Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Summary

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Abstract

Celem metody jest wygenerowanie synapsy immunologicznej (IS), przykładu koniugacji między komórkami utworzonymi przez komórkę prezentującą antygen (APC) i komórkę limfocytów T (Th) wspomagającą efektor, oraz zarejestrowanie obrazów odpowiadających pierwszym etapom powstawania IS i późniejszym zdarzeniom transportowym (występującym zarówno w APC, jak i w komórce Th). Wydarzenia te ostatecznie doprowadzą do spolaryzowanego wydzielania w IS. W tym protokole wykorzystano komórki Jurkat poddane impulsom enterotoksyny E Staphylococcus (SEE) komórkom Raji jako modelowi synapsy komórkowej, ze względu na bliskość tego systemu eksperymentalnego do rzeczywistości biologicznej (koniugaty synaptyczne komórki Th-APC). Przedstawione tutaj podejście obejmuje koniugację między komórkami, akwizycję poklatkową, mikroskopię fluorescencyjną o szerokim polu widzenia (WFFM), a następnie przetwarzanie obrazu (dekonwolucja po akwizycji). Poprawia to stosunek sygnału do szumu (SNR) obrazów, zwiększa rozdzielczość czasową, umożliwia zsynchronizowane pozyskiwanie kilku fluorochromów w powstających koniugatach synaptycznych i zmniejsza bielenie fluorescencji. Ponadto protokół jest dobrze dopasowany do protokołów utrwalania komórek w punkcie końcowym (paraformaldehyd, aceton lub metanol), co pozwoliłoby na dalsze barwienie i analizy immunofluorescencyjne. Protokół ten jest również kompatybilny z laserową skaningową mikroskopią konfokalną (LSCM) i innymi najnowocześniejszymi technikami mikroskopii. Głównym zastrzeżeniem jest to, że tylko te granice limfocytów T, APC (zwane interfejsami IS), które znajdowały się pod kątem 90° do płaszczyzny ostrości wzdłuż osi Z, mogły być prawidłowo zobrazowane i przeanalizowane. Istnieją inne modele eksperymentalne, które upraszczają obrazowanie w wymiarze Z i następujące po nim analizy obrazu, ale te podejścia nie emulują złożonej, nieregularnej powierzchni APC i mogą sprzyjać niefizjologicznym interakcjom w IS. W związku z tym zastosowane tu podejście eksperymentalne jest odpowiednie do reprodukcji i konfrontacji z pewnymi złożonościami biologicznymi zachodzącymi w IS.

Introduction

Głównym celem metody jest generowanie konsygnatów synaps immunologicznych (IS) komórka-komórka utworzona przez komórkę prezentującą antygen (APC) pulsowaną superantygenami SEE i efektorową komórką Th, oraz rejestrowanie obrazów odpowiadających pierwszym etapom tworzenia synaps immunologicznych i późniejszym zdarzeniom transportu (występującym zarówno w APC, jak i w limfocytacji Th), to ostatecznie doprowadzi do spolaryzowanego wydzielania w IS. Ustanowienie IS przez limfocyty T po związaniu ich receptora komórkowego (TCR) z antygenami związanymi z MHC-II na APC organizuje niezwykle dynamiczną, plastyczną i krytyczną instancję zaangażowaną w specyficzne dla antygenu, humoralne i komórkowe odpowiedzi immunologiczne^1,2. IS jest definiowany przez tworzenie specjalnego wzorca supramolekularnego kompleksu aktywacyjnego (SMAC) charakteryzującego się procesem reorganizacji aktyny³. Po budowie IS przez limfocyty T z APC, polaryzacja pęcherzyków wydzielniczych w kierunku IS wydaje się być związana ze spolaryzowanym wydzielaniem w przerwie synaptycznej. Wydaje się, że ta skoncentrowana maszyneria jednoznacznie dostarcza układowi odpornościowemu doskonale regulowanego fortelu w celu zwiększenia skuteczności krytycznych funkcji efektorowych wydzielniczych limfocytów T, jednocześnie zmniejszając niespecyficzną, cytokinową stymulację komórek postronnych, zabijanie nieistotnych komórek docelowych i apoptotyczne samobójstwo poprzez śmierć komórki indukowaną aktywacją (AICD)⁴.

Konsekwencje IS różnią się w zależności od natury zarówno limfocytów T, jak i APC. Kontakt synaptyczny limfocytów Th (zwykle komórek CD4 +) z APC wykazującym antygen związany z MHC-II powoduje aktywację limfocytów T (wydzielanie cytokin, proliferację itp.), a w niektórych przypadkach apoptozę za pośrednictwem AICD⁴. W przypadku cytotoksycznych limfocytów T (CTL) (głównie komórek CD8 +) oddziałujących z APC prezentujących antygen związany z MHC-I, wynik różni się w zależności od wstępnej stymulacji CTL antygenem lub nie. W ten sposób naiwne CTL identyfikujące kompleksy antygenu-MHC-I na APC są "przygotowane" do niszczenia komórek docelowych i podziału. Zagruntowane CTL tworzą również synapsy z komórkami docelowymi (tj. komórkami zakażonymi wirusami lub komórkami nowotworowymi) powodującymi eksterminację komórek specyficznych dla antygenu^5,6.

Spolaryzowane wydzielanie egzosomów w synapsie immunologicznej to rozwijający się i wymagający obszar badań związanych z istotnymi odpowiedziami immunologicznymi⁷. Wykazano, że ciała wielopęcherzykowe (MVB) przenoszące pęcherzyki śródświetlne (ILV) doświadczają spolaryzowanego transportu w kierunku IS^8,9 (Wideo 1) po stymulacji TCR antygenem. Fuzja tych MVB w błonie synaptycznej indukuje ich degranulację i uwalnianie ILV jako egzosomów do szczeliny synaptycznej^8,10. Dzieje się tak w IS utworzonym przez komórki Jurkata typu Th, które zostały poproszone o działanie komórek Raji pokrytych superantygenem SEE, działających jako APC¹¹, stymulowane przez TCR limfoblasty CD4 ⁺ i zaszczepione CTL. Tak więc synapsy wytwarzane przez komórki Jurkata stanowią cenny model do badania spolaryzowanego ruchu wydzielniczego egzosomów. Ponadto kilka dekad badań wykazało, że wiele fundamentalnych spostrzeżeń na temat sygnalizacji TCR pochodzi z badań z transformowanymi liniami komórek T, a najbardziej znanym z tych systemów modelowych jest białaczkowa linijka limfocytów T Jurkat ¹².

Powstanie w pełni rozwiniętego IS daje kilka kluczowych wyników biologicznych, w tym aktywację limfocytów Th, aktywację naiwnych CTL lub zabijanie komórek docelowych przez zapoczątkowane CTL, oprócz anergii lub AICD⁵. W związku z tym istnieją dwa główne typy wydzielniczych IS tworzonych przez limfocyty T, które skutkują bardzo różnorodnymi, ale podobnie krytycznymi funkcjami efektorów immunologicznych^1,6,13. Z jednej strony, IS z zaszczepionych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) indukuje szybką polaryzację (od sekund do kilku minut) granulek litycznych (zwanych "lizosomami wydzielniczymi") w kierunku IS. Degranulacja granulek litycznych indukuje wydzielanie perforyny i granzymów do szczeliny synaptycznej ¹⁴, które są cząsteczkami proapoptotycznymi. Wydzielana perforyna i granzymy następnie indukują zabijanie komórek docelowych^15,16. CTL tworzą tymczasowe synapsy, trwające tylko kilka minut, gdy komórki docelowe są mordowane^3,17. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że optymalne zadanie CTL wymaga szybkiego i tymczasowego kontaktu w celu rozprowadzenia jak największej liczby śmiertelnych uderzeń do wielu komórek docelowych^3,17. W przeciwieństwie do tego, limfocyty Th, takie jak komórki Jurkat, generują stabilne, długotrwałe IS (od 10-30 minut do godzin), ponieważ wydaje się to być konieczne zarówno do kierunkowego, jak i ciągłego wydzielania cytokin stymulujących^3,17. Cytokiny są również zamknięte w pęcherzykach wydzielniczych, a niektóre z nich (np. IL-2, IFN-γ) doświadczają spolaryzowanego transportu do IS¹⁷ i wydzielania. Jedną z podstawowych cech IS jest tworzenie się eksploracyjnych, słabych i przejściowych kontaktów między limfocytem T a APC (Wideo 1), które mogą powodować silniejsze oddziaływanie i ustanowienie dojrzałego IS, pod warunkiem, że TCR identyfikuje pokrewne kompleksy antygen-MHC i że zostaną ustanowione odpowiednie połączenia kostymulacyjne⁵. Zarówno początek pierwszych kontaktów, jak i założenie dojrzałego, całkowicie produktywnego IS są z natury procesami stochastycznymi, szybkimi i asynchronicznymi^5,18. Co więcej, rzadko zdarza się tworzenie koniugatów komórka-komórka¹⁹, co może stanowić wyzwanie dla technik obrazowania (patrz sekcje Wyniki i Dyskusja).

Innym głównym wyzwaniem w badaniu polaryzacji centrum organizującego mikrotubule (MTOC) i granulek wydzielniczych w limfocytach T jest to, że cały proces jest szybki (od sekund do kilku minut), szczególnie w CTL. Biorąc pod uwagę te fakty, większość wczesnych podejść konfrontowała strategię punktu końcowego, w której APC/komórki docelowe i limfocyty T są mieszane razem i zbiegane przez wirowanie o niskiej prędkości, faworyzować tworzenie koniugatu komórka-komórka, inkubowane przez kilka minut, utrwalane, a następnie oceniane pod kątem relokacji MTOC i/lub pęcherzyków wydzielniczych w kierunku IS²⁰. Podejście to ma dwa istotne ograniczenia: nie uzyskano żadnych danych dotyczących żywego transportu i uzyskano wysoki poziom polaryzacji MTOC/granulek wydzielniczych tła, prawdopodobnie ze względu na stochastyczny charakter IS establishment¹⁸. Co więcej, jakakolwiek korelacja między stymulowanymi przez TCR, początkowymi zdarzeniami sygnalizacyjnymi (tj. Wewnątrzkomórkowy wzrost wapnia, reorganizacja aktyny) a polaryzacją pęcherzyków wydzielniczych jest problematyczna do zbadania. W związku z tym niezbędne przepisy dotyczące odpowiedniego obrazowania IS w żywych komórkach łączą się w celu zwiększenia materializacji koniugatu komórka-komórka, synchronizacji wytwarzania IS i, jeśli to możliwe, zagwarantowania ustanowienia koniugatów komórkowych w określonych polach mikroskopowych XY i pozycjach Z. Opracowano kilka strategii, aby uniknąć wszystkich tych problemów. Wyjaśnienie tych metod, ich zalet i słabości wykracza poza zakres tego artykułu. Zapoznaj się z wcześniej opublikowanymi recenzjami poruszającymi te ważne kwestie^1,4,5,21.

Fakt, że limfocyty IS są długowieczne, oraz fakt, że w limfocytach Th MTOC, granulki wydzielnicze zawierające limfokiny i MVB potrzebują od kilku minut do godzin, aby przenieść się i zadokować do klasy IS22 sprawia, że Th-APC JEST idealnym kandydatem do obrazowania przy użyciu opisanego tutaj protokołu.

Protocol

1. Przygotowanie preparatów do przylegania komórek Raji

1. Dodać 150 μl fibronektyny (100 μg/ml) na studzienkę do szkiełka z 8 mikrodołkami (szkiełko z plastikową komorą z dnem) i inkubować przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze 37 °C. Ten substrat adhezyjny pozwoli na wiązanie komórek Raji z dnem studni (krok 2), tworzenie żywych koniugatów z komórkami Jurkata (etap 4) i wychwytywanie mikroskopii poklatkowej (krok 6), a także jest kompatybilne z opcjonalnym wiązaniem paraformaldehydu (PFA) (krok 7).
   nuta: Do utrwalania acetonu należy użyć szkiełek ze szklaną dolną komorą i poli-L-lizyny (20 μg/ml) zamiast fibronektyny, ponieważ aceton rozpuszcza plastik. Szkiełko z 8 mikrodołkami (1 cm2 dołki, maksymalna objętość 300 μl) lub równoważne jest elastycznym i odpowiednim formatem.
2. Odessać fibronektynę za pomocą pipety automatycznej o pojemności 200 μl i przemyć każdą studzienkę 200 μl PBS przez 2 minuty, delikatnie wstrząsając. Powtórz to pranie jeszcze raz. Na tym etapie szkiełko komorowe można przechowywać w PBS przez 1-2 tygodnie w temperaturze 4 °C.

2. Przyleganie komórek Raji do szkiełek komory i znakowanie 7-amino-4-chlorometylokumaryny (CMAC)

1. Przenieś 10 ml zlewającej się (1-2 x 10⁶ komórek/ml) hodowli wstępnej komórek Raji do 15 ml probówki z dnem w kształcie litery V. Dobrze wymieszaj i użyj 10 μl do policzenia komórek w komorze Neubauera lub równoważnej.
2. Odwirować pozostałe komórki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić supernatant.
3. Delikatnie zawieś osad komórkowy w ciepłym, kompletnym pożywce hodowlanej (RPMI 1640 uzupełniony 10% FCS, 2 mM glutaminy, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w stężeniu^10-6 komórek/ml. Użyj równania podanego poniżej:
   ([ ]_{początkowy x} V_początkowy = [ ]_końcowy x V_końcowy), gdzie [ ]_początkowy oznacza początkowe stężenie komórki, V_początkowe = początkowa objętość zawiesiny komórki, [ ]_końcowe = końcowe stężenie komórki, V_końcowe = końcowa objętość zawiesiny komórki.
   nuta: W zależności od stężenia komórek w hodowli wyjściowej, możliwe jest pobranie większej liczby komórek niż jest to potrzebne, ale ważne jest, aby utrzymać pozostałe komórki w hodowli (37 °C) do końca doświadczenia, aby zapobiec potencjalnym problemom (patrz krok 2.6).
4. Oznacz komórki Raji, aby umożliwić ich identyfikację podczas tworzenia koniugatu synaptycznego. W tym eksperymencie znakowanie 7-amino-4-chlorometylokumaryny (CMAC) przeprowadza się w kroku 2.4.2.
   1. Przenieść wymaganą liczbę komórek Raji z pożywki hodowlanej do probówki o pojemności 2 ml. Do szkiełka z 8 mikrodołkami potrzeba łącznie 1,6 ml zawiesiny komórek (200 μl na studzienkę).
   2. Dodać CMAC do końcowego stężenia 10 μM. Utrzymuj komórki w ciemności, przykrywając probówkę folią aluminiową, ponieważ CMAC jest wrażliwy na światło. Potrzeba 200 μl zawierających 2 x 10 5 komórek Raji na 1 cm² studzienki. Tak więc, jeśli trzeba przygotować 8 studzienek, wymagane są komórki 1,6 x 10⁶ Raji.
      nuta: Znakowanie komórek Raji za pomocą niebieskiego znacznika komórek (CMAC, wzbudzenie UV i emisja niebieskiego) odróżnia je od komórek Th, gdy tworzą się koniugaty synaptyczne. Barwnik ten jest kompatybilny z utrwalaczami PFA i acetonu i umożliwia dalsze zabiegi immunofluorescencyjne. Staraj się unikać ekspozycji na światło. Znakowanie komórek Raji w puli za pomocą CMAC, a następnie ponowne zawieszenie przed przyklejeniem komórek Raji do szkiełek komory pokrytych fibronektyną zapewnia jednorodne znakowanie komórek Raji za pomocą CMAC w różnych studzienkach.
5. Ponownie zawiesić komórki barwione CMAC i, po aspiracji PBS do szkiełka komorowego z kroku 1.2, przenieść 200 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki szkiełek komory pokrytych fibronektyną przygotowanych w kroku 1.1-1.2. Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 30 min-1 h.
   nuta: Na tym etapie adhezja i etykietowanie CMAC będą odbywać się jednocześnie, co pozwala zaoszczędzić czas. Należy pamiętać, że komórki Raji szybko się osadzają i należy zachować ostrożność, aby utrzymać jednorodne stężenie w zawiesinie komórkowej przed wysiewem. Na tym etapie nie jest konieczne przemywanie CMAC przez wirowanie, ponieważ mycie CMAC będzie łatwiejsze do wykonania w kroku 2.7 (kiedy znakowane komórki Raji są już przyklejone do szkiełek komory). Ponieważ CMAC jest obecny w zawiesinie komórek w dużym nadmiarze, niebieskie tło fluorescencji jest zbyt wysokie, aby odróżnić komórki zabarwione na niebiesko. Sprawdź fluorescencję CMAC komórek w kroku 2.7 po umyciu CMAC.
6. Upewnij się, że komórki Raji są przyklejone do dna studzienek, delikatnie potrząsając szkiełkami komory na mikroskopie. Upewnij się, że komórki wyświetlają przerwy między sobą i nie są zbieżne (Rysunek 1, środkowy panel). 50-60% zbiegu komórek jest odpowiednie.
   1. Jeśli większość komórek skutecznie przylega do szkiełka komory i nie zaobserwowano żadnych przerw między komórkami, umyj każdą studzienkę ciepłym kompletnym podłożem i ponownie zawieś pożywkę za pomocą automatycznej pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć nadmiar komórek. Sprawdzaj zbieg po każdym etapie ponownego zawieszenia.
   2. Jeśli komórki nie przylegają, powtórz ponownie etap adhezji i zwiększ czas adhezji i/lub liczbę komórek.
      nuta: W tym miejscu można się zatrzymać, inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez noc (O/N) i kontynuować zgodnie z protokołem następnego dnia. Proszę potwierdzić następnego dnia, że komórki Raji pozostają przylegające i znakowane CMAC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
7. Ponownie dokładnie umyj każdą studzienkę ciepłym dodatkiem RPMI, aby wyeliminować nadmiar CMAC i sprawdź, czy nie ma niebieskiej emisji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 1).
   nuta: Aby uniknąć stosowania olejku immersyjnego (lepkiego i lepkiego) oraz obiektywów olejowych o dużej aperturze numerycznej, można użyć obiektywów o bardzo dużej odległości (tj. 20x lub 40x) do szybkiego sprawdzenia oznakowania CMAC za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

3. Puls CMAC — znakowane komórki Raji enterotoksyną gronkowcową E

1. Dodaj enterotoksynę gronkowcową E (SEE, 1 μg/ml) do każdej studzienki. SEE można wygodnie rozcieńczać w pożywce do hodowli komórkowych (roztwór roboczy o stężeniu 100 μg/ml) z zamrożonych preparatów SEE (1 mg/ml w PBS). Użyj 2 μl 100x roztworu roboczego na 200 μl mikrostudzienki.
   ostrożność: Na tym etapie użyj rękawiczek i wyrzuć zużytą końcówkę do pudełka z zagrożeniem biologicznym.
2. Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez co najmniej 30 minut. Efekt SEE utrzymuje się przez co najmniej 3-4 h.
   nuta: W razie potrzeby SEE może być dodawany do odwiertów w różnych punktach czasowych, jeśli planowane są odrębne konfiguracje poklatkowe (krok 5) i/lub w zależności od punktu czasowego rozpoczęcia eksperymentów z punktem końcowym (krok 6).

4. Przygotowanie komórek Jurkat

1. Do tego eksperymentu należy użyć wcześniej wyhodowanej kultury komórek Jurkata (1-2 x 10⁶ komórek/ml). Użyj komórek ze standardowej kolby hodowlanej lub z poprzedniej transfekcji zgodnie ze standardowymi protokołami elektroporacji, jak opisano wcześniej²³. Transfekcja komórek Jurkata pozwoli na poklatkową wizualizację ruchu granulek wydzielniczych w żywych komórkach. Na przykład, gdy GFP-CD63 (marker MVB) jest wyrażany, można zarejestrować ruch pęcherzyków ozdobionych GFP-CD63 (Wideo 1).
2. Obserwuj komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Jeśli zaobserwuje się nadmiar martwych komórek (>20-30%), przed użyciem należy przeprowadzić wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll przy użyciu standardowych protokołów²⁴, aby wyeliminować nadmiar martwych komórek (martwe komórki wykazują większą gęstość niż żywe komórki) (patrz Dyskusja).
3. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml, probówki z dnem w kształcie litery V i użyj 10 μl do liczenia za pomocą hemocytometru.
4. Odwirować pozostałe komórki zgodnie z opisem w kroku 2.2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w tym samym stężeniu co komórki Raji (1 x 10⁶/ml) przy użyciu świeżej, ciepłej pożywki hodowlanej. Wykonaj kroki 2.2-2.3.
5. Utrzymuj komórki Jurkata w hodowli (37 °C, 5% CO₂ ) w oczekiwaniu na Krok 4.
   nuta: W drugiej opcji (transfekcja) liczba żywych komórek będzie znacznie niższa niż w pierwszej. Dlatego rozważ użycie większej początkowej objętości hodowli komórkowej, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do eksperymentu. Z 10 x 10⁶ komórek Jurkat na kuwetę elektroporacyjną i transfekcję, tylko 2-4 x 10⁶ komórek Jurkat przetrwa po 48 godzinach transfekcji, a niektóre z tych komórek zostaną utracone podczas etapu Ficoll. Tak więc jedna kuweta do elektroporacji jest na ogół wystarczająca, aby rzucić wyzwanie przylegającym komórkom Raji z impulsami SEE z 8 mikrostudzienek (potrzebne 1,6 x 10⁶ transfekowanych komórek Jurkata).

5. Współwysiewanie komórek Raji i Jurkat

1. Wyjąć z inkubatora szkiełka komorowe zawierające znakowane CMAC, pulsacyjne, sklejone komórki Rajiego z kroku 3.2. Na tym etapie nie jest konieczne mycie CMAC, ponieważ zostało to już zrobione w kroku 2.7.
2. Ostrożnie odessać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki, jeden po drugim, z jednego rogu studzienki za pomocą automatycznej pipety o pojemności 200 μl. Nie pozwól, aby podłoże w studni całkowicie wyschło.
3. Natychmiast zastąpić pożywkę 200 μl zawieszonych komórek Jurkat w pożywce do hodowli komórkowych (1 x 10⁶/ml) przygotowanej w kroku 4.5. Jeśli wykonywane jest obrazowanie poklatkowe, przejdź do kroku 6 natychmiast po tym kroku, ponieważ komórki Jurkata mają tendencję do osadzania się i bardzo szybkiego tworzenia koniugatów synaptycznych. Dla wygody, mikrostudzienki zawierające pulsacyjne, przylegające do SEE komórki Raji, które na tym etapie nie otrzymują wysiewu komórkami Jurkat, powinny być utrzymywane z pożywką do hodowli komórkowych do czasu kolejnego wyzwania komórkami Jurkat. Pozwoli to na elastyczne późniejsze wyzwanie z komórkami Jurkat w celu uzyskania dodatkowych podejść eksperymentalnych poklatkowych lub kinetycznych, w punkcie końcowym.
4. Jeśli ma zostać wykonany film poklatkowy, szybko przejdź do kroku 6. Polega to na kohodowli przez 1-2 godziny w inkubatorze mikroskopowym lub równoważnym w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} aby umożliwić tworzenie koniugatu synaptycznego i jednoczesną akwizycję obrazu. Jeśli przewiduje się analizę punktu końcowego, ale bez upływu czasu, sprawdź tworzenie koniugatu po okresie wspólnej hodowli za pomocą mikroskopu (jak w Rysunek 1) przed utrwaleniem komórek (krok 7).

6. Obrazowanie poklatkowe pojawiających się koniugatów synaptycznych

1. Przygotuj mikroskop i komorę inkubacyjną przed obrazowaniem. W przykładzie pokazanym na filmie 1 szczegółowe ustawienia mikroskopii są pokazane w Rysunek 2.
   nuta: Jeśli planowany jest eksperyment poklatkowy, wszystkie ustawienia mikroskopu i uzupełnienia (komora do hodowli komórek otoczenia itp.) powinny być przygotowane przed dodaniem zawiesiny Jurkat do szkiełka komorowego z przylegającymi komórkami Raji. Poniższe kroki są opisane dla mikroskopu komercyjnego (tabela materiałów). Można jednak użyć dowolnego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w inkubator do hodowli komórkowych.
   1. Do obrazowania ruchu spolaryzowanego należy używać mikroskopu z 60-krotnym zanurzeniem w oleju i dużą aperturą numeryczną.
   2. Upewnij się, że system automatycznego ustawiania ostrości jest włączony i dostosuj przesunięcie, aby ustawić ostrość komórek Raji związanych z dolną powierzchnią. Proszę zapoznać się z Rysunek 1, Wideo 1 i Wideo 2.
2. Po dodaniu Jurkata do każdej studzienki zawierającej przylegające komórki Raji w kroku 5.3, szybko zlokalizuj szkiełko komory mikrostudzienki na wstępnie podgrzanym (1-2 h) inkubatorze mikroskopowym (tj. OKOlab) i wybierz kilka pozycji XY za pomocą mikroskopu, pól, w których prawdopodobnie zarejestruje powstającą formację IS, utworzoną przez, na przykład, komórkę transfekowaną Jurkatem, która wpadnie w ognisko mikroskopu.
3. Użyj wstępnie podgrzanego inkubatora mikroskopowego, ponieważ zaobserwowano, że stolik stabilizowany temperaturowo utrzymuje stabilne pozycje X, Y, Z. Kryteriami dla wygodnego pola XY są: dobrze skoncentrowane i niezlewające się komórki Raji (tj. wykazujące przerwy między komórkami) oraz obecność transfekowanych komórek Jurkata (można to sprawdzić, łącząc kanały transmitancji i UV lub GFP). Komórki Jurkata będą osadzać się bardzo szybko (kilka minut) na szkiełku komorowym, a szanse na zobrazowanie powstających synaps będą się zmniejszać z czasem (Ryc. 1). Możliwe jest zakończenie eksperymentu po upływie określonego czasu lub przejście do Kroku 7 i ustalenie koniugatów do późniejszej immunofluorescencji i analiz.
   nuta: Możliwe jest wybranie do 16 różnych pól mikroskopowych z maksymalnie 4 różnych mikrodołków w celu jednoczesnej, wielodołkowej akwizycji poklatkowej z odpowiednią rozdzielczością czasową (1-2 minuty na klatkę). Ograniczenie opiera się zarówno na liczbie, jak i intensywności (wpływającej na ekspozycję kamery) różnych fluorochromów, które mają być obrazowane (w zależności od liczby eksprymowanych białek fluorescencyjnych, z wyjątkiem CMAC). Jednym ze sposobów na zwiększenie liczby klatek na sekundę jest nagrywanie dla kanału CMAC tylko w jednym z każdych "n" ram czasowych dla GFP (tj. n = 8, jak pokazano na Rysunek 2), ponieważ komórki Raji są przylegające do dna studni i nie poruszają się łatwo jak komórki Jurkata. Ponadto korzystnie wpływa to na żywotność komórek, ponieważ częsta ekspozycja na światło UV może je uszkodzić. Spróbuj dostosować liczbę klatek na sekundę do 1 klatki co 1 minutę lub krócej (tj. 20 s na klatkę w Wideo 1, Rysunek 2), ponieważ polaryzacja MVB trwa od kilku minut do godzin. Do przeprowadzenia tego wielokanałowego przechwytywania niezbędny jest mikroskop wyposażony w zmotoryzowaną wieżyczkę epifluorescencyjną i odpowiednie pasmowo-przepustowe filtry fluorescencyjne lub ich odpowiedniki.

7. Punkt końcowy tworzenia koniugatów synaptycznych i fiksacja

1. Jeśli planowany jest tylko eksperyment z punktem końcowym (1-2 godziny inkubacji, aby umożliwić tworzenie koniugatów synaptycznych jest odpowiednia), inkubować szkiełko w komorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 1-2 godziny. Sprawdź tworzenie koniugatu po okresie hodowli (jak w Rysunek 1), a następnie utrwal koniugaty acetonem lub PFA (utrwalenie będzie zależało od antygenów i przeciwciał, które zostaną użyte w kolejnej immunofluorescencji). W takim przypadku inkubacja nie wymaga inkubatora ze stopniem mikroskopowym. Zapoznaj się z filmem 3, aby zapoznać się z przykładem.
2. Aby utrwalić komórki, umyj studzienkę przez delikatne potrząsanie ciepłym podłożem RPMI (37 °C) bez FCS (albumina z surowicy może wytrącać się przy utrwalaniu acetonu). Odessać i dodać 200 μl PFA lub wstępnie schłodzonego acetonu do każdej studzienki. Inkubować szkiełko komorowe odpowiednio w temperaturze pokojowej (RT) lub na lodzie przez 20 min.
   nuta: W celu utrwalenia acetonu należy wstępnie schłodzić aceton w temperaturze -20 °C i wstępnie schłodzić szkiełko komory w temperaturze 4 °C. Usunąć plastikowe pokrywki, gdy aceton jest używany do utrwalenia komórek hodowanych w 8-dołkowych szkiełkach komorowych ze szklanym dnem.
3. Przemyć każdą studzienkę dwukrotnie PBS i dodać 200 μl roztworu hartowniczego (PBS, 50 mM NH₄Cl). Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 4 °C.
   nuta: Na tym etapie szkiełko komorowe może pozostać przez co najmniej miesiąc w temperaturze 4 °C przed wykonaniem protokołu immunofluorescencji, zgodnie z opisem⁸. Pokrywka zapobiega parowaniu.

8. Przetwarzanie obrazu

1. Wykonaj dekonwolucję obrazu po akwizycji (tj. dekonwolucję Huygensa lub równoważną, Tabelę materiałów) serii poklatkowych i/lub nieruchomych zdjęć nieruchomych komórek. Dekonwolucja poprzez zastosowanie odpowiedniego oprogramowania (np. za pomocą opcji optycznej "szerokiego pola" w Huygens) i odpowiednich parametrów optycznych. Dekonwolucja wymaga przetwarzania obrazu funkcji mierzonego rozproszenia punktów (PSF) mikroskopu⁴.
2. Alternatywnie, można użyć oprogramowania do obliczenia wyidealizowanego PSF poprzez automatyczne wczytywanie parametrów optycznych zawartych wśród metadanych z plików mikroskopowych. Te parametry optyczne obejmują długość fali fluorochromu, współczynnik załamania światła, aperturę numeryczną obiektywu oraz technikę obrazowania (konfokalne, szerokokątne itp.)⁴.
3. Następnie oprogramowanie do obrazowania wykorzystuje PSF i różne algorytmy dekonwolucji (tj. QMLE i CMLE w oprogramowaniu Huygens) w procesie obliczeniowym krok po kroku, którego wyniki można następnie w sposób ciągły wizualizować i zatrzymywać (lub wznawiać), gdy jest to wymagane przez użytkownika. Na tym etapie użytkownik może zmienić liczbę skrętów i/lub stosunek sygnału do szumu i wznowić dekonwolucję. Oprogramowanie do dekonwolucji działa dobrze z seriami poklatkowymi (X,Y,T) (wideo 2) i stosami Z (X,Y,Z) (wideo 3). Zdekonwolucyjne kanały zostały następnie połączone z CMAC, kanałem surowym, ponieważ cytozolowe, rozproszone fluorochromy nie poprawiają się przez dekonwolucję^4,9.

Results

Postępowaliśmy zgodnie z opisanym protokołem, aby wygenerować koniugaty synaps immunologicznych Jurkat-Raji i prawidłowo zobrazować wczesne etapy powstawania IS. Naszym celem było ulepszenie wczesnych podejść²⁰ stosowanych wcześniej w celu zbadania polaryzacji MTOC i mechanizmów wydzielniczych w kierunku IS. Podejścia te opierały się na strategii punktu końcowego, która nie pozwalała na obrazowanie powstawania IS lub wczesnych zdarzeń synaptycznych, ponieważ w tych strategiach obowiązkowe tworzenie IS występowało w osadach mieszanych, odwirowanych komórek, ale nie pod mikroskopem. Nasz protokół został opracowany w celu uniknięcia tego głównego zastrzeżenia, ponieważ podejście opierało się na zastosowaniu odpowiedniego stężenia komórek (kroki 2 i 3), aby sprzyjać tworzeniu koniugatów IS między komórkami na własnych szkiełkach w komorze mikroskopu (szkiełko z 8 mikrodołkami), zamontowanych na wstępnie podgrzanym inkubatorze mikroskopowym (w kroku 4). Strategia ta indukuje powstawanie IS, równocześnie z wykonaniem zdjęcia poklatkowego (Wideo 1).

Rysunek 1 przedstawia synaptyczne koniugaty Jurkat-Raji, które zostały uzyskane zgodnie z protokołem (krok 5.2). Zdjęcie przedstawia pierwszą klatkę z reprezentatywnego eksperymentu poklatkowego. 2 x 10⁵ komórek Raji i 2 x 10⁵ komórek Jurkata dodano do studzienki o długości 1^cm2. Górny panel pokazuje kanał transmitancji, środkowy panel składa się z kanału CMAC (niebieskiego) (komórki Raji), a dolny panel pokazuje zarówno kanał transmisji jak i scalone kanały CMAC. Żółte strzałki oznaczają niektóre koniugaty synaptyczne jako odniesienie, podczas gdy zielone strzałki wskazują koniugaty synaptyczne utworzone przez jedną komórkę Jurkat i kilka komórek Raji (sprzężone koniugaty). Zmniejszające się stężenia komórek (10⁵ lub mniej komórek w studzience 1 cm²) pozwolą uniknąć tworzenia złożonych koniugatów komórkowych, ale może nie być wystarczającej liczby koniugatów komórkowych do późniejszej analizy ruchu spolaryzowanego (patrz poniżej), co z kolei zmniejszy również szanse na znalezienie i zobrazowanie pojawiających się koniugatów synaptycznych.

Rysunek 2 przedstawia zrzuty ekranu odpowiadające parametrom obrazowania używanym do jednoczesnego przechwytywania dwóch różnych fluorochromów (CMAC i GFP-CD63) za pomocą odpowiedniego oprogramowania (tj. NIKON NIS_AR) w reprezentatywnym eksperymencie poklatkowym odpowiadającym Filmowi 1.

Wideo 1 (Synapsy immunologiczne, surowe) przedstawia limfocyt T Jurkata wyrażający GFP-CD63 (marker ciał wielopęcherzykowych-MVB, zielone pęcherzyki) i tworzenie podwójnej synapsy między 1 komórką Jurkata a 2 komórkami Raji oznaczonymi CMAC, na niebiesko (jedna z nich ulega pochłonięciu). Zarejestrowano jednoczesny ruch MVB wewnątrz komórki Jurkata w kierunku obszarów synaps (szybkość przechwytywania = 1 klatka co 20 sekund dla GFP-CD63; szybkość odtwarzania wideo = 2 klatki na s). Koniugaty synaptyczne uzyskano i zobrazowano zgodnie z protokołem opisanym powyżej (Krok 6.2), który umożliwił obrazowanie powstających synaps (Wideo 1). Jednoczesne wychwycenie kanałów fluorescencyjnych GFP-CD63 i CMAC zostało przeprowadzone przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (tj. NIS-AR, Table of Materials). Film przedstawia nieprzetworzone dane z reprezentatywnego eksperymentu poklatkowego. System automatycznego ustawiania ostrości został zdefiniowany z odpowiednim przesunięciem w stosunku do komórek Raji przywiązanych do szklanego dna, aby zapewnić stabilną ostrość wzdłuż eksperymentu.

Wideo 2 (synapsy immunologiczne, po dekonwolucji) odpowiada Wideo 1, ale dekonwolucja obrazów kanału fluorescencji GFP-CD63 została przeprowadzona przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji (tj. Huygensa), przy użyciu opcji optycznej "szerokiego pola" i odpowiednich parametrów optycznych (krok 8). Ten zdekonwoluowany kanał został następnie scalony z CMAC, kanałem surowym. Widoczna jest poprawa zarówno stosunku sygnału do szumu, jak i ostrości obrazu. Dekonwolucja została przeprowadzona po przejęciu, jak opisano powyżej. Szczegółowe informacje na temat oprogramowania do dekonwolucji można znaleźć na stronie ⁴.

Wideo 3 (synapsa immunologiczna, po utrwaleniu i barwieniu immunofluorescencyjnym) reprezentuje stos Z (rozmiar kroku z = 0,8 μm, 5 klatek) stałego koniugatu IS po kroku 6 protokołu (utrwalanie acetonu). Po utrwaleniu przeprowadzono immunofluorescencję zgodnie ze standardowymi protokołami²⁵ przy użyciu falloidyny do wizualizacji F-aktyny (zielona), anty-CD63 do wizualizacji MVB (magenta), anty-γ-tubuliny do wizualizacji MTOC (czerwona). CMAC (niebieski) oznacza komórkę Raji. Następnie koniugat zobrazowano metodą epifluorescencji, a kilka kanałów zdekonwolucjonowano przy użyciu opcji optycznej "szerokiego pola" i odpowiednich parametrów optycznych (krok 7). Zdekonwolucyjne kanały zostały następnie połączone z CMAC, kanałem surowym, jak wskazano w różnych panelach (odpowiednio CMAC plus Transmittance-TRANS, CMAC plus Phallodin, CMAC plus anty-CD63 i CMAC plus anty-γ-tubulina). Biała strzałka oznacza synapsę, podczas gdy zielona strzałka oznacza MVB, a żółta strzałka oznacza MTOC. Szczegółowa kwantyfikacja polaryzacji MVB i MTOC została wyjaśniona w innym miejscu²⁵.

Przedstawione tutaj podejście obejmuje tworzenie koniugatów międzykomórkowych i jednoczesną akwizycję poklatkową za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu widzenia (WFFM), po której następuje przetwarzanie obrazu (dekonwolucja po akwizycji). Taktyka ta poprawiła stosunek sygnału do szumu (SNR) obrazów, zwiększyła ich rozdzielczość czasową i umożliwiła zsynchronizowane pozyskiwanie kilku fluorochromów w powstających koniugatach synaptycznych⁴. Ponadto protokół jest dobrze dopasowany do kolejnych metod utrwalania komórek w punkcie końcowym (paraformaldehyd, aceton lub metanol), co pozwoliłoby na dalsze barwienie i analizy immunofluorescencyjne²⁵ (Wideo 3). Protokół ten jest również kompatybilny z laserową skaningową mikroskopią konfokalną i innymi najnowocześniejszymi technikami mikroskopii.

Rycina 1: Reprezentatywne pole mikroskopowe o podwójnej wielkości koniugatów synaptycznych. Obraz przedstawia pierwszą klatkę z reprezentatywnego eksperymentu poklatkowego przeprowadzonego zgodnie z protokołem. Górny panel pokazuje kanał transmitancji, środkowy kanał CMAC (komórki Raji), a dolny panel oba połączone kanały. Żółte strzałki oznaczają niektóre koniugaty synaptyczne jako odniesienie. Zielone strzałki wskazują złożone koniugaty synaptyczne (tj. jedną komórkę Jurkata tworzącą synapsy z więcej niż jedną komórką Raji). Uchwycone obiektywem EWD (0,6 NA) o powiększeniu 40x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ustawienia mikroskopu poklatkowego. Obraz odpowiada kilku zrzutom ekranu odpowiadającym parametrom obrazowania użytym do jednoczesnego uchwycenia dwóch różnych fluorochromów (CMAC i GFP-CD63) za pomocą odpowiedniego oprogramowania (tj. NIKON NIS_AR) w reprezentatywnym eksperymencie poklatkowym odpowiadającym Wideo 1. Każda klatka dla kanału GFP-CD63 była rejestrowana co 20 s. Tylko jedna klatka dla kanału UV z ośmiu ramek dla kanału GFP została przechwycona, aby utrzymać żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Synapsy immunologiczne wytwarzane przez komórkę Jurkat eksprymującą GFP-CD63, dane surowe. Limfocyty B Raji oznaczone niebieskim trackerem komórek (CMAC, niebieskie) pulsowano SEE przez 30 minut i utworzono synapsy z komórkami Jurkat eksprymującymi GFP-CD63⁸. Zarejestrowano filmy poklatkowe odpowiadające kanałom GFP-CD63 i CMAC (20 s na klatkę; szybkość odtwarzania wideo = 2 klatki na s) i pokazano reprezentatywny przykład. Uchwycone za pomocą obiektywu PLAN APO (1,4 NA) o powiększeniu 60x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Wideo 2: Synapsy immunologiczne wytwarzane przez komórkę Jurkat eksprymującą GFP-CD63 po dekonwolucji. Tak samo jak w przypadku filmu 1, ale obrazy zostały zdekonwolucyjne za pomocą oprogramowania do dekonwolucji. Widoczny jest lepszy stosunek sygnału do szumu i zwiększona ostrość dzięki eliminacji zanieczyszczeń fluorescencyjnych nieostrych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Wideo 3: Utrwalona i immunologicznie wybarwiona synapsa immunologiczna. Obraz przedstawia reprezentatywny ustalony koniugat synaptyczny po kroku 7 protokołu i następującej po nim immunofluorescencji. CMAC (niebieski) oznacza odpowiednio komórki raji, transmitancję (TRANS), aby pokazać koniugat synaptyczny (biała strzałka), etykiety falloidyny F-aktynę (zielona), etykiety anty-CD63 MVB (magenta, zielona strzałka) i etykiety anty-γ-tubuliny MTOC (czerwona, żółta strzałka). Kanały te zostały zobrazowane za pomocą epifluorescencji, zdekonwolucyjne i połączone zgodnie ze wskazaniami. Film zawiera stos Z (rozmiar kroku Z = 0,8 μm, 5 klatek). Biała strzałka oznacza obszar kontaktu synaptycznego, podczas gdy zielona strzałka oznacza MVB, a żółta strzałka oznacza MTOC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Discussion

Ograniczeniem tego protokołu jest to, że nie wszystkie synapsy będą idealnie zorientowane prostopadle do osi optycznej. Korzystając z tej techniki, nie ma sposobu, aby przewidzieć i/lub wpłynąć na idealną orientację obrazowania synaps immunologicznych. Aby rozwiązać ten problem, wykluczamy z kolejnych analiz wszystkie losowo schwytane synapsy, które ostatecznie nie spełniają idealnych kryteriów. Synapsy te, w odpowiednim momencie, nie są zbyt częste. Możliwe jest jednak obejście tego ograniczenia za pomocą kilku podejść eksperymentalnych⁴.

Spolaryzowane uwalnianie (degranulacja) CD63 można określić ilościowo za pomocą innych technik uzupełniających, takich jak barwienie powierzchni komórki CD63 (relokalizacja CD63 na powierzchnię komórki) w żywych komórkach (nie utrwalonych i nieprzepuszczalnych), po kroku 6, a następnie mycie i utrwalanie, jak pokazano wcześniej⁸. Ponadto można przeprowadzić uwalnianie CD63 na egzosomach ^8,9 i kwantyfikację egzosomów za pomocą analiz śledzenia nanocząstek ^9,25. Podejścia te są z pewnością zgodne z naszym protokołem, pod warunkiem, że fiksacja jest wykonywana po immunofluorescencji powierzchni żywych komórek.

Odkryliśmy, że idealna liczba komórek (dla studzienki o średnicy 1^cm2 w szkiełku z 8 dołkami) to 4 x 10⁵ komórek (2 x 10⁵ komórek Raji i 2 x 10⁵ komórek Jurkata), ponieważ skutecznie przylegają one do dna studzienki. Skuteczność wiązania z mikroszkiełkami z tworzywa sztucznego (przy użyciu fibronektyny) lub szklanym dnem (przy użyciu poli-L-lizyny) zwykle nie stanowi problemu. Wyższa liczba komórek może nie powodować przerw między przylegającymi komórkami, a następnie złożonymi koniugatami synaptycznymi (ryc. 1); Obie sytuacje nie są pożądane, gdy pojedyncze koniugaty komórka-komórka muszą być obrazowane, na przykład w eksperymentach z polaryzacją MTOC lub granulek wydzielniczych. Mniejsza liczba komórek może zmniejszyć szanse na znalezienie koniugatów, zwłaszcza gdy transfekowane komórki Jurkata są prowokowane APC w celu wytworzenia synaps. Należy pamiętać, że zaobserwowaliśmy, że stabilizowany temperaturowo inkubator ze stopniem X/Y umieszczony na stoliku mikroskopu X/Y przed rozpoczęciem protokołu (tj. 1-2 godziny wcześniej w celu ustabilizowania stolika/mikroskopu) utrzymuje stabilne parametry X,Y,Z, co ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego obrazowania. System automatycznego ustawiania ostrości ostatecznie skompensuje niewielkie zmiany Z.

Gdy niektóre techniki transdukcji genów, takie jak elektroporacja, są stosowane do ekspresji fluorescencyjnych białek chimerycznych (tj. GFP-CD63) w klonach Jurkat (Wideo 1), znaczna część komórek może umrzeć po elektroporacji. Może to stanowić problem, ponieważ chociaż martwe komórki nie tworzą synaps, gdy są w nadmiarze nad żywymi, transfekowanymi komórkami, mogą zakłócać tworzenie koniugatów tworzonych przez żywe komórki Th. Odkryliśmy, że staranna eliminacja martwych komórek z transfekowanych kultur za pomocą pożywki o gradionym gradiencie gęstości zgodnie ze standardowymi protokołami przed etapem tworzenia koniugatu może rzeczywiście zwiększyć szanse na prawidłowe zobrazowanie koniugatów. Ponadto niska skuteczność transfekcji (<20%) może być ważnym zastrzeżeniem, ponieważ to, w połączeniu z umiarkowaną wydajnością tworzenia koniugatów (około 60%)²⁵, zmniejszy prawdopodobieństwo znalezienia koniugatów wykonanych przez transfekowane komórki. Nie stanowi to problemu, gdy nietransfekowane komórki są używane do otrzymywania koniugatów w eksperymentach z punktami końcowymi i późniejszej fiksacji. 8 szkiełek z komorą mikrodołkową jest kompatybilnych z konwencjonalnymi protokołami immunofluorescencji. Zwiększa to elastyczność powyższego protokołu o różnych celach. Mocowanie acetonem może stanowić problem do rozważenia w przypadku korzystania ze zjeżdżalni komorowych ze studzienkami z plastikowym dnem. Istnieją jednak dostępne na rynku 8 szkiełek mikroskopowych z 8 mikrodołkami, zawierające szklane dno, które są kompatybilne z utrwalaniem acetonu. Zdejmij plastikowe pokrywki, gdy aceton jest używany do utrwalenia komórek hodowanych w 8 szkiełkach mikroskopowych ze szklanym dnem.

Zaleca się, aby mikroskop był wyposażony w zmotoryzowany stolik XY, zmotoryzowaną wieżyczkę epifluorescencyjną i system automatycznego ustawiania ostrości (np. Perfect Focus System) lub równoważne dodatki. Gdy wymagana jest akwizycja wielodołkowa²⁵, system automatycznego ustawiania ostrości zapewni stabilną ostrość przez cały czas trwania eksperymentu. Wcześniejsze doświadczenia wskazują, że poprzez ustanowienie odpowiedniego przesunięcia ostrości na komórkach Raji, zarówno ruch limfocytów T (Wideo 1), jak i ruchy stolika/szkiełka mikroskopu w eksperymentach wielopunktowych XY, mogą być kompensowane. Jest to rzeczywiście wygodne do robienia zdjęć poklatkowych z wieloma dołkami.

Użyto czarno-białej, panchromatycznej i chłodzonej kamery z ładowanym urządzeniem sprzężonym (CDD), ale pożądana jest kamera o wyższej czułości, fluorescencyjna naukowa z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (sCMOS), ponieważ skróci to czas naświetlania kamery i poprawi rozdzielczość czasową. Zastosowane przez nas krótkie czasy naświetlania aparatu (od 100 ms do 500 ms) w połączeniu z automatyczną migawką fluorescencyjną pozwalają na długotrwałe uchwycenie poklatkowe (do 24 h) z odpowiednią rozdzielczością czasową (1 klatka na minutę lub mniej, dla maksymalnie 16 pozycji XY) bez znacznego blaknięcia fluorescencji i/lub utraty żywotności komórek. Zmotoryzowany stolik umożliwia przechwytywanie wielopunktowe (XY) i zwiększa szansę na znalezienie i zobrazowanie pojawiających się i rozwijających się synaps w idealnej orientacji, ale także umożliwia akwizycję obrazu w szkiełkach wielodołkowych, gdy różne klony Jurkata muszą być jednocześnie sprzężone²⁵. Duża apertura numeryczna obiektywu (tj. 60x, 1,4) jest niezbędna do uzyskania najlepszych wyników przy analizie ruchu granulek wydzielniczych.

RAJI-SEE-Jurkat stanowi dobrze ugruntowany model synapsy immunologicznej, który był używany przez niezliczoną liczbę badaczy od czasu jego pierwotnego^opisu11. Dostosowaliśmy nasz protokół do tego modelu, aby prawidłowo zobrazować wczesne etapy powstawania IS. Naszym celem było udoskonalenie wczesnych podejść^stosowanych wcześniej do badania polaryzacji MTOC i mechanizmów wydzielniczych w stosunku do IS. Godne uwagi jest to, że koniugaty wykonane za pomocą tego protokołu powodują reorganizację F-aktyny w synapsie, konfigurując kanoniczny SMAC, jednocześnie z ruchem spolaryzowanym MVB²⁵. Te kluczowe zdarzenia zostały również przeanalizowane i potwierdzone za pomocą mikroskopii konfokalnej²⁵.

Różnice kinetyczne w ruchu spolaryzowanym istnieją między różnymi typami IS. Na przykład spolaryzowany transport granulek litycznych z CTL odbywa się w ciągu kilku sekund lub bardzo kilku minut, podczas gdy kilka pęcherzyków zawierających cytokiny z limfocytów Th trwa od kilku minut do kilku godzin. Te różnice czasowe muszą być wzięte pod uwagę z wyprzedzeniem, aby opracować najlepszą strategię i wybrać najodpowiedniejsze podejście eksperymentalne i obrazowe, ponieważ w przypadku niektórych strategii obrazowania (np. laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej (LSCM)) czas może być czynnikiem ograniczającym, ponieważ czas przechwytywania jest znacznie dłuższy niż odpowiednia rozdzielczość czasu (1 minuta lub mniej)⁴. Nie stanowi to ograniczenia, gdy używana jest mikroskopia fluorescencyjna o szerokim polu widzenia (WFFM), jak opisano w powyższym protokole. Ponieważ w CTL polaryzacja MTOC w kierunku synapsy trwa tylko kilka minut ^3,6,17, w celu prawidłowego zobrazowania tych synaps konieczne są różne specyficzne, najnowocześniejsze podejścia mikroskopowe, różniące się od opisanego tutaj (ale o wyższej rozdzielczości przestrzennej i czasowej)^26,27, głównie podczas obrazowania kilku pól mikroskopowych (przechwytywanie wielopunktowe). Te nowe podejścia o wysokiej rozdzielczości mogą być również wykorzystane do obrazowania synaps wytwarzanych przez limfocyty Th, chociaż względy ekonomiczne i/lub logistyczne (tj. podstawowy sprzęt wymagany do niektórych z tych technik obrazowania kosztuje 6-7 razy więcej niż ten opisany tutaj) z pewnością mogą stanowić ograniczenie dla tych najnowocześniejszych metod obrazowania⁴. Fakt, że IS wytwarzane przez limfocyty Th są długowieczne, oraz okoliczność, że w limfocytach Th MTOC, pęcherzyki wydzielnicze zawierające limfokiny i MVB potrzebują od kilku minut do godzin na transport i dokowanie do IS²², sprawia, że protokół ten jest idealnym, niedrogim podejściem do obrazowania Th-APC IS.

WFFM w połączeniu z dekonwolucją obrazu po akwizycji stanowi ciekawe podejście i nie tylko względy ekonomiczne przemawiają za tą strategią. Wewnętrzna słaba rozdzielczość w osi Z (najważniejsze zastrzeżenie techniki) może być poprawiona za pomocą dekonwolucji obrazu po akwizycji⁴ (porównaj Wideo 1 z Wideo 2). Dekonwolucja wykorzystuje oparte na obliczeniach podejście do przetwarzania obrazu, które może poprawić stosunek sygnału do szumu oraz rozdzielczość i kontrast obrazu od²⁷ do 2 razy, do 150-100 nm w osi XY i 500 nm w osi Z⁴.

Zastosowanie wyższej czułości, dużej prędkości odczytu i szerokiego zakresu dynamiki, nowych fluorescencyjnych kamer sCMOS poprawi jakość obrazów i zmniejszy blaknięcie fluorescencji. Elastyczność oferowana przez opisany tutaj protokół koniugacji komórka-komórka pozwala na połączenie opisanego podejścia komórkowego z kilkoma najnowocześniejszymi technikami mikroskopowymi, zarówno w komórkach żywych, jak i w komórkach utrwalonych, a oczekiwany wynik rzeczywiście poszerzy naszą wiedzę na temat synapsy immunologicznej.

Chociaż wdrożyliśmy i zwalidowaliśmy protokół, wykorzystując łatwe w obsłudze, dobrze znane linie komórkowe, potencjał tego podejścia może pozwolić na wizualizację bardziej fizjologicznych interakcji, gdy używane są pierwotne limfocyty T i różne typy komórek prezentujących antygen (takie jak komórki dendrytyczne makrofagów)⁵. W tym kontekście protokół ten został również rozszerzony i zwalidowany przy użyciu pulsacyjnej linii komórkowej EL-4 myszy z superantygenem (SEB), używanej jako APC, do prowokacji pierwotnych mysich limfoblastów T⁹. Rzeczywiście, pierwotne limfocyty T, w szczególności CTL, powodowały bardziej krótkotrwałe i dynamiczne kontakty synaptyczne (patrz Dodatkowe wideo 8 w odnośniku⁹) do tych obserwowanych za pomocą modelu SEE-Raji i Jurkat. Zmienność trybów kontaktu synaptycznego można najlepiej zaobserwować w przypadku pierwotnych interakcji limfocytów T z komórkami dendrytycznymi lub komórkami B w dwuwymiarowych odpowiednikach tkankowych in vitro, które można również rejestrować i analizować przy użyciu tego protokołu. Ponadto, oprócz superantygenów, technika ta może być stosowana do obrazowania innych typów synaps. Na przykład można go zastosować w transgenicznym, specyficznym dla antygenu modelu limfocytów T TCR, na przykład przy użyciu mysiego systemu OT1/OT2 specyficznego dla albuminy jaja kurzego lub poprzez transfekcję limfocytów T z receptorami limfocytów T specyficznymi dla antygenu. Otwiera to niezliczone możliwości eksperymentalne na najbliższą przyszłość.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aparat Nikon DS-QI1MC	Nikon	MQA11550	Chłodzona głowica kamery
CMAC	ThermoFisher Scientific	C2110	Cell tracker niebieski
Komórki JURKAT	ATCC	ATCC TIB-152	Efektor limfocytów T
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom	IBIDI	Cat.No: 80826, 80827	Hodowla komórkowa i wspomaganie obrazowania komórkowego
Mikroskop NIKON Eclipse Ti-E	Nikon	NIKON Eclipse Ti-E	Fluorescencyjny mikroskop szerokokątny, w pełni zmotoryzowany, wyposażony w opcję Perfect Focus System (PFS)
Inkubator mikroskopowy z 3-kanałowym ręcznym mieszalnikiem gazów i modułem bełkotki/wilgotności OKOLAB		H201-NIKON-TI-S-ER	Atmosfera hodowli komórkowych
Raji Cells	ATCC	ATCC CCL-86	APC
RPMI medium GIBCO	ThermoFisher Scientific	21875034	Pożywka
Streptococcus Enterotoxin E (SEE)	Toxin Technology, Inc	EP404	Oprogramowanie do toksyn bakteryjnych
Huygens Essential	SVI	Oprogramowanie Huygens Essential	Image Deconvolution
Oprogramowanie ImageJ	NIH	Image J	Oprogramowanie do obrazowania
Nikon NIS-AR	Nikon	NIS-Elements AR	Oprogramowanie do przechwytywania i analizy obrazów