkę, utrwalić komórki 4% PFA przez 10 min i przemyć 3x 1x PBS.
  11. Zabarwić ludzkie interneurony GABA-ergiczne anty-ludzką β-tubuliną lub przeciwciałem anty-ludzkim MAP2. Pod koniec procedury barwienia dodaj 1 ml pożywki do klejenia zapobiegającego blaknięciu do każdego naczynia.

9. Obrazowanie i analiza danych

  1. Umieść wybarwioną immunologicznie szalkę testową pod mikroskopem pod 4-krotnym powiększeniem.
  2. Zachowaj jedną dłuższą krawędź prostokątnej granicy (wykonanej w kroku 5.10 powyżej) w polu widzenia. Zrób zdjęcia komórek w wolnej od komórek przestrzeni przylegającej do tej granicy. Zdobądź obrazy wzdłuż prawej długiej krawędzi i lewej długiej krawędzi prostokątnej granicy (Rysunek 2B).
    UWAGA: Komórki umieszczone po przekątnej w stosunku do prostokąta nie są brane pod uwagę ze względu na niejednoznaczność w wyborze krótkiej lub długiej krawędzi jako znacznika początkowego. Ponadto liczba komórek migrujących przez krótszą krawędź jest często znacznie mniejsza (prawdopodobnie z powodu mniejszej liczby komórek początkowych wzdłuż krótkiej krawędzi) i nie jest brana pod uwagę.
  3. Otwórz obrazy w ImageJ. Oblicz odległość między każdą komórką a znakiem granicy (Rysunek 2D) za pomocą ImageJ.
  4. Aby ocenić migrację pod względem liczby komórek, ustaw określoną odległość od granicy na pozyskanym obrazie w ImageJ. Policz liczbę komórek, które znajdują się w tej odległości. Oblicz średnią liczbę, odchylenie standardowe i istotność statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kroki przygotowania wkładki hodowlanej z jedną studnią wewnątrz szalki 35 mm przedstawiono na Rysunku 1. W teście migracji długodystansowej oraz teście migracji w ko-kulturze zastosowano wkładkę z jedną studnią, aby wysiać odpowiednią liczbę komórek w centrum szalki 35 mm powleczonej poli-L-ornityną/lamininą. W dniu 0 komórki występowały w postaci prostokątnej plamy (Rysunek 2A,C). Na obrazach z dnia 0 linię dnia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy trzy testy in vitro, które razem zapewniają ilościową ocenę właściwości specyficznych dla komórek śródbłonka człowieka okołokomorowego. Testy te będą cenne w uzyskaniu mechanistycznego wglądu w interakcję ludzkich komórek śródbłonka okołokomorowego z ludzkimi interneuronami. Eksperymenty z użyciem ligandów, inhibitorów lub komórek z specyficznym dla genu knockdownem lub nadekspresją zidentyfikują lub zweryfikują graczy molekularnych, którzy pośredniczą w migracji interneuronów kierowanej przez ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta nagrodami od National Institute of Mental Health (R01MH110438) oraz National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) dla AV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór dysocjacyjny AccutazyMillipore SigmaSCR005Roztwór do dysocjacji komórek (dla komórek śródbłonka okołokomorowego, krok 1.4)
Przeciwciało anty-ludzkie β-tubulinoweBiolegend802001
Przeciwciało anty-ludzkie CD31Przeciwciało Millipore SigmaCBL468
Przeciwciało anty-MAP2NeuromicsCH22103
Antyaktywne przeciwciało przeciwko kaspazie 3Millipore SigmaAB3623
Kontroluj ludzkie komórki śródbłonkaDynamika komórkowaR1022
Kontroluj komórki śródbłonka Średni suplementDynamika komórkowaM1019
Fiolki kriogeniczneFisher Scientific03-337-7Y
DMEMF/12 średnieThermofisher Scientific11320033
DMSOSigma-AldrichD2650
E6 średniThermofisher ScientificA1516401
FGF2Thermofisher ScientificPHG0261
FibronectinThermofisher Scientific33016-015
Pojemnik do zamrażaniaThermofisher Scientific5100
GABASigma-AldrichA2129
HemacytometrSigma-AldrichZ359629
Ludzkie neurony GABA-ergiczneDynamika komórkowaR1013
Podłoże podstawowe ludzkich neuronów GABA-ergicznychDynamika komórkowaM1010
Ludzki neuron GABA-ergiczny Suplement neuronowyDynamika komórkowaM1032
LamininSigmaL2020
MatrigelCorning356230Matryca membranowa podstawna
Medium montażoweLaboratoria wektoroweH-1200
poli-L-ornitynaSigmap4957
PBSThermofisher Scientific14190
Trypan niebieskiThermofisher Scientific15250061
TrypLEThermofisher Scientific12563011Roztwór do dysocjacji komórek (dla interneuronów GABA-ergicznych i komórek śródbłonka, sekcje 3 i 4)
VEGF-APeprotech100-20
VascuLife VEGF Medium Kompletny zestawLifeline Cell TechnologiesLL-0003Składnik kontrolny pożywki dla ludzkich komórek śródbłonka
2-dołkowa hodowla silikonowa-Insertibidi80209
3-dołkowy silikon culture-Insertibidi80369
35 mm czaszaCorning430165
15-ml stożkowa probówkaFisher Scientific07-200-886
4% roztwór PFAFisher ScientificAAJ19943K2
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowychFisher Scientific14-832-11
Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazamiZeissZeiss Axiovert 40C
OlympusFSX-100
Mikroskop fluorescencyjny

Bibliografia

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
  3. Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149(2013).
  4. Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
  5. Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
  6. Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
  7. Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
  8. Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
  9. Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
  10. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
  11. Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
  12. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  13. Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
  14. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
  15. Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
  16. JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  17. Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356(2016).
  18. Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  19. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  20. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
  21. Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
  22. Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie kom rki r db onka oko odomowegointerneurony GABAergicznetest migracjitest kokulturytest chemoatrakcjimigracja kom rekizolacja kom rekmetoda wykluczania b kitu trypanubarwienie immunocytochemicznezaburzenia neuropsychiatryczne
Testy migracji, chemoprzyciągania i kohodowli komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.