Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Chociaż często cytowany jako wskaźnik ogólnego zdrowia metabolicznego, wiele badań wykazało, że wskaźnik masy ciała (BMI) u starszych dorosłych nie jest konsekwentnie związany z wyższym ryzykiem śmiertelności. Do tej pory jedynym czynnikiem, który okazał się spójny ze zmniejszoną śmiertelnością w tej populacji, jest zwiększona masa mięśniowa¹. Tkanka mięśniowa stanowi jedno z największych źródeł komórek wrażliwych na insulinę w organizmie i dlatego ma kluczowe znaczenie w utrzymaniu ogólnej homeostazy metabolicznej². Aktywacja tkanki mięśni szkieletowych poprzez ćwiczenia wiąże się ze wzrostem zarówno miejscowej wrażliwości na insulinę, jak i ogólnego stanu zdrowia metabolicznego³. Podczas gdy modele in vivo są niezbędne do badania fizjologii mięśni i wpływu funkcji mięśni na zintegrowany metabolizm, pierwotne hodowle miotubes zapewniają elastyczny system, który zmniejsza złożoność badań na zwierzętach.

Mioblasty pochodzące z mięśni poporodowych mogą być używane do badania wpływu licznych warunków leczenia i wzrostu w wysoce powtarzalny sposób. Jest to od dawna znane i opisano kilka metod izolacji i hodowli mioblastów^4,5,6,7,8,9. Niektóre z tych metod wykorzystują mięśnie noworodków i dają stosunkowo niską liczbę mioblastów^5,8, co wymaga kilku zwierząt do badań na większą skalę. Ponadto najczęściej stosowane metody hodowli mioblastów wykorzystują "wstępne posiewanie" w celu wzbogacenia mioblastów, które są mniej przylegające niż inne typy komórek. Odkryliśmy, że opisana tutaj alternatywna metoda wzbogacania jest znacznie bardziej wydajna i powtarzalna w przypadku wzbogacania wysoce proliferacyjnej populacji mioblastów. Podsumowując, protokół ten umożliwia izolację wysoce proliferacyjnych mioblastów z eksplantatów mięśniowych młodych dorosłych osobników, poprzez wyrastanie do pożywek hodowlanych. Mioblasty mogą być zbierane wielokrotnie, przez kilka dni, gwałtownie się namnażać i indukować do różnicowania się w miotuby. Protokół ten w sposób powtarzalny generuje dużą liczbę zdrowych komórek mioblastów, które silnie różnicują się w spontanicznie drgające miotuby. Umożliwiło nam to zbadanie metabolizmu i rytmów okołodobowych w pierwotnych miotubach myszy o różnych genotypach. Na koniec zamieszczamy metody przygotowania miotub do badania metabolizmu oksydacyjnego, wykorzystując pomiary wskaźników zużycia tlenu na płytkach 96-dołkowych.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Scripps Research dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Pobieranie i przetwarzanie eksplantatów tkanki mięśniowej

1. Dzień przed sekcją wysterylizuj cały sprzęt do preparacji (kleszcze, żyletki i nożyczki) i przygotuj wszystkie wymagane media: sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pożywkę galwaniczną MB (12,5 ml DMEM, 12,5 ml HAMS F12, 20 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml suplementu pożywki z płynem owodniowym) i roztwór powlekający (24 ml DMEM, 24 ml HAMS F12, 1,7 ml kolagenu, 1 ml matrigelu).
2. W dniu sekcji pokryj jedno 6-centymetrowe naczynie roztworem powlekającym dla każdego mięśnia, który ma być wycięty. Dodać 2 ml roztworu powlekającego na powierzchnię każdej płytki, delikatnie wstrząsnąć, aby uzyskać równomierną warstwę na powierzchni, a następnie inkubować płytki z roztworem w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
3. Usunąć roztwór powlekający z płytek i powrócić do roztworu podstawowego.
   nuta: Roztwór powlekający może być ponownie używany przez okres do sześciu miesięcy i powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C.
4. Przepłucz płytki dwukrotnie 2 ml PBS, aby usunąć niezwiązany kolagen i matrigel.
5. Podczas sekcji należy umieścić płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.
6. Przygotuj wilgotną komorę, umieszczając 2-3 arkusze grubego papieru chłonnego w plastikowej torbie lub sterylnym naczyniu o średnicy 15 cm i za pomocą pipety zwilż powierzchnię papieru sterylną wodą.
7. Umieść komorę w świetle UV na 5 minut w celu sterylizacji.
8. Wypreparuj pożądane mięśnie myszy w wieku od 4 do 8 tygodni. Aby wysterylizować tkankę mięśniową, należy delikatnie przepłukać PBS zawierający 40 μg/ml gentamycyny.
   nuta: W przypadku mięśni czworogłowych i mięśni brzuchatego łydki należy układać jeden mięsień na płytkę. W przypadku mięśnia płaszczkowatego, podeszwowego i EDL połącz mięśnie obu nóg na jednej płytce.
9. Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść mięsień na sterylną 10 cm, niepowlekaną szalkę Petriego. Dodaj 0,5-1,0 ml pożywki galwanicznej na mięsień, tak aby tkanka była wilgotna, ale nie unosiła się na wodzie (Rysunek 1A).
10. Użyj sterylnego skalpela lub żyletki, aby delikatnie pokroić mięsień na małe fragmenty (około 1-3 mm³).
    nuta: Ważne jest, aby zminimalizować przenoszenie tkanki mięśniowej dla najlepszych wyników.
11. Za pomocą kleszczy lub pipety przenieś fragmenty mięśni na powierzchnię wstępnie pokrytej płytki o średnicy 6 cm. Bardzo delikatnie nałóż dodatkowe 0,8 ml pożywki galwanicznej na tkankę. Powinno być wystarczająco dużo podłoża, aby utrzymać kawałki tkanki nawodnione, ale nie unoszące się na wodzie (Rysunek 1B).
12. Umieść 6-centymetrowe szalki zawierające fragmenty mięśni w wilgotnej komorze i wróć do inkubatora (37 °C, 5% CO₂) na 48 godzin (Rysunek 1C).
    nuta: Ważne jest, aby fragmenty mięśni przylegały do powierzchni płytki, aby umożliwić przerost mioblastów. Nie przesuwaj płyt/komory przez co najmniej 48 godzin.
13. Po 48 godzinach dokładnie sprawdź płytki, aby upewnić się, że fragmenty mięśni przylegają. Nałożyć 2 ml pożywki galwanicznej, uważając, aby nie usunąć fragmentów.
    nuta: Jeśli na płytkach widoczne są zanieczyszczenia lub zanieczyszczenia, ostrożnie umyj kawałki mięśni. Umieść 2 ml roztworu PBS/gentamycyny na krawędzi płytki i delikatnie przechyl, aby przemyć tkankę mięśniową. Wyjmij PBS i powtórz krok prania. Po drugim praniu nałóż 2 ml pożywki galwanicznej.
14. Płytki należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 3 dni (5 dni od pierwotnego rozwarstwienia) przed pobraniem mioblastów. Sprawdzaj co drugi dzień pod kątem przerostu mioblastów.
    nuta: Wygląd komórek wyłaniających się z eksplantatów mięśniowych będzie zmienny i niejednorodny. Pierwotne mioblasty pojawiają się jako małe, okrągłe i jasne komórki. Nie jest jednak ani konieczne, ani wiarygodne identyfikowanie ich po wyglądzie na tym etapie (Rysunek 2).

2. Zbieranie wyrastających mioblastów

1. Przygotuj i podgrzej pożywkę Myoblast (17,5 ml DMEM, 17,5 ml HAMS F12, 10 ml FBS, 5 ml suplementu pożywki z płynem owodniowym), trypsynę i PBS/gentamycynę. Pokryć jedną kolbę T25 na każdą zbieraną grupę mięśni roztworem powlekającym, jak opisano w kroku 1.2 (patrz Tabela 1).
2. Usuń podłoże galwaniczne i delikatnie opłucz eksplantaty mięśni 2 ml PBS/gentamycyny. Szybko wyjmij PBS (płukać jedną płytkę na raz i nie pozwól, aby na tym etapie płyta znajdowała się w PBS).
3. Delikatnie dodać 1 ml PBS/gentamycyny i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 minutę.
4. Użyj pipety P1000, aby zebrać PBS/komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
5. Dodać 1 ml trypsyny do płytki i ponownie umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 minuty. Delikatnie postukać w płytki, aby usunąć mioblasty. Zbierz trypsynę/komórki i połącz z kolekcją PBS. Dodaj 8 ml pożywki Myoblast do probówki wirówkowej i delikatnie odwróć, aby wymieszać.
6. Delikatnie nanieść 2 ml roztworu galwanicznego na płytki mięśniowe i ponownie umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
7. Wirować probówki wirówkowe zawierające komórki w wirówce przez 3 minuty przy 200 x g.
8. Odessać supernatant do ~1 ml, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego. Delikatnie dodać pożywkę Myoblast (patrz Tabela 1) i przenieść komórki do wstępnie powlekanej kolby i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C. To są żniwa P0. Jeśli obserwuje się je pod mikroskopem, może być bardzo mało komórek (Rysunek 3).
9. Opisany powyżej zbiór powtarzać co drugi dzień do trzech razy. Po trzecim zbiorze wyrzuć eksplantaty.

3. Ekspansja i wzbogacanie proliferujących mioblastów

UWAGA: Zbiory P0 będą niejednorodne (~60% mioblastów). Kolejne 2 pasaże wykorzystują PBS do selektywnego zbierania mioblastów. Wiele z bardziej przylegających komórek pozostanie w tyle, a szybko proliferujące mioblasty będą czyste ≥95% w ciągu 2 pasaży. Po ustaleniu mioblastów należy je utrzymywać w niskiej gęstości, aby uniknąć spontanicznego różnicowania.

1. Dla każdej kolby T25 zawierającej ~40-50% zlewających się komórek z sekcji 2, pokryj jedną kolbę T75 5 ml roztworu powlekającego i umieść w temperaturze 4 °C na 1-4 godziny.
2. Usunąć roztwór powlekający z kolb i powrócić do roztworu podstawowego. Przepłukać kolby dwukrotnie 2 ml PBS/gentamycyny i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
3. Odessać pożywkę z kolb P0 mioblast T25. Krótko przepłukać komórki 2 ml ciepłego PBS/gentamycyny. Odessać PBS z kolby.
   nuta: Celem tego etapu (ppkt 3.3) jest zmniejszenie możliwości skażenia bakteryjnego. Wykonana szybko i delikatnie nie powinna spowodować utraty mioblastów. W razie potrzeby można go pominąć, aby zmaksymalizować zachowanie mioblastów.
4. Odpipetować 2 ml ciepłego PBS (nie trypsyny) do każdej kolby zawierającej mioblasty. Umieścić kolby z PBS w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 min.
   nuta: Mioblasty powinny łatwo odłączyć się od kolb z PBS. Stosowanie PBS zamiast trypsyny na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zanieczyszczenia populacji mioblastów innymi typami komórek.
5. Wyjąć komórki z inkubatora w temperaturze 37 °C i mocno postukać w kolby w celu usunięcia komórek. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym czy nie ma swobodnie unoszących się mioblastów.
6. Umieścić kolby pionowo w kapturze do hodowli tkankowych i przepłukać dno kolb 10 ml pożywki Myoblast 2-3 razy, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały usunięte.
7. Zebrać mieszaninę komórek/pożywki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przez 3 minuty przy 200 x g.
8. Zassać podłoże do około 1 ml, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego. Delikatnie dodaj odpowiednią objętość pożywki Myoblast do probówki wirówkowej i delikatnie wymieszaj.
9. Rozprowadzić mieszaninę komórek do nowych kolb T75. Dodać 10 ml pożywki Myoblast do każdej nowej kolby T75. Delikatnie wstrząsnąć kolbami w poziomie, aby rozprowadzić komórki i umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
10. Dwa dni później ponownie przeszliśmy przez PBS, dzieląc każdą kolbę T75 na trzy kolby T75.
    nuta: Nie pozwól, aby mioblasty zrosły się w więcej niż 50%-60%, ponieważ spowodowałoby to, że zaczną się różnicować i stracą zdolność rozrodczą.
11. W przypadku dodatkowych przejść użyj trypsyny. Dwukrotne pasażowanie z PBS daje >95% mioblastów; Próby dalszej poprawy czystości zwykle skutkują gorszym różnicowaniem.

4. Różnicowanie pierwotnych mioblastów do miotub

1. Mioblasty płytki P2 (lub późniejsze pasaże) w pożywkach Myoblast na płytkach powlekanych (patrz Tabela 1 dla sugerowanych objętości powlekania i posiewu oraz liczby komórek). Dwa lub trzy dni później, gdy komórki są w 70-80% zbieżności, zmień pożywkę na pożywkę różnicującą (24 ml DMEM, 24 ml HAMS F12, 1,5 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 0,5 ml insuliny-selenu-transferyny).
2. Zmieniaj pożywki różnicujące co drugi dzień podczas różnicowania pierwotnych mioblastów w miotuby. Różnicowanie jest zwykle zakończone w 4-5 dniu i będzie zaznaczone przez wydłużone, zrośnięte komórki, które spontanicznie drgają. Wykonuj eksperymenty na zróżnicowanych miotubach w ciągu 6 dni. Zazwyczaj komórki są oznaczane pięć lub sześć dni po zainicjowaniu różnicowania.

5. Pomiar wskaźnika zużycia tlenu w mioblastach lub miotubach na płytkach 96-dołkowych

1. Pokryj 96-dołkowe płytki 25 μl roztworu powlekającego na studzienkę. Odwirować płytki o masie 58 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
2. Inkubować płytki w roztworze powlekającym przez 1-4 godziny w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety wielokanałowej usunąć roztwór powlekający i przemyć trzykrotnie w 25 μl zimnego PBS/gentamycyny. Odwirować co najmniej jedno z tych płukań, aby upewnić się, że nie zostały uwięzione żadne pęcherzyki.
3. Dodać 40 μl pożywki różnicującej do każdego dołka. Odwirować pożywkę na powlekanej płytce bez komórek przez 1 minutę przy 58 x g, aby uniknąć pęcherzyków i usunąć napięcie powierzchniowe, aby uzyskać jednolitą warstwę podłoża.
4. Dodać komórki zawieszone w dodatkowych 40 μl pożywki do każdej studzienki. Zakręć ponownie z prędkością 58 x g.
   nuta: Spójność posiewu jest ważna dla uzyskania najlepszych wyników, a liczba komórek posianych na studzienkę powinna być zoptymalizowana dla każdej konfiguracji eksperymentalnej i prawdopodobnie będzie mieścić się w zakresie ~ 10 000-25 000 mioblastów posianych w pożywkach różnicujących na dołek 96-dołkowej płytki.
5. Podczas różnicowania należy delikatnie zmieniać podłoże codziennie. Nie zasysaj podłoża, ale raczej usuń je pipetą, pozostawiając niewielką objętość, aby uniknąć przemieszczenia komórek lub wystawienia ich na działanie powietrza. Na przykład zastąp 50 μl na raz przez trzy powtórzenia, a nie wszystkie 80 μl na raz.
6. Użyj 8-15 dołków na warunek. Może być konieczne pominięcie niektórych studzienek, jeśli komórki nie tworzą jednolitej warstwy miotub.
   nuta: Pomiń studzienki na krawędziach płytki, ponieważ są one bardzo podatne na parowanie. Zróżnicuj konfigurację płytki dla powtórzeń eksperymentalnych, aby uniknąć błędów systematycznych.
7. Wykonaj żądany test na zróżnicowanych miotubach w ciągu 1-2 dni od pełnego różnicowania (dzień 4-6 od rozpoczęcia różnicowania). Zalecane przyrządy i odczynniki do pomiaru wskaźników zużycia tlenu są wymienione w Tabeli materiałów.

Zgodnie z sekcją 1 dostarczonego protokołu powinny pojawić się pierwotne komórki wyłaniające się z eksplantatów, które będą widoczne pod standardowym mikroskopem świetlnym (Rysunek 2). Heterogeniczna populacja komórek będzie widoczna wyrastająca z i otaczająca każdy eksplant tkanki mięśniowej. Mioblasty pojawią się jako małe, okrągłe, jasne kule. Zgodnie z sekcją 2 protokołu uzyskamy wczesne zbiory mioblastów z eksplantatów tkankowych, które będą zawierały niewiele komórek i będą niejednorodne (Rysunek 3). Sekcja 3 protokołu opisuje pasażowanie wczesnych zbiorów za pomocą PBS (zamiast trypsyny), co zapewni stosunkowo czystą populację mioblastów do dalszej hodowli. Postępowanie zgodnie z sekcją 4 protokołu pozwoli uzyskać w pełni zróżnicowane miorurki do dalszej eksperymentalnej manipulacji. Różnicowanie mioblastów trwa zwykle 4-6 dni, podczas których morfologia komórek zmieni się z pojedynczych, okrągłych kul na wydłużone, zrośnięte, długie włókna wielojądrowe (Ryc. 4). Zgodnie z sekcją 5 protokołu zostaną wytworzone zróżnicowane miorurki w 96-dołkowych płytkach, aby umożliwić różnorodne charakterystyki metaboliczne w oparciu o zmiany w zużyciu tlenu i wskaźnikach zakwaszenia zewnątrzkomórkowego10 (Rysunek 5).

Rycina 1: Rozwarstwienie i przetwarzanie mięśnia czworogłowego. (A) Mięsień czworogłowy, który został świeżo wypreparowany i przepłukany PBS przed przeniesieniem do naczynia o średnicy 10 cm. Na 1 ml podłoża galwanicznego nałożono powłokę do obróbki. (B) Fragmenty tkanki mięśniowej mięśnia czworogłowego uda po przeniesieniu na wstępnie pokrytą płytkę o średnicy 6 cm. (C) 6 cm płytki w wilgotnej komorze przed umieszczeniem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Rozrost mioblastów. Wyrost mioblastów z eksplantatów mięśnia czworogłowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Mioblasty wczesnego pasażu. Mioblasty P0 po przeniesieniu i przyłączeniu do kolby T25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Posiewanie i różnicowanie pierwotnych miotubek. (A) Mioblasty jeden dzień po rozpoczęciu ekspozycji na pożywki różnicujące. (B,C) Zróżnicowane miotubki pięć (B) lub sześć (C) dni po rozpoczęciu różnicowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Rurki Myotube gotowe do pomiaru wskaźników zużycia tlenu. W pełni zróżnicowane miotubki pięć dni po posiewie 20 000 mioblastów w pożywkach różnicujących w każdym dołku 96-dołkowej mikropłytki do hodowli komórkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Żaden.