Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.
Artykuł metodologiczny
Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Potrójnie ujemny rak piersi (TNBC) to agresywny podtyp raka piersi z ograniczonymi możliwościami terapeutycznymi. W porównaniu z pacjentkami z mniej agresywnymi nowotworami piersi, 5-letnie przeżycie pacjentek z TNBC wynosi 77% ze względu na charakterystyczny dla nich fenotyp lekooporności i obciążenie przerzutami. W tym celu stworzono modele mysie mające na celu zidentyfikowanie nowych strategii terapeutycznych ograniczających wzrost guza TNBC i rozprzestrzenianie się przerzutów. W niniejszej pracy opisano praktyczny przewodnik po modelu ortotopowym TNBC, w którym komórki raka piersi MDA-MB-231 zawieszone w macierzy błony podstawnej są wszczepiane do czwartej poduszeczki tłuszczowej sutka, która ściśle naśladuje zachowanie komórek rakowych u ludzi. Omówiono pomiar guzów za pomocą suwmiarki, ocenę przerzutów do płuc za pomocą obrazowania in vivo i ex vivo oraz detekcję molekularną. Model ten stanowi doskonałą platformę do badania skuteczności terapeutycznej i jest szczególnie odpowiedni do badania interakcji między guzem pierwotnym a dystalnymi miejscami przerzutów.
Wprowadzenie
Około jedna na osiem kobiet w Stanach Zjednoczonych zachoruje na inwazyjnego raka piersi w ciągu swojego życia, a u 10%−20% tych kobiet zostanie zdiagnozowany agresywny podtyp potrójnie ujemnego raka piersi (TNBC). Podczas gdy pierwotne zmiany można w większości przypadków usunąć chirurgicznie, subkliniczne mikroprzerzuty i chemooporność sprawiają, że jest to choroba nieuleczalna. Co ważne, u większości pacjentów z przerzutowym TNBC dochodzi do nawrotu choroby, nawet jeśli przeszli leczenie we wczesnym stadium1. W związku z tym heterogeniczność nowotworu, mikroprzerzuty i oporność na leczenie to trzy główne wyzwania ograniczające pomyślne wyniki kliniczne pacjentów z TNBC. W związku z tym istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia polimorficznego tła molekularnego TNBC i opracowania skutecznych środków terapeutycznych ograniczających chorobę przerzutową.
Przerzuty nowotworowe to wieloetapowy proces, w którym komórka nowotworowa kontroluje i uzurpuje sobie prawo do swojego mikrośrodowiska, aby promować swoje rozprzestrzenianie się poprzez degradację błony i ucieczkę komórek nowotworowych z pierwotnej zmiany, poprzez wejście (tj. wewnątrznaczynienie) i wyjście z (tj. wynaczynienie) układu naczyniowego, a ostatecznie adaptację i kolonizację w dystalnych łożyskach tkankowych2. Modele zwierzęce zostały opracowane w celu badania przerzutów raka piersi, w których powszechnie stosuje się dwie metodologie: bezpośrednie wstrzyknięcie do krążenia krwi i implantację ortotopową. Powszechnie stosowane metody bezpośredniego wstrzykiwania krwi obejmują wstrzyknięcie do żyły ogonowej, podczas gdy inne podejścia, w tym bezpośrednie wstrzyknięcie do serca3, bezpośrednie wstrzyknięcie do mózgu4 i bezpośrednie wstrzyknięcie do wątroby5 również zostały zastosowane. Bezpośrednie wstrzyknięcie do krążenia krwi jest często określane jako sztuczny model przerzutów, który jest szybki i łatwy, ale mniej fizjologicznie dokładny, ponieważ omija ucieczkę guza z pierwotnej zmiany i wewnątrznaczynienia6,7,8. W porównaniu z modelami iniekcji bezpośredniej, ortotopowy model raka piersi potrzebuje więcej czasu na wystąpienie wykrywalnych zmian przerzutowych w odległych narządach, takich jak płuca, ale jest bardziej istotny fizjologicznie, ponieważ ściśle naśladuje wieloetapowy proces przerzutowy, jaki występuje u ludzi. Co ważne, w badaniu z 2013 r. 9 porównano model iniekcji do żyły ogonowej i model ortotopowy i stwierdzono, że komórki raka piersi wstrzyknięte do żyły ogonowej oraz te wyizolowane ze zmian przerzutowych do płuc po wstrzyknięciu żyły ogonowej wykazywały podobne globalne profile ekspresji genów. W przeciwieństwie do tego, globalny profil ekspresji genów komórek raka piersi wstrzykniętych ortotopowo różnił się od zmian przerzutowych do płuc wynikających z komórek wstrzykniętych ortotopowo9. Obserwacje te sugerują, że model ortotopowy jest bardziej istotny fizjologicznie, ponieważ zmiany przerzutowe podlegają procesowi selekcji podobnemu do wieloetapowego procesu przerzutów, jaki występuje u ludzi.
Ta praca opisuje model ortotopowego raka piersi (MDA-MB-231-Luc/GFP) u nagich myszy, który został zoptymalizowany w naszym laboratorium pod kątem technik wykrywania obrazowego, jak również identyfikacji nowych biomarkerów i rozwoju celowanych środków chemioterapeutycznych.
Protokół
Analizę wzrostu guza przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Narodowego Instytutu Raka (National Cancer Institute), przestrzegając zaleceń zawartych w „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” Narodowej Rady Badań USA (National Research Council), „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” Publicznej Służby Zdrowia USA (Public Health Service) oraz w „Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals”.
1. Przygotowanie komórek do implantacji
UWAGA: Komórki ludzkiego gruczolakoraka piersi MDA-MB-231 (nabyte komercyjnie) zostały stabilnie przetransfekowane genem lucyferazy III oraz markerem wzmocnionej zielonej białka fluorescencyjnego (GFP) za pomocą lentiwirusa i hodowane w obecności antybiotyku selekcyjnego (puromycyny).
- Rozpocząć hodowlę komórkową, wykorzystując 1 x 106 komórek MDA-MB-231-Luc/GFP, i dodać 15 mL podgrzanego (37 °C) pożywki RPMI 1640 z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do kolby hodowlanej T75. Hodować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych z kontrolą temperatury w 37 °C i 5% CO2. Wymieniać pełną pożywkę co najmniej 2 razy w tygodniu.
UWAGA: Nie zakłócać wzrostu komórek i codziennie sprawdzać warunki hodowli. Komórki należy pasażować po osiągnięciu 85%−90% konfluencji, aby utrzymać fazę proliferacji. - Na tydzień przed etapem implantacji komórek usunąć puromycynę z kolby hodowlanej, najpierw usuwając całą pożywkę z kolby, następnie płucząc 2 razy 10 mL 1x roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), a na koniec zastępując pożywkę pełną pożywką bez puromycyny. Podczas etapów dodawania pożywki i płukania nie zakłócać komórek. Należy pamiętać, aby od tego momentu we wszystkich etapach uzupełniania pożywki nie używać pełnej pożywki z antybiotykami selekcyjnymi.
- W dniu przygotowania komórek do implantacji usunąć całą pełną pożywkę przed trypsynizacją, aby uniknąć dezaktywacji trypsyny. Do kolby dodać 5 mL trypsyny w celu trypsynizacji komórek. Monitorować komórki i upewnić się, że odrywają się one od ścianek kolby hodowlanej.
- Gdy większość komórek się oddzieli, dodać 10 mL pełnej pożywki, aby zneutralizować aktywność trypsyny. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL i wirować przy ok. 150 x g, aby uzyskać pellet komórkowy. Po wirowaniu usunąć nadosad, a następnie dodać 10 mL 1x PBS, aby resuspendować komórki i przygotować je do zliczenia.
- Policzyć komórki za pomocą licznika komórek i dostosować stężenie komórek do 20 x 106 komórek/mL w zimnym 1x PBS zawierającym 25% macierzy błony podstawnej. Wstrzyknąć 2 x 106 komórek w 0,1 mL 1x PBS z 25% macierzą błony podstawnej do czwartego poduszki tłuszczowej gruczołu piersiowego każdej myszy. Przygotować dodatkowe igły i strzykawki do implantacji komórek, a mieszaninę komórek z macierzą błony podstawnej przechowywać w lodzie przed implantacją.
UWAGA: W strzykawce i igle występuje przestrzeń martwa. W zależności od wyboru długości, typu i rozmiaru igły oraz strzykawki, strzykawka tuberkulinowa z igłą 26 G o długości 0,5 cala może mieć do 70 µL przestrzeni martwej10. Przygotować o 40%−50% więcej mieszaniny do implantacji komórek, aby zrekompensować przestrzeń martwą oraz wszelkie inne przypadkowe straty.
2. Ortotopowy model raka piersi i pomiar wielkości guza
- Pozwól 6-tygodniowym samicom beztymusowych myszy nude na aklimatyzację w pomieszczeniu chownym przez co najmniej 1 tydzień przed implantacją komórek.
UWAGA: Stosowanie myszy w tym samym wieku zmniejszy zmienność danych. - W każdej serii znieczul pięć myszy izofluranem w stężeniu 4% w przefiltrowanym (0,2 µm) powietrzu przy przepływie 1 L/min przez 3−4 min. Zwróć uwagę na częstotliwość i wzorzec oddechów myszy i zastosuj uciśnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że myszy znajdują się pod odpowiednim znieczuleniem. Gdy przestaną się poruszać, wyjmij jedną mysz i załóż na jej nos i pysk maskę z tym samym środkiem znieczulającym.
- Przetrzyj lewy 4ty gruczoł mlekowy alkoholem. Używając precyzyjnej pęsety stomatologicznej do szczurów, lekko unieś 4ty gruczoł mlekowy, aby wprowadzić igłę 25 G. Upewnij się, że ścięcie igły jest skierowane do góry, a następnie lekko pociągnij tłok, aby upewnić się, że igła nie przebiła żadnego naczynia krwionośnego. Jeśli do strzykawki nie dostanie się krew, kontynuuj powolne wstrzykiwanie 100 µL mieszaniny komórek z macierzą błony podstawnej do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego.
UWAGA: Pod skórą pojawi się okrągły, wypukły obszar. - Odczekaj 10−15 s, aż macierz błony podstawnej stwardnieje, a następnie wyjmij igłę. Powtórz proces z pozostałymi myszami w komorze indukcyjnej. Wszystkie zużyte igły i strzykawki umieść w pojemniku na odpady ostre.
- U wszystkich myszy stosuj to samo miejsce wstrzyknięcia do gruczołu mlekowego. Uważnie obserwuj miejsce wstrzyknięcia i odnotuj wszelkie wycieki mieszaniny do implantacji komórek z miejsca wstrzyknięcia.
UWAGA: W ciągu kilku minut mysz zacznie odzyskiwać przytomność. - Pozwól ksenoprzeszczepowi swobodnie rosnąć bez żadnych zakłóceń przez 7−10 dni przed jakimkolwiek pomiarem wielkości guza.
- Zbadaj wielkość ksenoprzeszczepu u wszystkich myszy. Zmierz wielkość guza za pomocą suwmiarki. Oblicz objętość guza (mm3) za pomocą następującego wzoru:
gdzie L to największy wymiar, a W to najmniejszy wymiar prostopadły do L. - Zidentyfikuj i usuń wartości odstające przekraczające jedno odchylenie standardowe średniej. Do eksperymentów wykorzystuj tylko myszy o porównywalnych wielkościach guzów. Losowo podziel myszy na różne grupy terapeutyczne i rozpocznij leczenie.
- Mierz wielkość guza suwmiarką 2 razy w tygodniu. Notuj wszystkie zmiany fizyczne ksenoprzeszczepów (np. martwicę, przerwanie ciągłości tkanki).
3. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo oraz fluorescencyjne ex vivo
UWAGA: W niniejszym badaniu zarówno dwuwymiarowe obrazowanie bioluminescencyjne, jak i fluorescencyjne przeprowadzono w punkcie końcowym eksperymentu. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) wykonano przy użyciu komercyjnego przedklinicznego skanera optycznego wyposażonego w 16-bitową chłodzoną kamerę CCD oraz podgrzewaną platformę obrazującą.
- Przed obrazowaniem znieczul do pięciu myszy z nowotworami w komorze indukcyjnej, ustawiając stężenie izofluranu na 3% w przefiltrowanym (0,2 µm) powietrzu przy przepływie 1 L/min przez 3−4 min. Głębokość znieczulenia oceń za pomocą uciśnięcia palca u stopy. Upewnij się, że komora indukcyjna znajduje się w dygestorium, aby zminimalizować ekspozycję personelu na izofluran.
- Podaj D-lucyferynę (150 mg/kg) znieczulonym myszom drogą dosytnijną, używając igły 27 G, a następnie przenieś znieczuloną mysz do komory obrazowania. W komorze obrazowania skanera utrzymuj stężenie izofluranu na poziomie 2%−2,5% z O2 jako gazem nośnym przy przepływie 1 L/min.
UWAGA: Podczas procedury utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie ~37 °C, stosując podgrzewaną podkładkę pod komorą indukcji znieczulenia, stołem do obrazowania (jeśli stolik nie jest podgrzewany) oraz w klatce do wybudzania po zabiegu. - Przed obrazowaniem myszy badawczych wyznacz kinetykę lucyferyny, obrazując trzy dodatkowe myszy z nowotworami (zwierzęta nieprzypisane do żadnej grupy badawczej) w odstępach 2 min przez łącznie 40 min, stosując następujące parametry: filtr wzbudzenia – zablokowany, filtr emisji – otwarty, f/stop 1, FOV-D, średnie binningowanie (8 x 8) oraz automatyczny czas naświetlania. Wykorzystaj zmierzony szczytowy sygnał bioluminescencji do zdefiniowania optymalnego okna czasowego akwizycji obrazu dla wszystkich kolejnych punktów czasowych.
- Podczas obrazowania przerzutów osłoń wysoki sygnał BLI z guza pierwotnego, zakrywając go mankietem wyciętym z czarnej rękawiczki. Uzyskaj obraz przy użyciu tych samych parametrów opisanych w kroku 3.3, kierując stronę brzuszną myszy w stronę kamery w przypadku obrazowania przerzutów do płuc oraz stronę grzbietową w przypadku obrazowania przerzutów do mózgu.
UWAGA: Niezbędne jest przetestowanie kilku różnych marek czarnych rękawiczek, aby wybrać tę o minimalnej autoluminescencji. - Za pomocą skanera i oprogramowania do analizy danych wyznacz standardowy obszar zainteresowania (ROI) nad jamą klatki piersiowej lub mózgiem, upewniając się, że cały interesujący organ jest objęty obszarem, aby ocenić obciążenie przerzutami. Ilościowo określ sygnał bioluminescencji (BL) jako całkowity strumień (fotony/sekundę).
- Bezpośrednio po BLI uśmierć mysz poprzez asfiksję CO2 (zgodnie z wytycznymi ACUC i zatwierdzonymi w instytucji protokołami dotyczącymi zwierząt) i wyizoluj płuca oraz mózg za pomocą nożyczek sekcyjnych i pęsety do obrazowania ex vivo.
UWAGA: Płuca pobrane do obrazowania ex vivo oraz do liczenia guzków przerzutowych nie mogą pochodzić od tej samej myszy ze względu na niekompatybilność procedur. - Szybko opłucz wszystkie organy roztworem 1x PBS, aby usunąć powierzchowne zabrudzenia krwią, i umieść je na czarnej plastikowej płytce o niskiej autofluorescencji. Przenieś organy do wielospektralnego skanera fluorescencyjnego wyposażonego w funkcję rozdzielania spektralnego (tuning długości fali za pomocą ciekłokrystalicznych tranzystorów polowych) z 12-bitową kamerą CCD do detekcji GFP.
- Uzyskaj wielospektralne obrazy GFP (filtr wzbudzenia = 457 ± 23 nm; filtr emisji = 490 nm long pass) wyizolowanych organów oraz myszy kontrolnych bez nowotworów, skanując zakres 500−720 nm z krokiem 10 nm. Użyj organów wyciętych od myszy kontrolnych bez nowotworów w celu korekcji autofluorescencji.
- Po wielospektralnym obrazowaniu GFP określ optymalne ustawienia obrazowania. Przeprowadź akwizycję obrazów wszystkich organów docelowych i wykonaj analizę obrazu (tj. wygeneruj bibliotekę spektralną dla autofluorescencji i GFP do procedury rozdzielania spektralnego) zgodnie z protokołem producenta.
4. Molekularna detekcja przerzutowych komórek raka piersi
- Po obrazowaniu ex vivo zamroź gwałtownie cały mózg w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C w zamrażarce do momentu rozpoczęcia ekstrakcji DNA.
- W celu ekstrakcji DNA umieść cały mózg w 5 mL probówce do homogenizacji z 2 mL buforu do lizy DNA. Użyj homogenizatora z ustawieniem mocy 50, aby zhomogenizować gwałtownie zamrożoną tkankę całego mózgu. Po całkowitej homogenizacji tkanki mózgowej przenieś 1 mL zawiesiny (lizatu) do wolnej od DNazy i RNazy probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL i kontynuuj izolację DNA zgodnie z protokołem producenta.
UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie DNA przenoszone między próbkami, dokładnie oczyść homogenizator po każdej próbce, najpierw płucząc go 75% etanolem w wodzie wolnej od DNazy i RNazy, następnie roztworem 1 M NaOH, a na koniec ponownie 75% etanolem w wodzie wolnej od DNazy i RNazy, aby skutecznie zredukować i zniszczyć wszelkie pozostałości DNA. - Do lizatu dodaj 0,5 mL 100% etanolu lub buforu do lizy DNA. Wymieszaj próbkę poprzez odwracanie i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 3 min.
UWAGA: Nie odwracaj probówki zbyt wiele razy ani zbyt gwałtownie. DNA będzie widoczne jako osad przypominający wełnę. - Za pomocą końcówki pipety przenieś DNA do nowej, wolnej od DNazy i RNazy probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Pozostaw próbkę do wyschnięcia na powietrzu przez 1 min. Dodaj 1 mL 75% etanolu i odwróć probówkę 3−6x, aby wyprać próbkę DNA. Po każdym przemyciu usuń etanol za pomocą pipety. Powtórz etap przemywania 2x.
- Wysusz próbkę DNA na powietrzu przez 10 s. Następnie dodaj 52 µL 8 mM NaOH, aby rozpuścić próbkę DNA. Pobierz 2 µL próbki DNA do kwantyfikacji DNA, a pozostałe 50 µL wykorzystaj do analizy real-time PCR po dostosowaniu stężenia.
UWAGA: NaOH pomaga w pełnym rozpuszczeniu próbki DNA. - Kwantyfikuj 2 µL każdej próbki DNA za pomocą spektrofotometru i wykorzystaj stosunek absorbancji A260/280 jako referencję kontroli jakości. Oblicz stężenie DNA za pomocą następującego wzoru:
- Dostosuj stężenie DNA do 50 ng/µL. Dla każdej próbki DNA użyj 50 ng DNA jako matrycy startowej do analizy real-time PCR. Do rozcieńczenia próbki DNA użyj roztworu 8 mM NaOH lub wody wolnej od DNazy i RNazy.
- Zaprojektuj we własnym zakresie parę starterów specyficznych dla sekwencji egzogennego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), korzystając z otwartoźródłowego portalu internetowego do projektowania starterów, w celu detekcji tagu GFP w komórkach przerzutowych, które zainwadowały i skolonizowały odległe miejsca.
UWAGA: W tym badaniu zastosowano: F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'. - Użyj szybkich odczynników do real-time PCR oraz urządzenia do real-time PCR obsługującego szybki protokół real-time PCR. Oprócz standardowych 30 cykli amplifikacji, dodaj na koniec procesu etap krzywej dysocjacji w celu wykrycia ewentualnej niespecyficznej amplifikacji.
UWAGA: Do detekcji molekularnej zastosowano następujące warunki: hot start 95 °C przez 2 min, 40 cykli: 95 °C przez 5 s, 60 °C przez 15 s, a na koniec analiza krzywej topnienia. Amplikon GFP ma wielkość 135 bp. - Jako kontrolę negatywną wykorzystaj DNA z mózgu myszy naiwnej (bez implantu komórek MDA-MB-231). Jako kontrolę pozytywną wykorzystaj DNA wyekstrahowane z komórek MDA-MB-231-GFP/Luc. Dodaj wszystkie odczynniki PCR bez matrycy DNA jako kontrolę bez matrycy (NTC).
UWAGA: Kontrola PCR jest niezbędna dla każdej analizy PCR.
5. Wykrywanie przerzutowych komórek raka piersi w płucach
- W przypadku podgrupy myszy wybranych do zliczania przerzutowych guzków w płucach, znieczul myszy izofluranem (zgodnie z krokiem 2.2) bezpośrednio po obrazowaniu ex vivo, pobierz krew poprzez nakłucie serca, a następnie uśmierć zwierzęta przez zwichnięcie stawów szyjnych.
- Otwórz jamę klatki piersiowej nożyczkami preparacyjnymi i przetnij tkanki za sercem i grasicą, aby odsłonić tchawicę.
- Wprowadź do tchawicy strzykawkę 10 mL z igłą 22 G zawierającą roztwór Bouina. Przesuwaj tłok strzykawki, aż zapadnięte płuca zostaną wypełnione ok. 2 mL roztworu Bouina. Wyjmij strzykawkę z igłą po napompowaniu płuc.
- Umieść całe płuca w probówce 15 mL zawierającej roztwór Bouina, delikatnie odwróć probówkę kilka razy i pozostaw do namoczenia na 24 h w temperaturze pokojowej.
- Po 24 h usuń roztwór Bouina z probówki, wypłucz płuca wodą, a następnie umieść je z powrotem w probówce z 70% etanolem. Zlicz przerzuty (białe plamy lub guzki) na powierzchniach płuc, korzystając z mikroskopu stereoskopowego.
6. Gromadzenie i analiza danych
- Zapisuj dane dotyczące objętości guza, a także dane z obrazowania in vivo i ex vivo, w arkuszu kalkulacyjnym w celu łatwego wprowadzania, gromadzenia i zarządzania danymi.
- Po zakończeniu eksperymentu przenieś wszystkie dane do arkusza kalkulacyjnego oraz oprogramowania statystycznego w celu sporządzenia wykresów i przeprowadzenia analiz statystycznych.
Wyniki
Pomiar objętości guza za pomocą suwmiarki jest uznaną metodą oceny skuteczności leczenia (Rycina 1). Kluczowymi czynnikami wpływającymi na tempo wzrostu guza są liczba wszczepionych komórek, zastosowanie macierzy błony podstawnej, mikrobiom, czystość pomieszczenia oraz miejsce wstrzyknięcia.
W przeciwieństwie do obrazowania GFP, BLI wymagało podania substratu lucyferazy co najmniej 15−20 min przed obrazowaniem BLI. Ponadto szczep myszy, linia komórkowa, zastosowane terapie oraz reporter lucyferazy wpływają na poziomy sygnału bioluminescencyjnego. Aby zatem uzyskać porównywalne sygnały pomiędzy grupami badawczymi, należy przeprowadzić wstępne badanie kinetyczne BLI w celu określenia optymalnego przedziału czasowego obrazowania (Rysunek 2).
Ze względu na korzystniejszy stosunek sygnału do tła26,27, obrazowanie bioluminescencyjne in vivo całego ciała było znacznie bardziej czułe w wykrywaniu sygnałów przerzutów o niskim natężeniu w porównaniu do podejścia z wykorzystaniem GFP (Rysunek 3). Ponadto sygnał bioluminescencyjny charakteryzował się głębszą penetracją niż GFP o kilka milimetrów. Jednakże generowanie sygnału bioluminescencyjnego wymaga ATP, co stanowi czynnik ograniczający przy ocenie próbek tkanek ex vivo. Jeśli zwierzęta są przetwarzane szybko, BLI może być skuteczną metodą uzyskiwania ilościowych wyników dotyczących przerzutów. Jednym ze sposobów na osiągnięcie tego jest przetwarzanie jednego zwierzęcia naraz. Podejście to nie było jednak możliwe do zastosowania w niniejszym badaniu ze względu na wykorzystanie licznej kohorty myszy. Sygnał BLI nie był wykrywalny, gdy narządy były obrazowane około 45 min po wstrzyknięciu lucyferyny. W takiej sytuacji przydatne jest zastosowanie linii komórkowej z podwójnym reporterem. Dzięki stabilności cząsteczki GFP badacze mieliby wystarczająco dużo czasu na obróbkę truchła przed zarejestrowaniem sygnałów GFP z narządów docelowych (Rysunek 4).
Rycina 5 przedstawia rzeczywisty przykład tego, jak pomiary wielkości guza wykonane za pomocą suwmiarki mogą zniekształcić interpretację danych, ponieważ ksenoprzeszczep utracił większość żywotnych komórek nowotworowych, ale wciąż zachował dużą masę i kształt. Badanie histopatologiczne tych ksenoprzeszczepów wykazało martwicę wewnątrz masy (Rycina 5B).
Dla badaczy kwestionujących wyniki obrazowania dotyczące przerzutów do mózgu w ortotopowym modelu raka piersi, detekcja molekularna za pomocą real-time PCR może dostarczyć przekonujących dowodów (Rysunek 6). W tym przypadku egzogenna sekwencja DNA GFP była najlepszym sposobem na rozwiązanie tego problemu, ponieważ transfektowana sekwencja DNA GFP nie występuje naturalnie u ludzi ani gryzoni.
Rycina 1: Pomiar objętości guza. Pomiar objętości/obciążenia guza za pomocą suwmiarki rozpoczęto w 10. dniu po implantacji ksenoprzeszczepu, a następnie pomiary przeprowadzano 2 razy w tygodniu aż do zakończenia eksperymentu. Słupki błędów obliczono na podstawie wartości SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Wyznaczenie optymalnego okna akwizycji obrazu. Po lewej: Do wyznaczenia optymalnego zakresu kinetyki lucyferyny wybrano jedną mysz z dużym ksenoprzeszczepem i jedną mysz z małym ksenoprzeszczepem. Po prawej: Krzywa kinetyki lucyferyny uzyskana poprzez akwizycję obrazów co 2 min przez 40 min. Plateau zaobserwowano między 15−22 min, co posłużyło jako optymalny czas akwizycji obrazu dla wszystkich kolejnych obrazowań. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Obrazowanie BLI całego ciała. L: Obrazowanie BLI całego ciała. M: Widok brzuszny z dolną częścią ciała przykrytą rękawem czarnej rękawiczki. R: Widok grzbietowy z dolną częścią ciała przykrytą rękawem czarnej rękawiczki. W widoku brzusznym za pomocą obrazowania BLI wykryto przerzut do węzła chłonnego pachowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Detekcja sygnału BLI/GFP ex vivo. Sygnały GFP wykryto w mózgu i płucach tej samej myszy 20 min po jej uśmierceniu. Sygnału BLI nie wykryto 45 min po wstrzyknięciu lucyferyny. W mózgu i płucach myszy naiwnej nie wykryto sygnału GFP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Przewagi technik obrazowania optycznego nad pomiarami suwmiarką. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący detekcję sygnału GFP in vivo w guzie pierwotnym. Tylko niewielka część ksenoprzeszczepu wykazywała sygnał GFP, co sugeruje, że znaczna część masy stanowiło zrąb. Nie można tego ustalić za pomocą tradycyjnych pomiarów suwmiarką, co może prowadzić do błędnych wniosków. Przykład ten podkreśla znaczenie obrazowania optycznego w badaniach na modelach zwierzęcych. (B) Przekrój histopatologiczny tej samej myszy pokazujący, że obszar martwiczy (tj. obszar wewnętrzny) również przyczynił się do obliczenia wielkości guza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Analiza krzywej topnienia. Wykres krzywej topnienia wykazujący swoistość amplikonów GFP. Analizie poddano DNA z mózgu pobrane od myszy z wszczepionymi komórkami MDA-MB-231-Luc/GFP oraz DNA wyizolowane z hodowli komórek MDA-MB-231-Luc/GFP (kontrola dodatnia). Przeprowadzono badanie PCR w czasie rzeczywistym w celu oceny zawartości GFP w tkance mózgowej. (A,B) Odpowiednio krzywe topnienia dla kontroli dodatniej oraz DNA wyekstrahowanego z mózgu myszy. (C) Nałożone na siebie krzywe z paneli A i B, wskazujące, że sygnały szczytowe z DNA mózgu myszy są swoiste dla egzogennej sekwencji GFP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Do badań nad TNBC u zwierząt opracowano dwa modele mysie: model z wykorzystaniem ludzkich komórek gruczolakoraka piersi MDA-MB-231 u myszy z niedoborem odporności (tj. myszy athymic nude, myszy NSG) oraz model 4T1 u immunokompetentnych myszy BALB/c. Oba modele mają swoje zalety. Wybór modelu zwierzęcego do badania zależy od celów badawczych. Na przykład model MDA-MB-231 to ludzka linia komórkowa TNBC hodowana u myszy z niedoborem odporności, która naśladuje stan pacjentów z rakiem piersi z immunosupresją. Z drugiej strony, inwazyjny fenotyp ortotopowych mysich komórek potrójnie ujemnego raka piersi 4T1 u myszy BALB/c ściśle naśladuje proces przerzutowania, jaki występuje u pacjentek z rakiem piersi w IV stadium. W przeciwieństwie do metody dożylnego wstrzykiwania komórek, ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231 były analogicznie wstrzykiwane do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego11,12 w ortotopowym modelu raka piersi11,13. Dłuższy wzrost guza oraz nabyta zdolność do przerzutowania są bardziej istotne fizjologicznie, zatem nie jest to sztuczny model raka przerzutowego4,14. Taki model spontanicznych przerzutów ściśle naśladuje rozwój ludzkiego raka piersi, z wyjątkiem etapu inicjacji. Jest to kluczowy model dla przesiewowej oceny leków in vivo oraz oceny skuteczności terapeutycznej w przerzutowym raku piersi.
Miejsce implantacji guza u myszy odgrywa kluczową rolę w zapewnieniu mikrośrodowiska, które podtrzymuje wzrost nowotworu i selekcję fenotypu przerzutowego podobnego do tego, który występuje u ludzi. Bliski węzeł chłonny oraz obecność tkanki tłuszczowej są kluczowymi czynnikami wpływającymi na progresję raka piersi15,16. U pacjenta węzeł chłonny i tkanka tłuszczowa są kluczowymi czynnikami oddziałującymi na złośliwość i zapadalność na raka piersi17,18,19. Zatem wybór odpowiedniej lokalizacji anatomicznej miejsca iniekcji może mieć ogromny wpływ na relewantność modelu nowotworowego w porównaniu z chorobą u ludzi. W niniejszym badaniu jako miejsce implantacji wykorzystano czwarty gruczoł mlekowy, głównie ze względu na wspomniane wymagania oraz fakt, że jest on anatomicznie bardziej dostępny i łatwiejszy w manipulacji.
Dostępnych jest wiele różnych metod obliczania objętości guza, a badacz może wybrać dowolną z nich, zależnie od potrzeb. Algorytm wybrany do niniejszego badania opiera się na wynikach Faustino-Rocha i wsp., którzy porównali różne wzory obliczania objętości guza i stwierdzili, że poniższy wzór jest najdokładniejszy20.
Macierz błony podstawnej jest ważną macierzą zewnątrzkomórkową stosowaną w różnych testach in vitro21 oraz in vivo22,23. Istnieją sprzeczne doniesienia22,24,25 dotyczące wpływu macierzy błony podstawnej na złośliwość ksenoprzeszczepu. Wydaje się, że wpływa ona jedynie na początkowe przyjęcie się ksenoprzeszczepu i nie wywiera dalszego wpływu na jego wzrost25. W opisanym procesie implantacji ksenoprzeszczepu macierz błony podstawnej zmieszano z komórkami nowotworowymi w celu zwiększenia lepkości roztworu mieszaniny komórek i żelu przed implantacją. Obecność macierzy błony podstawnej ogranicza wyciek roztworu z miejsca wstrzyknięcia i utrzymuje go w miejscu implantacji, co zwiększa jednorodność objętości wszczepionego ksenoprzeszczepu.
Linia komórkowa MDA-MB-231 to złośliwa, unieśmiertelniona ludzka linia komórkowa gruczolakoraka piersi, która ze względu na status potrójnie ujemny jest popularnym narzędziem w badaniach nad rakiem piersi. Wykorzystanie linii komórkowej z podwójnymi reporterami (lucyferazą i GFP) zapewnia większą elastyczność w obrazowaniu in vivo i ex vivo. Powszechnie wiadomo, że sygnał bioluminescencyjny charakteryzuje się większą czułością, głębokością detekcji oraz lepszym kontrastem (stosunkiem sygnału do szumu) niż sygnały GFP. Z tego powodu jest to szeroko stosowana metoda obrazowania całego ciała. Niestety detekcja bioluminescencji jest ograniczona wąskim oknem czasowym (~15−20 min po iniekcji lucyferyny), w którym detekcja sygnału jest liniowa. Sygnał BLI szybko zanika po eutanazji zwierząt. Staje się to problemem w projekcie doświadczalnym, gdy konieczna jest eutanazja wielu myszy oraz pobranie wielu tkanek lub narządów. W niniejszych badaniach krew pobierano bezpośrednio z serca, a mózg, guz pierwotny, płuco i zajęty węzeł chłonny badano u 40 myszy. W czasie, gdy narządy zostały pobrane i przygotowane do obrazowania ex vivo, sygnał bioluminescencji był niewykrywalny. W takich sytuacjach bardziej odpowiednia jest detekcja GFP. Emisja sygnału GFP przypada na zakres widzialny, a przy tych długościach fal absorpcja sygnału przez krew (tj. hemoglobinę) jest znacznie wyższa. Ponadto autofluorescencja w zakresie widzialnym wywołana przez NADH, lipopigmenty i flawiny generuje znaczne tło, co utrudnia odróżnienie słabego sygnału GFP od tła autofluorescencyjnego. Zastosowanie wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamiast tradycyjnego obrazowania z użyciem par filtrów oraz wykorzystanie algorytmów rozdzielania spektralnego (spectral unmixing) pomaga zidentyfikować rzeczywisty sygnał GFP w badanym narządzie. Zatem dzięki połączeniu zalet obrazowania bioluminescencyjnego w detekcji in vivo całego ciała oraz wielospektralnego obrazowania GFP w ocenie narządów/tkanek ex vivo, można maksymalnie zwiększyć ilość mierzalnych danych w dużej kohorcie myszy.
Niezależnie od wybranej metody badania na zwierzętach, wysoce zaleca się pobranie całej krwi przed wyjęciem organów lub tkanek, szczególnie w badaniach ukierunkowanych na obciążenie przerzutowe. Niniejszy protokół wykrywa sygnały GFP z próbek krwi pełnej pobranych od myszy (dane nie przedstawiono) w ortotopowym modelu raka piersi za pomocą testów real-time PCR. Zminimalizowanie objętości krwi w organach i tkankach pozwoli zredukować liczbę wyników fałszywie dodatnich w organach docelowych.
Podsumowując, ortotopowy model raka piersi z wykorzystaniem komórek MDA-MB-231-Luc/GFP jest wysoce relewantnym modelem zwierzęcym, który ściśle naśladuje stan pacjentów z ludzkim TNBC. Model ten jest niezbędny do badania, monitorowania i oceny skuteczności terapeutycznej w mikrośrodowisku nowotworowym zbliżonym do ludzkiego. Zastosowanie linii komórkowych z podwójnym reporterem dodatkowo zwiększa praktyczność tego ortotopowego modelu raka piersi.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie ze strony Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Cancer Institute, Bethesda MD, Cancer and Inflammation Program, oraz Frederick National Laboratory - Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, USA.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Barwienie guzków z przerzutami do płuc |
| D-Lucyferyna, Sól potasowa | GoldBio | LUCK-1G | Podłoże lucyferazy |
| DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | Zestaw do ekstrakcji DNA Excel |
| Microsoft Arkusz kalkulacyjny | |||
| Homogenizator | Virtis | Cyclone Virtishear | Do homogenizacji tkanek |
| Skaner IVIS SPECTRUM | obrazowania fluorescencji i BLI | Perkin Elmer | |
| Skaner fluorescencyjny Maestro GNIR-FLEX | System obrazowania fluorescencyjnego | Perkin Elmer | |
| MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Przechowywać w temperaturze -20C i przechowywać w starym (4 C) podczas użytkowania. |
| MDA-MB-231 / Lucyferazy-2A-GFP Stabilna linia komórkowa | GenTarget | SC044 | Dual Reporter ludzka linia komórkowa raka piersi |
| Mikroskop ThermoFisher | EVOS | histologia przechwytywanie obrazu | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | ThermoFisher | 10010049 | bufor do płukania |
| Primer3 | MIT | Primer Design | |
| Prism | GraphPad | Oprogramowanie do analizy statystycznej | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antybiotyki |
| Pożywka RPMI 1640 | Pożywka ThermoFisher | 61870127 | Pożywki |
| hodowlane SeniFAST SYBR Zestaw Lo-ROX | Bioline | BIO-94020 | Szybki odczynnik do PCR w czasie rzeczywistym |
| StepOne Plus System PCR w czasie rzeczywistym | Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym | ThermoFisher |
Bibliografia
- Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy. Cancer. 121, 8-16 (2015).
- Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (56), e3175(2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), e54903(2016).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), e2775(2011).
- Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178(2012).
- Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. Journal of Visualized Experiments. (141), e57849(2018).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).
- Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).
- Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad. Journal of Visualized Experiments. (143), e58604(2019).
- Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).
- Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).
- Fletcher, S. J., et al. Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26(2017).
- Giuliano, A. E., et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).
- Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability? Ecancermedicalscience. 9, 552(2015).
- Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. Influence of tumor location on breast cancer prognosis. International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).
- Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study. PLoS One. 9, e94815(2014).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42, 217-224 (2013).
- Mullen, P. The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).
- Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice. Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).
- Mullen, P., Langdon, S. P. The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).
- Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Medical Imaging. 16, 5(2016).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).
- Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
Przedruki i uprawnienia
