Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Summary

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Abstract

Pierwotne mioblasty to niezróżnicowane, proliferujące prekursory mięśni szkieletowych. Można je hodować i badać jako prekursory mięśni lub indukować do różnicowania się w późniejszych etapach rozwoju mięśni. Przedstawiony tutaj protokół opisuje solidną metodę izolacji i hodowli wysoce proliferacyjnej populacji komórek mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Komórki te są przydatne do badania właściwości metabolicznych mięśni szkieletowych różnych modeli myszy, a także w innych dalszych zastosowaniach, takich jak transfekcja z egzogennym DNA lub transdukcja z wektorami ekspresji wirusa. Poziom zróżnicowania i profil metaboliczny tych komórek zależy od długości ekspozycji i składu pożywki użytej do indukowania różnicowania mioblastów. Metody te zapewniają solidny system do badania metabolizmu komórek mięśniowych myszy ex vivo. Co ważne, w przeciwieństwie do modeli in vivo, opisane tutaj metody zapewniają populację komórek, którą można rozszerzać i badać z wysokim poziomem odtwarzalności.

Introduction

Chociaż często cytowany jako wskaźnik ogólnego zdrowia metabolicznego, wiele badań wykazało, że wskaźnik masy ciała (BMI) u starszych dorosłych nie jest konsekwentnie związany z wyższym ryzykiem śmiertelności. Do tej pory jedynym czynnikiem, który okazał się spójny ze zmniejszoną śmiertelnością w tej populacji, jest zwiększona masa mięśniowa¹. Tkanka mięśniowa stanowi jedno z największych źródeł komórek wrażliwych na insulinę w organizmie i dlatego ma kluczowe znaczenie w utrzymaniu ogólnej homeostazy metabolicznej². Aktywacja tkanki mięśni szkieletowych poprzez ćwiczenia wiąże się ze wzrostem zarówno miejscowej wrażliwo....

Protocol

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Scripps Research dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Pobieranie i przetwarzanie eksplantatów tkanki mięśniowej

1. Dzień przed sekcją wysterylizuj cały sprzęt do preparacji (kleszcze, żyletki i nożyczki) i przygotuj wszystkie wymagane media: sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pożywkę galwaniczną MB (12,5 ml DMEM, 12,5 ml HAMS F12, 20 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml suplementu pożywki z płynem owodniowym) i roztwór powlekający (24 ml DMEM, 24 ml HAMS F12, 1,7 ml kolagenu, 1 ml matrigelu).
2. W dniu sekcji pokryj jedno 6-centymetrowe naczy....

Results

Zgodnie z sekcją 1 dostarczonego protokołu powinny pojawić się pierwotne komórki wyłaniające się z eksplantatów, które będą widoczne pod standardowym mikroskopem świetlnym (Rysunek 2). Heterogeniczna populacja komórek będzie widoczna wyrastająca z i otaczająca każdy eksplant tkanki mięśniowej. Mioblasty pojawią się jako małe, okrągłe, jasne kule. Zgodnie z sekcją 2 protokołu uzyskamy wczesne zbiory mioblastów z eksplantatów tkankowych, które będą zawierały niewiele kom.......

Discussion

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do ustanowienia i utrzymania homeostazy metabolicznej¹¹. Badania nad fizjologią mięśni komplikuje zmienność międzyosobnicza, a także trudności w uzyskiwaniu próbek, szczególnie w przypadku badań na ludziach. Wykazano, że hodowane pierwotne miotube'y podsumowują wiele cech fizjologii mięśni, w tym homeostazę wapnia¹², regenerację uszkodzonej tkanki mięśniowej⁵, zmiany metaboliczne w odpowiedzi na^{ćwicz.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1 000 objętości) przed użyciem; 24 ml
HAMS F12	Lonza	12-615F	Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1 000 objętości) przed użyciem; 24 ml
Collagen	Life Technologies	A1064401	1,7 ml
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Podłoże galwaniczne:
DMEM	Gibco	10569010	Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1,000 objętości) przed użyciem; 12,5 ml
HAMS F12	Lonza	12-615F	Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1,000 objętościowo) przed użyciem; 12,5 ml
inaktywowane termicznie FBS	Life Technologies	16000044	20 ml; można kupić jako zwykły FBS i inaktywować termicznie, umieszczając w 40 ° C kąpiel wodna przez 20 minut
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 ml
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1,000 objętościowo) przed użyciem; 17,5 ml
HAMS F12	Lonza	12-615F	Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1,000 objętościowo) przed użyciem; 17,5 ml
Ciepło Inaktywowane technologie życia FBS		16000044	10 ml; można kupić jako zwykły FBS i inaktywować termicznie, umieszczając w 40 ° C kąpiel wodna przez 20 min
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 ml
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1 000 objętości) przed użyciem; 24 ml
HAMS F12	Lonza	12-615F	Zawsze dodawaj gentamycynę (1:1 000 objętości) przed użyciem; 24 ml
Ciepło Inaktywowana surowica końska	Sigma	H1138	1,5 ml
Technologie życia	insuliny, selenu i transferyny	41400045	0,5 ml
Inne materiały:
Gentamycyna	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma 472301		Przygotuj jako 10% DMSO w Myoblast Pożywki do zamrażania komórek
Kleszcze	Dowolne
żyletki	Dowolne
nożyczki	Dowolny
papier Whatman	VWR	21427-648
Płyta 60 mm	VWR	734-2318
Płyta 10 cm	VWR	25382-428 (CS)
Kolby T25	Termoby ThermoFisher	156367
T75	Probówki	156499
(15 ml)	BioPioneer	CNT-15
Wskaźniki zużycia tlenu:
Seahorse XFe96 Analizator			Agilent Seahorse XFe96Przyrząd służący do pomiaru wskaźników zużycia tlenu odczytywanych przez zakwaszenie pożywki zewnątrzkomórkowej
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-dołkowe płytki do użytku w analizatorze XFe96
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	można zakupić od innych dostawców po ustaleniu testu; niektóre zalecenia są wymienione poniżej
Podłoże Seahorse XF Palmitate-BSA FAO	Składniki Agilent	102720-100	można nabyć od innych dostawców po ustaleniu testu; niektóre zalecenia są wymienione poniżej
Kwas palmitynowy	Sigma	P5585-10G	do pomiaru utleniania kwasów tłuszczowych
Karnityna	Sigma	C0283-5G	do pomiaru utleniania kwasów tłuszczowych
Etomoxir	Sigma	E1905	do pomiaru utleniania kwasów tłuszczowych
BSA	Sigma	A7030	stosowany jako kontrola lub w połączeniu z kwasem palmitynowym do stosowania w pomiarze utleniania kwasów tłuszczowych