Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60297

⸱

8 stycznia 2020

 ,  , 
1Progenesis Technologies, LLC, 2Department of Biomedical Sciences, Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine at Marshall University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy prosty i powtarzalny protokół mysiego modelu infekcji do oceny osłabienia genetycznie zmodyfikowanych szczepów Pseudomonas aeruginosa w porównaniu z zatwierdzonymi przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) Escherichia coli do zastosowań komercyjnych.

Streszczenie

Mikroorganizmy są genetycznie wszechstronne i różnorodne, stały się głównym źródłem wielu produktów komercyjnych i biofarmaceutyków. Chociaż niektóre z tych produktów są naturalnie wytwarzane przez organizmy, inne produkty wymagają inżynierii genetycznej organizmu w celu zwiększenia wydajności produkcji. Szczepy awirulentowe Escherichia coli są tradycyjnie preferowanymi gatunkami bakterii do produkcji biofarmaceutyków; jednak niektóre produkty są trudne do wyprodukowania przez E. coli. W związku z tym awirulentne szczepy innych gatunków bakterii mogą stanowić użyteczną alternatywę dla produkcji niektórych produktów komercyjnych. Pseudomonas aeruginosa jest powszechną i dobrze przebadaną bakterią Gram-ujemną, która może stanowić odpowiednią alternatywę dla E. coli. Jednak P. aeruginosa jest oportunistycznym ludzkim patogenem. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę, którą można wykorzystać do generowania niepatogennych szczepów P. aeruginosa poprzez sekwencyjne delecje genomowe przy użyciu plazmidu pEX100T-NotI. Główną zaletą tej metody jest uzyskanie szczepu wolnego od markerów. Metoda ta może być stosowana do wytwarzania wysoce osłabionych szczepów P. aeruginosa do produkcji produktów komercyjnych lub do projektowania szczepów do innych specyficznych zastosowań. Opisujemy również prosty i powtarzalny mysi model bakteryjnej infekcji ogólnoustrojowej poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie zwalidowanych szczepów testowych w celu zbadania osłabienia genetycznie zmodyfikowanego szczepu w porównaniu z zatwierdzonym przez FDA szczepem BL21 E. coli.

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa to oportunistyczny patogen bakteryjny, który może powodować choroby zagrażające życiu u ludzi, zwłaszcza u osób z obniżoną odpornością. Chorobotwórczość P. aeruginosa wynika z ekspresji wielu czynników wirulencji, w tym proteaz i lipopolisacharydu, a także z jego zdolności do tworzenia ochronnego biofilmu1. Ze względu na jego zdolność do wytwarzania czynników wirulencji i wywoływania chorób u ludzi, stosowanie P. aeruginosa do wytwarzania produktów komercyjnych stwarza obawy dotyczące bezpieczeństwa. Niepatogenne szczepy E. coli są tradycyjnie wykorzystywane do bioinżynierii produktów medycznych i komercyjnych przeznaczonych do stosowania u ludzi. Jednak niektóre produkty są trudne do wytworzenia przez E. coli, a wiele z nich jest pakowanych w korpusy inkluzyjne, co sprawia, że ekstrakcja jest pracochłonna. Zmodyfikowane szczepy bakteryjne zdolne do wytwarzania i wydzielania określonych produktów są wysoce pożądane, ponieważ wydzielanie prawdopodobnie zwiększyłoby wydajność i ułatwiło procesy oczyszczania. Tak więc niepatogenne szczepy innych gatunków bakterii (np. Gatunki, które wykorzystują więcej ścieżek wydzielania) mogą stanowić użyteczną alternatywę dla E. coli. Niedawno informowaliśmy o rozwoju szczepu P. aeruginosa, PGN5, w którym patogenność i toksyczność organizmu jest wysoce osłabiona2. Co ważne, szczep ten nadal wytwarza duże ilości alginianu polisacharydów, interesującego z handlowego punktu widzenia składnika biofilmu P. aeruginosa.

Szczep PGN5 został wygenerowany przy użyciu dwuetapowej procedury wymiany allelicznej z plazmidem pEX100T-NotI w celu sekwencyjnego usunięcia pięciu genów (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA), o których wiadomo, że przyczyniają się do patogeniczności organizmu. pEX100T-NotI został wygenerowany przez zmianę SmaI na miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego NotI w obrębie miejsca wielokrotnego klonowania plazmidu pEX100T, który został opracowany w lab3,4. Miejscem rozpoznania enzymu restrykcyjnego NotI jest rzadsza sekwencja DNA w porównaniu z SmaI i mniej prawdopodobne jest, że będzie obecna w klonowanych sekwencjach, dlatego jest wygodniejsza do celów klonowania. Plazmid zawiera geny, które pozwalają na selekcję, w tym gen bla, który koduje ß-laktamazę i nadaje odporność na karbenicylinę, oraz gen B. subtilissacB, który nadaje wrażliwość na sacharozę (ryc. 1A). Plazmid ma również początek replikacji (ori) zgodny z E. coli oraz początek transferu (oriT), który pozwala na transfer plazmidu z E. coli do gatunków Pseudomonas poprzez koniugację. Jednak plazmid nie ma początku replikacji zgodnego z Pseudomonas, a zatem nie może się replikować w obrębie gatunku Pseudomonas (tj. jest wektorem samobójczym Pseudomonas). Te cechy sprawiają, że pEX100T-NotI idealnie nadaje się do celowania w delecje genetyczne z chromosomu Pseudomonas. Etapy klonowania plazmidu przeprowadza się przy użyciu E. coli, a powstały plazmid jest przenoszony do Pseudomonas przez transformację lub koniugację. Następnie, poprzez homologiczne zdarzenia rekombinacji i selektywne etapy, generowana jest ukierunkowana delecja w ramce, wolna od markerów. Ta metoda sekwencyjnego usuwania regionów genomowych z chromosomu P. aeruginosa może być wykorzystana do generowania wysoce atenuowanych szczepów Pseudomonas, takich jak PGN5, lub do projektowania szczepów do innych specyficznych zastosowań (np. szczepów z niedoborem endonukleaz do namnażania plazmidu lub szczepów z niedoborem proteaz do produkcji białek będących przedmiotem zainteresowania).

Ogólna zjadliwość szczepów bakterii zależy od warunków i faz wzrostu, podczas których mutacje występują często. Dlatego pomiar bezpieczeństwa genetycznie modyfikowanych szczepów może być wyzwaniem. Aby ocenić izolaty bakteryjne pod kątem zjadliwości ogólnoustrojowej, dostosowaliśmy wcześniej opublikowany protokół infekcji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie myszy C57BL / 6 5. Zmodyfikowaliśmy tę procedurę, aby użyć zamrożonych wywarów bakteryjnych do wstrzykiwań, co pozwoliło na precyzyjne dozowanie i łatwą walidację użytych szczepów. W tym modelu szczep E. coli BL21, który został zatwierdzony przez FDA do produkcji biofarmaceutyków, został wykorzystany jako standard bezpieczeństwa kontroli do określenia względnej patogenezy szczepu6,7,8. Główną zaletą stosowania tej metody jest to, że jest ona powtarzalna i minimalizuje źródła zmienności, ponieważ infekujące szczepy są walidowane pod kątem liczby komórek bakteryjnych, fenotypu i markerów genetycznych zarówno przed, jak i po zakażeniu. Dzięki tym kontrolowanym krokom zmniejsza się liczba wymaganych zwierząt. W tym modelu szczepy P. aeruginosa, które powodują śmiertelność myszy C57BL/6 równą lub mniejszą niż E. coli BL21 po wstrzyknięciu dootrzewnowym, można uznać za atenuowane. Ten prosty mysi model infekcji może być również wykorzystany do oceny osłabionej patogenności genetycznie modyfikowanych szczepów innych gatunków, wykorzystując zatwierdzony przez FDA szczep E. coli jako punkt odniesienia. Kroki 1-7 szczegółowo opisują generowanie sekwencyjnych delecji genomowych u P. aeruginosa (ryc. 1), a kroki 8-12 szczegółowo opisują wykorzystanie modelu mysiego do badania patogenności szczepów P. aeruginosa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przed rozpoczęciem eksperymentów na zwierzętach, protokół, który ma być użyty, musi zostać zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Zatwierdzenie opisanego protokołu uzyskano za pośrednictwem IACUC na Uniwersytecie Marshalla (Huntington, WV, USA).

1. Projekt plazmidu

  1. Aby wygenerować delecję genetyczną za pomocą plazmidu pEX100T-NotI, sklonuj regiony DNA flankujące żądaną sekwencję delecji i wstaw do miejsca restrykcji NotI plazmidu. Wstawka plazmidowa powinna zawierać około 500 nukleotydów przed sekwencją docelową bezpośrednio przylegającą do około 500 nukleotydów poniżej docelowej sekwencji delecyjnej. Dodatkowo wkładka powinna zawierać sekwencję rozpoznawania NotI (GCGGCCGC) na końcach 5' i 3' (Rysunek 1B).

2. Przygotowanie plazmidu

  1. Opcja 1: Wykorzystaj tradycyjne procedury klonowania. Użyj PCR do amplifikacji regionów genomowych przed i za genem będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie do crossover PCR9,10, aby połączyć wygenerowane fragmenty, trawienie endonukleazą restrykcyjną produktu PCR i plazmidu oraz ligacja11 (Rysunek 1B,C).
  2. Opcja 2: Po zaprojektowaniu sekwencji delecji in silico, zleć firmie de novo jej syntezę wstawienie do plazmidu pEX100T-NotI. Wiele firm usprawniło proces klonowania, aby szybko i wydajnie wygenerować interesujący nas plazmid. Dodatkowo sekwencja weryfikuje, czy plazmidy są wolne od mutacji przed dostawą.

3. Transformacja E. coli

  1. Przekształć elektrokompetentną E. coli z plazmidem zgodnie z zaleceniami producenta. Używając sterylnej pętli zaszczepiającej, nanieść 10 μl reakcji przemiany dla izolowanych kolonii na wstępnie podgrzaną płytkę agarową Luria Bulion (LB) uzupełnioną 100 μg/ml karbenicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Cały sprzęt i pożywki używane do hodowli bakterii powinny być traktowane zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa.
  2. Przejazd dwa razy.
    1. Wyjąć płytkę z inkubatora i zidentyfikować izolowaną kolonię. Używając sterylnej pętli zaszczepiającej, podnieś kolonię i nałóż na wstępnie podgrzaną płytkę agarową LB uzupełnioną 100 μg/ml karbenicyliny dla izolowanych kolonii. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Powtórzyć ten krok jeszcze raz, aby uzyskać czystą kulturę.
  3. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, zaszczepić 5 ml LB pojedynczą kolonią z końcowej płytki agarowej. Umieścić kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C na noc. Następnego dnia wymieszaj 1 ml tej kultury z 1 ml 5% w kriowiale i przechowuj w temperaturze -80 °C, aby wytworzyć zamrożony wywar ze szczepu.

4. Przygotowanie szczepu bakteryjnego i koniugacja trójrodzicielska

  1. Użyć pojedynczej izolowanej kolonii z płytek agarowych następujących szczepów do zaszczepienia kultur bulionowych i umieścić na noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.
    1. Dodaj E. coli pEX100T-NotI do 5 ml LB uzupełnionego 100 μg/ml karbenicyliny.
    2. Dodaj szczep PAO1 P. aeruginosa do 5 ml bulionu izolacyjnego Pseudomonas (PIB).
    3. Dodaj E. coli prk2013 do 5 ml LB uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyny.
      UWAGA: Plazmid prk2013 jest plazmidem pomocniczym, który replikuje się w E. coli, ale nie w P. aeruginosa; przenosi transaktywne geny transferowe, które mobilizują plazmid pEX100T-NotI od dawcy E. coli do biorcy P. aeruginosa12. P. aeruginosa jest patogenem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Prosimy o przestrzeganie wytycznych instytucji dotyczących bezpieczeństwa podczas pracy z organizmami BSL-2.
  2. Następnego dnia wyjmij nocne kultury z inkubatora i dodaj 0,5 ml każdej kultury do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 6 000 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i zawiesić osad komórkowy w 50-100 μl LB.
  3. Odpipetować całą zawiesinę komórek w jednej kropli na wstępnie podgrzaną płytkę agarową LB. Pozostaw kroplę do wyschnięcia. Następnie odwrócić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin.
  4. Po inkubacji użyj sterylnej pętli inokulacyjnej, aby zebrać komórki do 1 ml LB w probówce do mikrowirówki. Pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać komórki.
  5. Za pomocą rozsiewacza komórek równomiernie rozprowadź smugi na suchej, wstępnie podgrzanej płytce z agarem izolacyjnym Pseudomonas (PIA) uzupełnionej 300 μg/ml karbenicyliny. Na wielu płytkach należy nakładać smugi z rosnącą objętością mieszaniny komórek (np. 10 μl, 100 μl, 500 μl). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

5. Wykrywanie pojedynczych krzyżowych rekombinantów P. aeruginosa

  1. Wyjąć płytki z inkubatora i sprawdzić, czy nie ma wyizolowanych kolonii opornych na karbenicylinę. Ponieważ plazmid pEX100T-NotI nie może replikować się w P. aeruginosa, kolonie, które rosły na płytkach uzupełnionych karbenicyliną, powinny powstać z komórek, w których plazmid był zintegrowany z chromosomem.
    1. Wybierz co najmniej 4 z tych kolonii i przenieś je do izolacji na wstępnie podgrzane płytki PIA uzupełnione 300 μg/ml karbenicyliny. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź, czy nie rosną. Kolonie oporne na karbenicylinę powinny być rekombinantami jednokrzyżowymi (tj. włączyły plazmid do chromosomu poprzez zdarzenie rekombinacji między homologicznym regionem wstawki plazmidowej a chromosomem P. aeruginosa).
    1. Umieść 8 lub więcej kolonii sterylnymi wykałaczkami na wstępnie podgrzanych płytkach: 1) PIA uzupełnionej 300 μg/ml karbenicyliny i 2) PIA uzupełnionej 300 μg/ml karbenicyliny i 10% sacharozy (bez glicerolu).
    2. Jeśli nie uzyskano wzrostu kolonii z kroku 5.1, powtórz koniugację i zwiększ objętość mieszaniny komórek utworzonej w kroku 4.5. Jeśli nastąpił zbyt duży wzrost, powtórz koniugację i zmniejsz objętość smug.
    3. Jeśli koniugacja wielokrotnie się nie powiedzie, przygotuj elektrokompetentne komórki szczepu P. aeruginosa i przetransformuj je bezpośrednio z plazmidem pEX100T-NotI. Szczegółowe protokoły przygotowania elektrokompetentnego P. aeruginosa i transformacji są dostępne gdzie indziej13,14.
  3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  4. Wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź, czy nie rosną. Prawdziwe rekombinanty z pojedynczym krzyżowaniem będą odporne na karbenicylinę i wrażliwe na sacharozę (tj. Kolonie, które rosły na PIA uzupełnionym karbenicyliną, ale nie rosły na PIA uzupełnionym karbenicyliną i sacharozą).
    1. Wybierz 4 lub więcej prawdziwych rekombinantów z pojedynczą krzyżówką i zaszczepij każdy z nich w 5 ml LB bez selekcji. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc.
    2. Jeśli nie wykryto rekombinantów z pojedynczym skrzyżowaniem, powtórzyć koniugację.

6. Wykrywanie podwójnie krzyżowanych rekombinantów P. aeruginosa

  1. Dla każdej kultury bulionowej zaszczepij 10 μl kultury na wstępnie podgrzanej płytce PIA uzupełnionej 10% sacharozą (bez glicerolu) i smugą dla izolowanych kolonii. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Następnego dnia wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź je pod kątem wzrostu. Kolonie odporne na sacharozę powinny być rekombinantami podwójnie krzyżowymi (tj. usunąć plazmid z chromosomu poprzez zdarzenie rekombinacji między innym homologicznym regionem wstawki plazmidu a chromosomem P. aeruginosa).
    1. Nałóż co najmniej 20 kolonii sterylnymi wykałaczkami na wstępnie podgrzane płytki: 1) PIA, 2) PIA uzupełnione 10% sacharozą (bez glicerolu) i 3) PIA uzupełnione 300 μg/ml karbenicyliny.
  3. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. Wyjmij płytki z inkubatora i zbadaj je pod kątem wzrostu. Prawdziwe rekombinanty podwójnie krzyżowe będą wrażliwe na karbenicylinę i odporne na sacharozę (tj. kolonie, które rosły na PIA i PIA uzupełnione sacharozą, ale nie rosły na PIA uzupełnione karbenicyliną).

7. Potwierdzenie delecji genu za pomocą Colony PCR

  1. Przygotuj 10-20 kolonii do ekranu usuwania za pomocą PCR.
    1. Pobrać wzrost z podejrzanego rekombinantu podwójnie krzyżowego za pomocą sterylnej wykałaczki i zawiesić komórki w 50 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Gotować zawiesinę w temperaturze 100 °C przez 10 minut, wirować przez 3 minuty przy 13 000 x g, a następnie umieścić na lodzie.
  2. Wykonaj PCR, aby przebadać kolonie pod kątem docelowej usunięcia.
    1. Użyć 1 μl supernatantu jako matrycy w 25 μl reakcji PCR, aby potwierdzić delecję genu będącego przedmiotem zainteresowania.
    2. Użyj starterów specyficznych dla genu, które amplifikują region delecji genomowej. Użyj starterów, które amplifikują region delecji genomowej oraz 100-200 pz sekwencji flankujących w górę i w dół.
    3. Przygotować oddzielną kontrolną reakcję PCR ze szczepem macierzystym (np. PAO1).
      UWAGA: Warunki termocyklera będą się różnić w zależności od optymalnej temperatury wyżarzania dla par starterów, użytego koktajlu polimerazy i długości obszaru, który ma być amplifikowany.
  3. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym na produktach PCR. Kolonie, w których obszar zainteresowania został usunięty, dają mniejsze produkty amplifikacji niż kolonie, które nie mają delecji (Rysunek 2).
  4. Wybierz jedną lub więcej kolonii z delecją potwierdzoną przez PCR. Umieść izolowane kolonie na wstępnie podgrzanej płytce PIA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Przejście przynajmniej jeszcze raz. Wyjąć płytkę (płytki) z inkubatora i zidentyfikować odizolowaną kolonię. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, podnieś kolonię i rozprowadź wstępnie podgrzaną płytkę agarową PIA dla izolowanych kolonii. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  6. Wybierz kolonię z każdej końcowej płytki i użyj do zaszczepienia 5 ml PIB. Umieścić na noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.
    1. Wymieszaj 1 ml tej kultury z 1 ml 5% odtłuszczonego mleka w kriowiale i przechowuj w temperaturze -80 °C, aby wytworzyć zapas szczepu.
    2. Korzystając z tej hodowli, przygotuj genomowe DNA ze szczepu (np. przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA). Amplifikuj region delecji genomowej za pomocą PCR i starterów specyficznych dla regionu zainteresowania.
      1. Oczyść te produkty PCR (np. za pomocą zestawu do oczyszczania DNA lub ekstrakcji fenolowo-chloroformowej) i albo sekwencjonuj bezpośrednio za pomocą starterów specyficznych dla genu, albo zliguj do wektora w celu sekwencjonowania za pomocą starterów specyficznych dla plazmidu.
  7. Po potwierdzeniu delecji genu poprzez sekwencjonowanie, powtórz tę procedurę z nowym szczepem delecji, aby sekwencyjnie wygenerować liczne delecje genomowe bez markerów. Po wygenerowaniu pożądanego szczepu należy zastosować sekwencjonowanie całego genomu, aby zweryfikować docelowe delecje i wykryć inne zmiany w genomie (w porównaniu ze szczepem referencyjnym, np. PAO1), które wystąpiły w trakcie procesu. Po adnotacjach genów zdeponuj sekwencję w GenBank i zapisz numery akcesyjne.

8. Przygotowanie szczepu bakteryjnego do testów na zwierzętach

  1. Aby przetestować osłabioną patogenność szczepów P. aeruginosa, należy najpierw przygotować zwalidowane kultury i stada. Przygotuj interesujące szczepy P. aeruginosa, szczep P. aeruginosa typu dzikiego (zjadliwy) i zatwierdzony przez FDA szczep E. coli (np. BL21), które będą służyć jako niepatogenna kontrola bezpieczeństwa.
  2. Szczepy badanych bakterii należy umieścić na selektywnym agarze z sekwencjonowanych i zwalidowanych zamrożonych wywarów. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Za pomocą sterylnej pętli zaszczepiającej wybierz pojedynczą kolonię z każdego szczepu i ponownie przenieś izolowane kolonie na selektywne podłoża. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  4. Wyjąć płytki z inkubatora. Dla każdego szczepu wybierz pojedynczą kolonię i smugę do izolacji na płytkach LB.
  5. Po 24 godzinach wzrostu w temperaturze 37 °C zaszczepić kolbę o pojemności 500 ml zawierającą 250 ml LB pojedynczym izolatem kolonii z każdego szczepu.
    1. Etap walidacji: wykorzystując pozostałości tej samej kolonii, zwaliduj szczep za pomocą PCR i starterów specyficznych dla szczepu i/lub starterów w celu zweryfikowania obecności modyfikacji genetycznych dokonanych w szczepie. Poniższe startery służą do weryfikacji odkształceń w przedstawionym przykładzie:
      Bakteria E. coli BL21:
      Polimeraza T7 F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
      Polimeraza T7 R: TTACGCGAACGCGAAGTCC

      VE2 oraz PGN5:
      aroA (Szanowny Panie) F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
      aroA (Szanowny Panie) R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
  6. Inkubować kultury w inkubatorze z wytrząsaniem przy prędkości 160 obr./min i temperaturze 37 °C, aż osiągną wzrost w fazie logarytmicznej (tj. pomiar OD600 0,4-0,6 na spektrofotometrze).
  7. Korzystając z wartości OD600 uzyskanej po osiągnięciu fazy logarytmicznej, oblicz objętość bulionu potrzebną do uzyskania 2,5 x 109 jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml. Objętość bulionu obliczoną w probówkach o pojemności 50 ml przy 4 500 x g przez 10 minut.
  8. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednej probówce, używając 50 ml 1x PBS do przepłukania komórek. Ponownie odwirować przy 4 500 x g przez 10 min.
  9. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml 5% odtłuszczonego mleka w 1x PBS.
    1. Etap walidacji: Użyj próbki 25 ml zawiesiny, aby przeprowadzić żywotne zliczanie płytek w celu określenia liczby jtk/ml.
  10. Podwielokrotną reprodukcję 25 ml odtłuszczonych kultur mleka należy zawiesić do 2 ml bulionów hodowlanych w 2 ml kriowialiach. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C co najmniej przez noc przed użyciem.

9. Walidacja wzrostu i wytworzenia zapasów przechowywanych do testów na zwierzętach.

  1. Dla każdego szczepu, który ma być badany, należy usunąć co najmniej 3 kriowiale zamrożonych zapasów z przechowywania w temperaturze -80 °C i rozmrażać w temperaturze 4 °C przez 2-4 godziny. Jeżeli pozostał zamrożony bulion, ogrzać go krótko w temperaturze 37 °C.
  2. Weź małe próbki z każdego kriowialu, aby zwalidować każdy szczep.
    1. Wykonaj żywotne liczenie płytek, aby określić liczbę CFU/ml. To normalne, że po zamrożeniu ma mniej jtk/ml z powodu śmierci niektórych komórek bakteryjnych.
    2. Użyj PCR i starterów specyficznych dla szczepu, aby zwalidować każdy szczep.
    3. Umieść każdy szczep na selektywnych pożywkach, aby zweryfikować fenotyp.
  3. Po potwierdzeniu, że szczepy mają prawidłowy genotyp i fenotyp oraz walidacji CFU/ml, przystąp do testów na zwierzętach.

10. Szczepienie zwierząt szczepami bakteryjnymi przez wstrzyknięcie

  1. Rano w dniu wstrzyknięcia należy usunąć kriowiale badanych szczepów bakteryjnych i rozmrażać je w temperaturze 4 °C przez 3-4 godziny. Rozmrozić 0,5 ml dla każdej myszy, która zostanie wstrzyknięta. Po rozmrożeniu fiolki należy przechowywać na lodzie i wstrzyknąć myszom w ciągu 2 godzin.
  2. Po rozmrożeniu przenieść każdy kriowial do nowej probówki o pojemności 2 ml i odwirować przy 4,500 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x PBS.
  3. Odwirować ponownie przy 4 500 x g przez 10 m. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1x PBS do końcowego stężenia 2,5 x 109 jtk/ml. Aby określić ilość 1x PBS potrzebną do ponownego zawieszenia, należy użyć danych CFU/ml uzyskanych z żywotnej liczby płytek na zamrożonych materiałach w kroku 2.2.1. Dokładna ilość użytego 1x PBS będzie się nieznacznie różnić w zależności od szczepu.
    1. Pobrać 3 próbki z końcowej zawiesiny każdego szczepu, aby zwalidować CFU/ml, genotyp i fenotyp, jak opisano powyżej.
  4. Dla każdego szczepu należy podać 1,5 ml zawiesiny PBS/komórkę do jednej probówki o pojemności 2 ml na 5 myszy, aby ograniczyć liczbę włożenia probówki. Należy również przygotować probówki z 1x PBS do wstrzyknięć kontrolnych.
  5. Zbierz myszy (10 samców i 10 samic C57BL/6 na grupę w tym eksperymencie) i materiały potrzebne do wstrzykiwań (strzykawki, igły, pojemniki na ostre przedmioty, markery, długopis i papier itp.). Przenieś się do sterylnej sali operacyjnej dla zwierząt. Wytrzyj wszystkie powierzchnie chusteczkami odkażającymi.
    1. Aby wyeliminować stres i ryzyko zranienia eksperymentatora, przyprowadź tylko jedną płeć i grupę eksperymentalną myszy do sali operacyjnej na raz (np. grupę 10 samców myszy, które mają zostać zarażone określonym szczepem). Noś dwie pary rękawic lateksowych, aby wyeliminować przebicie rękawic w przypadku ugryzienia. Noś fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maskę na twarz, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  6. Rozpocząć wstrzykiwanie grupy kontrolnej od 1x PBS. Pozwoli to ustalić, czy jakiekolwiek działania niepożądane wynikają z samego wstrzyknięcia.
    1. Wyjmij mysz z klatki. Usuwaj tylko jedną mysz na raz.
    2. Zważ mysz i oznacz jej ogon trwałym markerem, aby śledzić utratę wagi po wstrzyknięciu.
    3. Otwórz nową strzykawkę o pojemności 1 ml i igłę 27 G (użyj nowej strzykawki i igły dla każdej myszy, aby wyeliminować zanieczyszczenie) i wstrzyknąć 200 μl sterylnego 1x PBS.
      1. Chwyć mysz za uszami za pomocą kciuka i palca wskazującego. Uszczypnij, aby utworzyć fałd skórny na karku, aby się go trzymać - ciaśniejszy fałd zmniejsza ruchy szyi i ryzyko ugryzienia podczas wstrzyknięcia. Przymocuj ogon do dłoni za pomocą małego palca, aby utrzymać mysz płasko przy niewielkim ruchu.
      2. Odwróć mysz i włóż igłę pod kątem 30° do jamy otrzewnej po lewej lub prawej stronie linii środkowej. Po wkłuciu igły należy lekko unieść, aby upewnić się, że została wprowadzona w obszar dootrzewnowy, a nie do narządów. Powoli wstrzyknąć PBS, a następnie wyjąć igłę.
      3. Umieść zużytą igłę w wyznaczonym pojemniku na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne. Nie używać ponownie strzykawki lub igły. Typowy jest bolus w miejscu wstrzyknięcia.
    4. Po wstrzyknięciu należy przenieść mysz do osobnej klatki.
    5. Powtórz procedurę z następną myszką. Po wstrzyknięciu wszystkich myszy z jednej klatki należy natychmiast umieścić je z powrotem w pierwotnej klatce.
  7. Po wstrzyknięciu grupy kontrolnej należy rozpocząć wstrzykiwanie zawiesin szczepów, które mają być badane, postępując zgodnie z tą samą procedurą.
    1. Wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórek. Zaczynając od zawiesin komórkowych 2,5 x 109 CFU/ml, każda mysz otrzymuje 5 x 108 CFU.
      UWAGA: Stężenia te zostały zoptymalizowane na podstawie wstępnych badań na zwierzętach w celu określenia śmiertelnych dawek każdego szczepu. Może być konieczne dostosowanie dawkowania do innych szczepów/gatunków.
  8. Po zakończeniu wszystkich wstrzyknięć należy zwrócić myszy do pomieszczenia mieszkalnego, aby złagodzić stres. Oczyść miejsce pracy chusteczkami odkażającymi.
  9. Monitorować zwierzęta pod kątem śmiertelności po wstrzyknięciu, sprawdzając klatki pod kątem martwych myszy co 3 godziny przez 72 godziny i co 12 godzin przez 10 dni. Rejestruj wagę myszy co 12 godzin, aby określić utratę wagi z powodu choroby.
  10. Rejestruj niepożądane zachowania w ciągu kilku godzin po wstrzyknięciu, takie jak różnica w postawie, brak pielęgnacji lub zakopywania się, unieruchomienie lub zmiany w oddychaniu. Myszy, które umierają w wyniku obrażeń związanych z wstrzyknięciem, będą wykazywać niepożądane zachowanie i szybko umrą po wstrzyknięciu. Z drugiej strony, myszy, które umrą w wyniku infekcji, nie zaczną wykazywać niepożądanych zachowań lub śmierci do 18 godzin. Wszystkie myszy, które wykazują niepożądane zachowanie lub rozległe oznaki zachorowalności, w tym szybkie lub ciężkie oddychanie, unieruchomienie, zgarbioną postawę, zapadnięte oczy, poważne odwodnienie lub inne, powinny zostać poddane eutanazji w celu zmniejszenia niepotrzebnego cierpienia (zgodnie z naszymi zatwierdzonymi protokołami IACUC). Jednak w naszych eksperymentach eutanazja nie była wymagana dla żadnych myszy podczas eksperymentu. Myszy, które przeżyły, zostały poddane eutanazji 10 dni po zakończeniu testów.
  11. Po upływie 10-dniowego okresu monitorowania należy pozwolić pozostałym zwierzętom w pełni wyzdrowieć i uwolnić się od wszelkich zakażeń podanych podczas badania. Eutanazja zwierząt zgodnie z procedurą IACUC.

11. Analiza statystyczna śmiertelności zwierząt

  1. Wykonuj analizę statystyczną za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów. Odpowiednie jest każde oprogramowanie zdolne do tworzenia wykresów i przeprowadzania analiz statystycznych.
  2. Aby wykreślić dane dotyczące śmiertelności, użyj kolumny X do przedstawienia czasu (h) i kolumny Y do przedstawienia badanych grup.
  3. Przedstaw każdą mysz lub osobę badaną w badaniu za pomocą kodu = 0 (zero) lub kodu = 1, wskazujących odpowiednio przeżycie lub śmierć.
    1. Dla każdego zwierzęcia, które umrze, umieść 1 w kolumnie Y tej grupy w momencie śmierci w kolumnie X. Jeśli w jednym punkcie czasowym w grupie występuje wiele zgonów, kopię tego punktu czasu można umieścić w kolumnie X. Na przykład, jeśli trzy osoby w grupie umrą po 3 godzinach, punkt czasowy 3 godziny pojawi się trzy razy w kolumnie X.
    2. Dla wszystkich zwierząt, które przeżyły w grupie, umieść zero w kolumnie Y w ostatnim zmierzonym punkcie czasu. Na przykład, jeśli cztery myszy przeżyją, umieść cztery końcowe punkty czasowe w kolumnie X oznaczone czterema zerami w kolumnie Y.
  4. Po wprowadzeniu danych o zwierzętach dla wszystkich grup, należy użyć szablonu wykresu przeżycia, aby utworzyć wykres przeżycia.
    1. Pozostaw domyślne kodowanie jako 0 i 1.
    2. Ustaw parametry wykresu jako wartość procentową.
  5. Po wybraniu parametrów krzywej przeżycia należy przeprowadzić analizę statystyczną za pomocą testu Mantela-Coxa (logarytmicznie rangi).
  6. Formatowanie wykresów Kaplana-Meiera przy użyciu danych statystycznych.
    UWAGA: Szczepy, które wykazują śmiertelność mniejszą lub równą szczepowi rodzicielskiemu i szczepowi zatwierdzonemu przez FDA (np. E. coli BL21) można uznać za atenuowane.

12. Wizualizacja infekcji za pomocą bioluminescencji

  1. Aby zobrazować postęp infekcji, należy wprowadzić chromosomalny operon bioluminescencyjny (luxCDABE) do testowanego szczepu PGN5 i VE2. Plazmidy i protokół używany do oznaczania tych szczepów zostały opracowane w laboratorium Schweizer i mogą nie być kompatybilne ze wszystkimi gatunkami/szczepami bakterii13. Co ważne, wizualizacja infekcji jest opcjonalna; W związku z tym insercja genomowa tego operonu nie jest konieczna do przeprowadzenia opisanego powyżej badania śmiertelności.
  2. Przygotować i zwalidować szczepy przy użyciu metody opisanej powyżej. Dodatkowo sprawdzaj bioluminescencję w znakowanych szczepach na każdym etapie walidacji.
  3. Po przygotowaniu szczepów wstrzyknąć zwierzętom w grupach po 10 szczepów bioluminescencyjnych, postępując zgodnie z powyższymi krokami.
  4. Obrazuj zwierzęta co 3 godziny przez 24 godziny za pomocą systemu obrazowania zwierząt zdolnego do bioluminescencji.
    1. Najpierw przygotuj kamerę, ustawiając parametry kamery i podgrzewając scenę dla zwierząt. Ustaw również przepływ tlenu na 1,5 l na minutę (lub postępuj zgodnie z zaleceniami producenta).
    2. Po ustabilizowaniu się obrazownika i stolika, natychmiast po wstrzyknięciu umieść jedną mysz w komorze anestezjologicznej i podawaj 3,5% izofluranu do komory o przepływieO2 przez około 4 minuty. Metody znieczulenia mogą się różnić w zależności od zastosowanej komory i/lub środka znieczulającego; Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta. Określ właściwe znieczulenie za pomocą testu odruchu odstawienia.
    3. Przesuń mysz do etapu stabilizacji temperatury. Ułóż mysz na plecach z wyciągniętymi ramionami i dopasuj mysz do stożka nosowego w celu podawania 2,5% izofluranu podczas całej procedury obrazowania.
    4. Zamknij drzwi i wykonaj zdjęcia bioluminescencyjne oraz zdjęcia rentgenowskie myszy.
    5. Po zakończeniu obrazowania umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj ją. Mysz powinna odzyskać przytomność w ciągu 3-5 minut.
    6. Kontynuuj obrazowanie myszy co 3 godziny przez 24 godziny, za każdym razem używając innej myszy z każdej grupy. Nie należy odtwarzać obrazu myszy w ciągu 24 godzin ze względu na możliwość wystąpienia działań niepożądanych w wyniku ponownego narażenia na znieczulenie. Jedna mysz powinna otrzymywać tylko jedną dawkę znieczulenia co 24-36 godzin. Wyczyść platformę obrazowania po zobrazowaniu każdej myszy. Wyłącz imager między punktami czasowymi obrazowania.
      UWAGA: Bioluminescencja zaniknie, niezależnie od wstrzykniętego szczepu. Intensywność i długowieczność bioluminescencji będzie się różnić w zależności od wielu czynników, w tym liczby wstrzykniętych bakterii, szczepu myszy, szczepu bakteryjnego itp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano na Rysunku 2, celowaną delecję genomiczną można potwierdzić za pomocą kolonialnej reakcji PCR z zastosowaniem specyficznych starterów amplifikujących analizowany region. Kolonie z delecją genomiczną dadzą krótszy produkt PCR w porównaniu do kolonii typu dzikiego. Przesiew PCR 10–12 kolonii jest zazwyczaj wystarczający do wykrycia co najmniej jednej kolonii z celowaną delecją. Jeśli po kilku rundach przesiewu nie wykryto żadnych delecji, należy po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Plazmid pEX100T-Not1 jest skutecznym mediatorem sekwencyjnych delecji genomowych, które są wolne od markerów i znajdują się w ramce. Podczas inżynierii szczepów bakteryjnych w celu osłabienia zjadliwości, delecja całych sekwencji genów zamiast generowania mutacji punktowych zmniejsza prawdopodobieństwo powrotu do zjadliwego fenotypu. Dodatkowo, każda delecja genu chorobotwórczości dodatkowo osłabia patogen, wzmacniając stabilność atenuacji.

Metoda ta może być również stosowana do generowania m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor Hongwei D. Yu jest dyrektorem naukowym i współzałożycielem Progenesis Technologies, LLC.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R44GM113545 i P20GM103434.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 0,2 ml z płaskimi nakrętkamiThermoScientificAB-0620przez Fisher Scientific
Strzykawka 1 mlBD22-253-260przez Fisher Scientific
1,5 ml jednorazowa kuweta polistyrenowaFisher Scientific14955127
1,5 ml Probówki do mikrowirówekFisher Scientific05-408-129
2,0 ml Fiolki kriogeniczneCorning430659przez
igłę Fisher Scientific 27GBD14-821-13BFisher Scientific
50 mlFisher Scientific05-539-13przez Fisher Scientific
Blok akumulatorowy CyfrowylabnetNC0205808przez Fisher Scientific
Wirówka stołowa 5804REppendorf04-987-372przez Fisher Scientific
Mikrowirówka stołowaSorvall75-003-287za pośrednictwem
inkubatora gabinetowegoVWR1540
Sól disodowa karbenicylinyFisher ScientificBP2648250
probówka do hodowli, polistyrenFisher Scientific14-956-6Dprzez Fisher Scientific
Jednorazowe pętle do inokulacjiFisher Scientific Fisher Scientific22-363-597
Zestaw mikrobiologiczny Dneasy UltraClean (50)Qiagen12224-50lub preferowana metoda/dostawca
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)Omega bio-tekD6493-01lub preferowana metoda/dostawca
EcoRI-HF, endonukleaza restrykcyjnaNew England BioLabsR3101L
Kuwety do elektroporacjiBulldog BioNC0492929przez Fisher Naukowy
zestaw do ligacji DNA FastLink IIEpicentre TechnologiesLK6201Hprzez Fisher Scientific
Siarczan gentamycynyFisher ScientificBP918-1
GlicerolFisher ScientificBP229-4
GoTaq G2 Bezbarwny Master MixPromegaM7833przez Fisher
Scientific Isothesia IsofluranHenry Schein Zdrowie zwierząt29405
IVIS Lumina XRMS Series III System obrazowania in vivoPerkins i ElmerCLS136340
Monosiarczan kanamycynyFisher ScientificBP906-5
LE agarozaGenemate3120-500przez Fisher Scientific
Luria BrothDifco240230przez Fisher Scientific
MicroPulser ElektroporatorBioRad1652100
Agar szlachetny, ultraczystyAffymetris/USBAAJ10907A1przez Fisher Scientific
NotI-HF, endonukleaza restrykcyjnaNew England BioLabsR3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coliInvitrogenC404052za pośrednictwem Fisher Scientific
Fosforan buforowany solą fizjologiczną w proszkuSigmaP3813-10PAKSigma-Aldrich
Prism 7GraphPadhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
>Pseudomonas agar izolacyjnyDifco292710przez Fisher Scientific
Pseudomonas izolacja bulionAlpha BiosciencesP16-115Niestandardowy
zestaw do miniprzygotowania QIAprep Spin (250)Qiagen27106lub preferowana metoda/dostawca
Inkubator z wytrząsaniemNew Brunswick ScientificInnova 4080wstrząsnąć przy 200 obr./min
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA24811
Odtłuszczone mlekoDifcoDF0032-17-3przez Fisher Scientific
Małe płytki (100 ø zewnętrzna x 10 mm)Fisher ScientificFB0875713
SmartSpec Plus SpektrofotometrBio-Rad170-2525lub preferowana metoda/dostawca
SacharozaFisher ScientificS5-500
Wykałaczki, okrągłediamentoweWykałaczki dowolnej marki, autoklawowane
Zestaw do klonowania TOPO TA, do sekwencjonowaniaInvitrogen45-0030
XAF-8 Filtry systemu anestezjologicznegoPerkins and Elmer118999
XGI 8 System anestezjologii gazowejSuwmiarka Nauki Przyrodnicze/Xenogen
przez probówki do suchej kąpieli Fisher Scientific

Bibliografia

  1. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
  2. Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
  3. Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
  4. Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
  5. Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
  6. Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
  7. Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58(2013).
  8. Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17(2009).
  9. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
  10. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  12. Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
  13. Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
  14. Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
  15. Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209(2010).
  16. Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
  17. Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
  18. Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
  19. Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model zaka enia myszykolonialna reakcja PCRelektroforeza w elu agarozowymwstrzykiwanie domi nioweobrazowanie bioluminescencyjneplazmid pEX100T NotIprzesiewanie pod k tem oporno ci na sacharoz
Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.