Artykuł metodologiczny

Zastosowania hybrydyzacji in situ wirusowego RNA/DNA nowej generacji w badaniach nad ludzkim wirusem niedoboru odporności/małpim wirusem niedoboru odporności

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60318

⸱

17 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1AIDS and Cancer Virus Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research Inc., 2Vaccine and Gene Therapy Institute and Oregon National Primate Research Center (ONPRC), Oregon Health and Science University (OHSU)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy test hybrydyzacji in situ nowej generacji do identyfikacji specyficznych sekwencji wirusowego RNA lub DNA w tkankach zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Takie podejście pozwala na wizualizację niskich kopii RNA i DNA w czasie krótszym niż 24 godziny z bardzo wysoką czułością i swoistością.

Streszczenie

Hybrydyzacja in situ to potężna technika identyfikacji specyficznych sekwencji RNA lub DNA w pojedynczych komórkach w sekcjach tkanki, dostarczająca ważnych informacji na temat procesów fizjologicznych i patogenezy chorób. Hybrydyzacja in situ (ISH) jest stosowana od wielu lat do oceny lokalizacji komórek zakażonych wirusami, ale ostatnio opracowano podejście ISH nowej generacji z unikalną strategią projektowania sondy, która umożliwia jednoczesne wzmacnianie sygnału i tłumienie tła w celu uzyskania wizualizacji pojedynczej cząsteczki przy zachowaniu morfologii tkanki. Ten ISH nowej generacji opiera się na podejściu takim jak rozgałęziony PCR, ale wykonywany in situ i jest łatwiejszy, bardziej czuły i powtarzalny niż klasyczne metody ISH lub podejścia PCR in situ w rutynowym wykrywaniu RNA lub DNA w tkankach zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE). Od kilku lat nasze laboratorium stosuje tę platformę ISH do wykrywania komórek wirusowych RNA (vRNA) ludzkiego niedoboru odporności (HIV) i małpiego niedoboru odporności (SIV) i/lub wirusowego DNA (vDNA) w wielu tkankach FFPE. W tym szczegółowym manuskrypcie technicznym chcielibyśmy podzielić się naszą wiedzą i radami ze wszystkimi osobami zainteresowanymi wykorzystaniem ISH nowej generacji w swoich badaniach.

Wprowadzenie

ISH to eksperymentalne podejście używane do celowania i wizualizacji komplementarnych DNA, RNA lub zmodyfikowanych nici kwasu nukleinowego (tj. sond) do określonych sekwencji DNA lub RNA w komórce lub sekcji tkanki. ISH pozwala na specyficzną lokalizację i wizualizację określonych sekwencji nukleinowych w tkankach, co jest ważne dla zrozumienia poziomu ekspresji, organizacji, dystrybucji i interakcji między celem a jego środowiskiem komórkowym, co jest cenną informacją niemożliwą do uzyskania przy użyciu innych popularnych technik, takich jak qPCR. Do niedawna ISH był powszechnie wykonywany z znakowanym komplementarnym DNA lub komplementarnym RNA (rybosondą). Sondy te były albo bezpośrednio sprzężone z zasadami znakowanymi radio, fluorescencyjnie lub antygenem (np. 35S, FITC i digoksygeniną), a następnie zlokalizowane i określone ilościowo w tkance przy użyciu odpowiednio autoradiografii, mikroskopii fluorescencyjnej lub metod wykrywania immunohistochemicznego. Chociaż te technologie in situ nadal są wartościowymi podejściami, istnieje wiele możliwości ulepszeń w celu opracowania podejść, które są mniej pracochłonne, prostsze, szybsze, czułe i szczegółowe.

Alternatywne komercyjne podejście do ISH nowej generacji (np. test RNAscope), po raz pierwszy opisane w 2012 roku, do wykrywania informacyjnego RNA gospodarza (mRNA) opiera się na rozgałęzionym PCR. Detekcja mRNA jest wykonywana w komórkach i tkankach FFPE, z czułością zbliżoną do wizualizacji pojedynczej cząsteczki RNA w poszczególnych komórkach1. Specyfika tego podejścia jest osiągana pod unikalnym warunkiem, że dwie sondy docelowe typu double-Z wiążą się stale z odpowiednimi komplementarnymi sekwencjami RNA (lub DNA), aby przedwzmacniacz sygnału sekwencyjnie wiązał się1. Pozwala to na zainicjowanie kaskady wzmocnienia sygnału poprzez kolejne etapy hybrydyzacji podobne do rozgałęzionego DNA (bDNA)1,2. Ponadto podejście to jest niezwykle szybkie i łatwe, a wyniki uzyskuje się w ciągu zaledwie 1 dnia (<8 godzin), co stanowi znaczną zaletę w porównaniu z maksymalnie 4 tygodniami przy użyciu alternatywnych technik, w tym Radio-ISH1,2. Naukowcy nowej generacji otworzyli nowe perspektywy i możliwości dla badań nad HIV/SIV. Główną przeszkodą w wyleczeniu HIV są rezerwuary komórkowe i tkankowe, które powstają we wczesnych stadiach choroby3,4. Ogólnym celem tej techniki jest identyfikacja, lokalizacja i ostateczne zrozumienie głównych przedziałów tkankowych, które działają jak rezerwuar wirusa i są trwałe w zakażonym gospodarzu. To z kolei pomoże w opracowaniu skutecznych strategii leczenia wirusa HIV.

W tym manuskrypcie szczegółowo wyjaśniamy nasz protokół ISH dupleksu nowej generacji RNA/DNA (np. RNAscope/DNAscope) i wyjaśniamy, jak zmodyfikowaliśmy istniejący protokół RNA ISH, aby zoptymalizować ISH nowej generacji do naszych próbek i konkretnych celów. Protokół ten umożliwia wizualizację, lokalizację i kwantyfikację RNA wirusa HIV/SIV i wirusowego DNA w obrębie 5 μm odcinków tkanki. Jednoczesna wizualizacja zarówno vRNA, jak i vDNA odbywa się poprzez połączenie dwóch niestandardowych zestawów sond: jednego czujnika, ukierunkowanego na nić kodującą vDNA (C1 SIVmac239 sonda Gag-Pol-Sense [416141-C1]) i jednego antysensownego, ukierunkowanego na transkrypty vRNA (C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense sonda [416131-C2]) obejmujących różne regiony genomu wirusa (Tabela 1), przy użyciu dwóch różnych kanałów wizualizacji, C1 i C2. W tym protokole kanały C1 i C2 pozwalają nam na wizualizację sygnałów w różnych kolorach (tj. AP na czerwono i HRP na brązowo) i wykrywanie sond za pomocą różnych podejść. Wyłączając przetwarzanie i cięcie utrwalania tkanek, test ten trwa 2 dni. Przedstawiono tutaj protokół hybrydyzacji duplex vRNA i vDNA in situ, który można wykonać na osadach komórkowych lub skrawkach tkanki.

Protokół

1. Przygotowanie sekcji i slajdów

  1. Przyciąć bloki parafiny i za pomocą mikrotomu wyciąć 5 odcinków +/-1 μm. Zamontuj skrawki lub granulki komórek na naładowanych szkiełkach mikroskopowych w łaźni wodnej wolnej od RNaz o temperaturze 40-45 °C. Szkiełka suche na powietrzu przez noc w temperaturze 37 °C lub RT.
    UWAGA: Szkiełka można przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze pokojowej (RT) i 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
  2. Odparafinować szkiełka FFPE.
    1. Piec szkiełka w suchym piekarniku przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.
    2. W dygestorium napełnij dwie szkiełkowe naczynia do barwienia ~200 ml świeżego ksylenu, a dwa dodatkowe naczynia do barwienia ~200 ml świeżego 100% etanolu. Przykryj pojemniki pokrywkami.
    3. Umieść szkiełka w stojaku i zanurz w pierwszym naczyniu zawierającym ksylen. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    4. Umieścić szkiełka w drugim naczyniu zawierającym ksylen i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    5. Natychmiast umieść szkiełka w naczyniu zawierającym 100% etanolu. Inkubować szkiełka przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    6. Natychmiast umieścić szkiełka w drugim naczyniu zawierającym 100% etanolu i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
    7. Wyjmij stojak z etanolu, delikatnie postukaj w bok stojaka, aby usunąć nadmiar etanolu i płucz w wodzie wolnej od RNaz przez 5-15 minut.

2. Przygotowanie piekarnika

  1. Włącz piekarnik do hybrydyzacji i ustaw temperaturę na 40 °C.
  2. Umieść szmatkę lub solidny, chłonny ręcznik papierowy na tacy i całkowicie zwilż wodą podwójnie destylowaną, aby umożliwić kontrolę wilgotności.
  3. Włóż przykrytą blachę do piekarnika i zamknij drzwiczki piekarnika. Przed użyciem ogrzewać tackę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 40 °C. Przechowuj blachę w piekarniku, gdy nie jest używana.

3. Pobieranie epitopów pod wpływem ciepła

  1. Przygotować 0,5x bufor do odzyskiwania docelowego celu hybrydyzacji ISH na bazie cytrynianu (10 nmol/L, pH = 6, patrz tabela materiałów). Doprowadź do wrzenia w zlewce na płycie grzewczej.
  2. Przeprowadzić pobieranie epitopów indukowanych ciepłem, umieszczając szkiełka we wrzącym buforze do odzyskiwania celu na 30 minut.
  3. Wyjąć szkiełka z docelowego bufora do pobierania i natychmiast umyć w wodzie podwójnie destylowanej. Odwodnić w 100% etanolu przez 5 minut przed suszeniem na powietrzu.
  4. Po wyschnięciu szkiełek nałóż hydrofobowy pisak barierowy, aby otoczyć część tkanki na szkiełku. Upewnij się, że bariera hydrofobowa całkowicie wyschnie na powietrzu.

4. Wstępne leczenie proteazy

  1. Umieść wysuszone szkiełka na zamykanym stojaku na szkiełka, a następnie przygotuj odczynniki do wstępnej obróbki proteazy (roztwór do trawienia proteazy, 2,5 μg/ml), rozcieńczając sterylnym, zimnym PBS w stosunku 1:5. Dobrze wymieszaj.
    UWAGA: W dostępnym na rynku zestawie znajdują się trzy różne odczynniki do proteazy o różnych stężeniach. Proteaza III (standardowa), Proteaza IV (silna) i Proteaza Plus (łagodna). Empirycznie przetestuj czas trawienia i rozcieńczenia proteazy przed wdrożeniem do badania, ponieważ optymalne warunki będą się różnić w zależności od typu tkanki, utrwalenia i grubości (patrz Dyskusja).
  2. Dozować rozcieńczony roztwór proteazy na szkiełka, aby całkowicie pokryć skrawki tkanki. Natychmiast inkubować szkiełka przez 20 minut w temperaturze 40 °C w piecu (przygotowanym w kroku 1.4), upewniając się, że szkiełka są zamknięte w wilgotnej tacy do hybrydyzacji. Nie pozwól, aby skrawki tkanki wyschły do końca protokołu.
  3. Natychmiast spłucz 3x, zanurzając blokujący ruszt przesuwny w tacy myjącej wypełnionej wodą podwójnie destylowaną.
  4. Wykonaj endogenny blok peroksydazy, upuszczając roztwór peroksydazy na każdy odcinek tkanki, aby całkowicie go pokryć. Inkubuj szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu opłucz sekcje 3x w wodzie podwójnie destylowanej.

5. Hybrydyzacja sondy i wzmocnienie sygnału

UWAGA: Aby zapobiec parowaniu, upewnij się, że tacka z kontrolowaną wilgotnością jest prawidłowo uszczelniona, aby tkanki nie wyschły podczas etapów inkubacji. Umieść komorę wilgotności z powrotem w piekarniku na etapie prania, aby upewnić się, że pozostaje w temperaturze 40 °C.

  1. Wymieszać sondę C2 i sondę C1 w stosunku 1:50, pipetując 1 objętość sondy C2 na 50 objętości sondy C1 do probówki zgodnie z zaleceniami producenta. Odwróć rurkę kilka razy. Podgrzej mieszaninę sondy docelowej w piekarniku o temperaturze 40 °C przez ~10 minut, aby rozpuścić wszelkie opady przed użyciem.
    UWAGA: Mieszane sondy docelowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Wyjmij szkiełka z wody. Opłucz i dotknij lub przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar wody z odcinków tkanki. Natychmiast dozuj sondę na szkiełka, upewniając się, że każda sekcja tkanki jest całkowicie pokryta bez pęcherzyków powietrza. Mieszaninę sond inkubować w komorze wilgotnościowej przez noc w temperaturze 40 °C.
  3. Następnego dnia wyjmij szkiełka z piekarnika i umieść je w tacce myjącej zawierającej 0,5x bufor do mycia na 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania jeszcze raz.
  4. Wyjmij szkiełka z bufora myjącego. Opłucz i dotknij lub przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar buforu do płukania z odcinków tkanki.
  5. Dozuj komercyjnie gotowy do użycia odczynnik AMP 1 (2 nmol/L) w buforze hybrydyzacyjnym B (20% formamidu, 5x SSC, 0,3% siarczanu litododecylu, 10% siarczanu dekstranu, odczynniki blokujące) na szkiełka, zapewniając całkowite pokrycie przekroju tkanki bez pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 °C w komorze wilgotnościowej. Powtórz kroki 1.6.3-1.6.4, wykonując pranie przez 2 minuty każdy.
  6. Dozować dostępny w handlu AMP 2. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć kroki 5.3-5.4, z których każdy wykonuje płukanie przez 2 minuty.
  7. Dozować dostępny w handlu AMP 3. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć kroki 5.3-5.4, z których każdy wykonuje płukanie przez 2 minuty.
  8. Dozować dostępny w handlu AMP 4. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć kroki 5.3-5.4, z których każdy wykonuje płukanie przez 2 minuty.
  9. Dozować dostępny w handlu AMP 5. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć kroki 5.3-5.4, wykonując mycie przez 2 minuty każdy.
  10. Dozować dostępny w handlu AMP 6. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć krok 5.3-5.4, wykonując mycie przez 2 minuty każdy.
  11. Przed wykryciem przepłukać szkiełka jeden raz w 1x TBS-Tween 20 (0,05% v/v). Wyjmij szkiełka z bufora do płukania, opłucz i dotknij lub przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar buforu do płukania z odcinków tkanki. Natychmiast umieść na tacy myjącej wypełnionej 1x buforem TBS-Tween.

6. Detekcja sygnału docelowego kanału 1 (C1)

UWAGA: To jest wykonywane za pomocą Red Alkaline Phosphatase i Fast Red Chromogen Amplification 6 z zestawów detekcyjnych 2-plex (patrz Tabela Materiałów) zawierających etykiety fosfatazy alkalicznej i detekcji chromogennej. Wykorzystuje szybką czerwień jako podłoże do generowania czerwonego sygnału.

  1. Przygotować roztwór roboczy Fast Red (FR) w stosunku 1:60 roztworu Fast RED-B do Fast RED-A. Dobrze wymieszaj. Aby zredukować osad i uzyskać czystszy sygnał, przefiltruj roztwór chromogenu przez membranę MCE 0,45 μm za pomocą strzykawki.
    UWAGA: Roztwór Fast RED-B należy zużyć w ciągu 5 minut. Nie wystawiać na bezpośrednie działanie promieni słonecznych ani promieniowania UV.
  2. Wyjmij szkiełka z TBS-Tween, opłucz je i dotknij lub przesuń suwakami, aby usunąć nadmiar buforu z odcinków tkanki.
  3. Dozować zmieszany, przefiltrowany roztwór FR na każdy fragment tkanki, upewniając się, że każda sekcja jest całkowicie pokryta. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 6-8 minut. Obserwuj pod mikroskopem.
  4. Wypłucz szkiełka w 0,5x buforze do płukania 2x. Wyjmij szkiełka z bufora do mycia, spłucz i postukaj lub przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar buforu do płukania z sekcji chusteczek.
  5. Dozowanie dostępnego w handlu AMP 7. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć krok 5.3-5.4, wykonując płukanie przez 2 minuty każdy.
  6. Dozować dostępny w handlu AMP 8. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć krok 5.3-5.4, wykonując mycie przez 2 minuty każdy.
  7. Dozować dostępny w handlu AMP 9. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć kroki 5.3-5.4, wykonując mycie przez 2 minuty każdy.
  8. Dozować dostępny w handlu AMP 10. Upewnij się, że część tkanki jest całkowicie zakryta bez pęcherzyków powietrza. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 40 °C. Powtórzyć kroki 5.3-5.4, wykonując mycie przez 2 minuty każdy.

7. Detekcja sygnału celu kanału 2 (C2)

UWAGA: To jest wykonywane przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do chromogenów Brown HRP i DAB (zobacz Tabelę Materiałów). Amplifikacja 10 z detekcji 2-plex zawiera etykiety peroksydazy chrzanowej, a detekcja chromogenna jest wykonywana za pomocą DAB w celu wygenerowania brązowego sygnału.

  1. Aby zapewnić optymalne wykrywanie sygnału DAB, należy używać dostępnych w handlu zestawów i postępować zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Obserwuj pod mikroskopem.
    UWAGA: DAB jest toksyczny. Postępuj zgodnie z odpowiednimi środkami ostrożności i wytycznymi bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną i jej utylizacji.

8. Przeciwbarwienie i montaż

  1. Przeciwbarwić szkiełka hematoksyliną.
    1. Przeciwbarwij szkiełka przez 30 s 50% świeżo przefiltrowaną hematoksyliną, mieszając szkiełka. Slajdy będą wyświetlane na fioletowo. Natychmiast spłucz pod bieżącą wodą, mieszając szkiełka w górę iw dół, aż woda będzie czysta. Skrawki tkanki pozostaną fioletowe.
    2. Aby uzyskać lepszy kontrast, należy umieścić szkiełka barwione z przeciwwagą w wodzie destylowanej nasączonej węglanem litu na 1 min. Dokładnie spłukać w bieżącej wodzie co najmniej 3 razy podczas mieszania szkiełek. Do końcowego płukania użyj wody podwójnie destylowanej.
    3. Ponieważ FR jest wrażliwy na rozpuszczalniki organiczne, szkiełka zabarwione FR będą musiały zostać pokryte medium montażowym na bazie wody i wysuszone przez noc w temperaturze pokojowej.
  2. Zamontuj zjeżdżalnie.
    1. Upewnij się, że skrawki tkanek pokryte podłożem montażowym na bazie wody są suche.
    2. Zanurz szkiełka w ksylenie przed wsunięciem pokrywy za pomocą odczynnika montażowego. Upewnij się, że nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a częścią chusteczki i pozostawić do wyschnięcia na 16 godzin w temperaturze pokojowej.

9. Protokół ilościowej analizy obrazu dla RNAscope przy użyciu CellProfiler5

  1. Krótko mówiąc, upewnij się, że oprogramowanie rozdzieli barwniki hematoksyliny i FR na osobne obrazy. Zidentyfikuj i zmierz obiekty zainteresowania: jądra, wiriony, komórki dodatnie i zagregowane barwienie FR dodatnie. Przechowuj pomiary w pliku CSV i zapisuj analizowany obraz.
  2. Wybierz opcję "Usuń mieszanie kolorów", która oddziela plamy, dzieląc oryginalny obszar zainteresowania (ROI) na oddzielne obrazy hematoksyliny i FR.
  3. Jeśli hemozyderyna, tatuaż lub podobne cechy zakłócają analizę, dodaj drugi krok "Unmix" z hematoksyliną, FR i DAB. Użyj drugiego obrazu FR, aby znaleźć najbardziej intensywne piksele FR. Ten drugi obraz zostanie użyty jako maska dla prawdziwego barwienia FR.
  4. Opcjonalnie wygładź poplamione obrazy przed ich progowaniem. Jest to decyzja empiryczna i nie zawsze jest potrzebna. Proguj poszczególne poplamione obrazy za pomocą "IdentifyPrimaryObjects", aby wybrać piksele dodatnie.
  5. Zidentyfikuj trzy różne typy obiektów (wirion, agregaty wirionowe, komórka produkcyjna).
    1. Upewnij się, że jądra są obiektami o średnicy 4-100 pikseli (px) barwionymi hematoksyliną. Usuń grudki i wypełnij po progowaniu. Obiekty "IntenseFastRed" mają średnicę 4-100 pikseli i obejmują wiriony, komórki dodatnie i zagregowane barwienia dodatnie, takie jak widoczne na pęcherzykach dendrytycznych (FDC) w pęcherzykach komórek B (BCF). Ten obraz służy do odfiltrowywania wyników fałszywie dodatnich (np. hemozyderyny).
    2. Upewnij się, że małe pozytywy FR to obiekty o średnicy 2-12 pikseli. Pomiar ten obejmuje wiriony i komórki vDNA+. Odrzuć wszystkie przedmioty spoza tego zakresu. Usuń grudki i wypełnij po progowaniu.
    3. Upewnij się, że FR duże pozytywy: obiekty o średnicy 9-100 px. Pomiar ten obejmuje komórki dodatnie vRNA+ i zagregowane barwienie dodatnie. Usunąć bryłę po progowaniu. Rozmiary małych i dużych obiektów FR dodatnich mogą się na siebie nakładać. Zostaną one rozdzielone w późniejszym kroku.
      UWAGA: Oprogramowanie (np. Cellprofiler) używa pikseli do określania rozmiarów obiektów, a te użyte tutaj pochodzą ze slajdów zeskanowanych z prędkością 0,2510 μm/piksel (40x).
  6. Definiowanie i wyodrębnianie wyników.
    1. Po zidentyfikowaniu dowolnych obiektów zdefiniuj i wyodrębnij wyniki dla liczby wirionów, produktywnych zainfekowanych komórek i jąder.
    2. Zidentyfikuj wiriony, maskując FastRedSmallPositives za pomocą obiektu IntenseFastRed ustawionego w celu usunięcia wyników fałszywie dodatnich (np. hemozyderyny).
    3. Następnie zidentyfikuj komórki dodatnie i zagreguj barwienie FR dodatnie. Usuń fałszywe alarmy i wiriony z FastRedLargePositives, maskując je za pomocą IntenseFastRed i zestawu obiektów virion.
    4. Wyodrębnij komórki dodatnie z udoskonalonych FastRedLargePositives, ponownie maskując je jądrami. Podziel obiekty, które już się nie stykają, i przefiltruj wyniki według obszaru obiektu, usuwając małe obiekty (≤6 pikseli). Usuwa to plamki powstałe w wyniku maskowania nakładania się jąder. Rezultatem są dodatnie komórki.
    5. Na koniec zdefiniuj zagregowane dodatnie FR. W tym kroku użyto metody IdentifyTertiaryObjects, znajdując obiekty zawarte w większym, nadrzędnym obiekcie. W tym przypadku udoskonalony zestaw obiektów FastRedLargePositives jest elementem nadrzędnym, a komórki dodatnie są odejmowane.
  7. Policz liczbę wirionów i komórek dodatnich.
  8. Zmierz zagregowany obszar dodatni i przelicz go z pikseli na mm2. Opcjonalnie należy zapisać obszar zajmowany przez wiriony i komórki dodatnie w mm2, jeśli analiza wymaga użycia standardowych rozmiarów komórek i wirionów zamiast bezpośredniego zliczania.
  9. Nałóż obiekty pozytywowe na oryginalny obraz i zapisz wynik.
    UWAGA: Dane ISH są podawane przez liczbę wirionów na 106 jąder (komórek) i liczbę produktywnie zakażonych komórek vRNA+ na 106 jąder (komórek) w celu lepszego zrozumienia i ułatwienia porównania z danymi qPCR, ale wyniki mogą być również podane według obszaru tkanki w mm2.

Wyniki

W poprzednim manuskrypcie2,6,7,8,9,10,11, informowaliśmy, że platformy ISH nowej generacji wykrywające vRNA lub vDNA mogą być łączone za pomocą sond wykrywających (vDNA) ukierunkowanych na 5' gag-pol genomu SIV / HIV i sondy antysensowne (vRNA) celujące w geny w 3' połowie genomu (vif, vpx, vpr, tat, env i nef), a także element TAR w genomie 5' (Tabela 1). Podejście to odróżnia komórki aktywne transkrypcyjnie (vRNA+, vDNA+) od transkrypcyjnie nieaktywnych (przypuszczalnie utajonych) komórek zakażonych lub komórek zawierających niekompetentne transkrypcyjnie prowirusy (vRNA-, vDNA+) w tym samym przekroju tkanki2 (Rysunek 1).

figure-results-1
Rycina 1: Wykrywanie wirusowego RNA i vDNA w tym samym wycinku tkanki. Połączenie testu hybrydyzacji RNA (czerwonego) i hybrydyzacji DNA (brązowego) w ostro zakażonym węzłem chłonnym RM zakażonym SIV, wykazujące zdolność do wykrywania vRNA i vDNA w tym samym odcinku tkanki i zapewniające skuteczne podejście do identyfikacji cichych transkrypcyjnie komórek vDNA + vRNA- in situ. Ten rysunek został zmodyfikowany z Deleage C. et al.2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział
Zestawy sond Single Plex RNA/DNAscope
nazwaKatalog ACD #Liczba ZZopis
SIVmac239 (anty-sensowny)312811Rozdział 83Sonda antysensowna celująca w zakresie 1251-9420bp od D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env i nef)
SIVmac239 (Sens)314071Rozdział 83Sonda Sense celująca w odwrotną nić w zakresie 1251-9420bp od D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env i nef)
V-HIV1-Klad A (Antysens)416101Rozdział 80Sonda antysensowna celująca w zakresie 879-7629bp konsensusu HIV-1 Clade A (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env i nef)
V-HIV1-Klad A (Sense)426341Rozdział 80Sonda Sense celująca w odwrotną nić w zakresie 879-7629bp konsensusu HIV-1 Clade A (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env i nef)
V-HIV1-Klad B (Antysensowny)41611178 Rozdział 78Sonda antysensowna celująca w zakresie 854-8291bp od AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env i nef)
V-HIV1-Klad B (Sense)42553178 Rozdział 78Sonda Sense celująca w odwrotną nić w zakresie 854-8291bp od AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env i nef)
V-HIV1-Clade D (Antysensowny)41612176 Rozdział 76Sonda antysensowna celująca w zakresie 894-7697bp od HIV-1 Clade D Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef)
V-HIV1-Klad D (Sens)42635176 Rozdział 76Sonda Sense celująca w odwrotną nić w obrębie 894-7697bp HIV-1 Clade D Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef)
Zestawy sond Multi-Plex RNA/DNAscope
nazwaKatalog ACD #Liczba ZZopis
V-SIVmac239-knebel-pol-Sense-C1416141-C1Rozdział 40Sonda Sense celująca w odwrotną nić w zakresie 1251-4093bp od D01065.1 (gag i pol)
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 (antysensowny)Numer katalogowy: 416131-C2Rozdział 47Celowanie sondy antysensownej w zakresie 5381-10257bp od D01065.1 (vif, vpx, vpr, tat, env, nef i element TAR)
V-HIV1-Clade_B-knebel-pol-sense-C1Numer katalogowy: 444051-C1Rozdział 40Sonda Sense celująca w odwrotną nić w zakresie 854-3940bp od AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag i pol)
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (antysensowne)444061-C2Rozdział 40Sonda antysensowna celująca w zakresie 5042-9673bp od AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (vif, vpr, tat, env, nef i element TAR)
V-HIV1-Clade_C-knebel-pol-sense-C1Numer katalogowy: 444021-C1Rozdział 48Sonda Sense celująca w odwrotną nić w obrębie 888-5032bp sekwencji koncensus kladu C HIV-1 (gag i pol)
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 (antysensowny)444041-C2Rozdział 49Sonda antysensowna celująca w zakresie 5078-9698bp sekwencji koncensus kladu C HIV-1 (vif, vpr, tat, env, nef i element TAR)
V-HIV1-Clade_AE-knebel-pol-sense-C1444011-C155Sonda Sense celująca w odwrotną nić w zakresie 890-4812bp od AF259954.1, HIV-1 Clade AE (gag i pol)
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (antysensowne)444031-C257Celowanie sondy antysensownej w zakresie 5052-9694bp od AF259954.1, HIV-1 Clade AE (vif, vpr, tat, env, nef i element TAR)

Tabela 1: Lista sond do badania vRNA i vDNA HIV-1 i SIV.

Dyskusja

Hybrydyzacja in situ to skrupulatny test, który wymaga rygoru i podstawowej wiedzy z zakresu chemii kwasów nukleinowych, biologii komórki i histologii, aby móc dostosować każdy krytyczny krok do lokalizacji celu w dobrze zachowanym środowisku. W tej dyskusji chcielibyśmy zwrócić uwagę na krytyczne kroki, w których rozwiązywanie problemów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych i możliwych do zinterpretowania wyników.

Utrwalanie i przetwarzanie tkanek ma kluczowe znaczenie i należy je rozwiązać z wyprzedzeniem, aby upewnić się, że test może przynieść najlepsze wyniki. Neutralny buforowany utrwalacz PFA (4% świeżo przygotowany) jest optymalny do testu dupleksowego. Jednak test można również przeprowadzić na zamrożonych tkankach (OCT) z odpowiednimi warunkami utrwalania po kriosekcji.

Wstępna obróbka skrawków tkanek jest kluczowym krokiem. W tym teście występują dwa etapy obróbki wstępnej: pierwszy to pobieranie epitopów indukowane ciepłem (HIER). Ten krok jest ważny dla odwrócenia wiązań mostków metylenowych i odbudowy struktur białkowych, które są potrzebne w utrwalonych tkankach. Skuteczność tego zabiegu zależy od czasu, temperatury, rodzaju bufora do pobierania i pH. Drugim leczeniem wstępnym jest pobranie epitopu indukowane proteazą (PIER). Ten krok rozszczepia peptydy, odsłaniając antygen lub nukleotydy i wykorzystuje enzymy, w tym proteinazę K, trypsynę i pepsynę. Jest to niezwykle wrażliwy krok, który może potencjalnie uszkodzić zarówno morfologię tkanki, jak i cel zainteresowania. Stężenie enzymu, a także czas i temperatura inkubacji mają kluczowe znaczenie w tym procesie. Nadmierne trawienie prowadzi do słabego rozgraniczenia jąder i trudności w etapach oznaczania ilościowego. Bardzo ważne jest znalezienie równowagi między optymalnym dostępem do celu RNA/DNA a warunkami wstępnego leczenia, które nie uszkadzają tkanki lub celu będącego przedmiotem zainteresowania. Każdy typ tkanki ma inny poziom wrażliwości na każdą z tych wstępnych obróbk, a każdy parametr (stężenie enzymu, czas, temperatura) powinien być przetestowany empirycznie.

Rygorystyczność bufora myjącego opiera się na trzech głównych parametrach: temperaturze, stężeniu soli i detergentu oraz czasie. Bufor do płukania jest buforem cytrynianu sodu (SSC), a stężenie soli w buforze kontroluje rygorystyczność podczas etapów płukania. W swoim protokole ACD zaleca stosowanie buforu do płukania o końcowym stężeniu 0,1x SSC, 0,03% dodecylowosiarczanu litu. Podczas pracy nad optymalizacją DNAscope i multipleksu ustaliliśmy, że użycie buforu płuczącego o końcowym stężeniu 0,05x SSC dało nam lepsze wyniki wizualizacji sygnału DNA i znacznie pomogło zmniejszyć niespecyficzną hybrydyzację poza celem wynikającą z nocnej inkubacji sondy sensorowej.

Wybór podejścia do wykrywania, chromogen (czerwony lub brązowy) kontra fluorescencja, musi być przemyślany w oparciu o typ tkanki i cel przed rozpoczęciem testu. Podejście chromogeniczne koloru czerwonego da ładny kontrast, ponieważ czerwień nie występuje naturalnie w tkankach. Brązowy chromogen da podobne wyniki do czerwonego chromogenu. Należy jednak pamiętać, że niektóre produkty degradacji krwi obecne w tkance mają podobny kolor, a tusz do tatuażu będzie trudny do oddzielenia od brązowego sygnału podczas oznaczania ilościowego. Podejście oparte na detekcji fluorescencji pozwoli na wyraźne rozróżnienie różnych markerów komórkowych, a multipleksowanie zapewni doskonały test fenotypu komórek zawierających vRNA i/lub vDNA.

Konieczne są wielokrotne kontrole, aby zapewnić swoistość sond i jakość testu. Każda nowo zaprojektowana sonda musi być testowana na znanych tkankach lub osadkach komórkowych pochodzących z kontroli dodatniej i ujemnej. Często generujemy plazmidy zawierające naszą docelową sekwencję i wykonujemy transfekcję do linii komórkowych w celu wygenerowania kontroli pozytywnych. Do każdej serii dodajemy znaną tkankę ujemną (ujemną pod kątem HIV lub SIV), kontrolę bez sondy zawierającą tylko rozcieńczalnik sondy oraz kontrolę traktowaną RNazą, aby zapewnić jakość i swoistość testu.

Kwantyfikacja jest niezwykle ważnym krokiem i powinna być wykonana przy użyciu odpowiednich narzędzi i algorytmu w oparciu o zadane pytanie. W tym manuskrypcie przedstawiliśmy oprogramowanie do analizy obrazu (np. Cellprofiler), które wybraliśmy po ocenie wielu opcji. Oszacowaliśmy, że to oprogramowanie jest najlepszym oprogramowaniem dla naszych potrzeb, ale istnieje wiele programów do analizy obrazu, z których można skorzystać.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt został w całości sfinansowany z funduszy federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, na podstawie umowy nr. HHSN261200800001E oraz przyznanie grantu przez Oregon National Primate Research Center NIH P51OD011092 (J.D.E). Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, a wzmianki o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznaczają poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych. Duplex został opracowany z pomocą Advanced Cell Diagnostics.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System hybrydyzacji ACD HybEZII (110 V) z systemem prowadnic wsadowych ACD EZ,321710Piec do hybrydyzacji
CAT HematoxylinBiocare medycznabarwnik CATHE-GAL
Clear-MountMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES17985-15odczynnik montażowy do czerwonego chromogenu
Zestaw peroksydazy Immpact DABVectorSK-4105Służy do odsłaniania HRP - DAB (brązowy) w celu zastąpienia DAB znajdującego się w zestawie ACD
węglan lituFisher chemicalL119-500roztwór do niebieszczenia
paraformaldehydMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES15714-Sdo utrwalania tkanek (4%)
PBSlife technology14190-136
Podłoże montażowePermount ThermoFisher ScientificSP15-100regaent montażowy do chromogenu brązowego
Prolong GoldThermoFisher ScientificP36930regaent montażowy do
rybonukleaz12091039ThermoFisher Scientificdo leczenia RNAzy w protokole DNAscope
rybonukleazy T1RocheR1003do leczenia RNAzy w protokole DNAscope
RNAscope 2.5, odczynnik detekcyjny 2-plexACD322430Brązowy i czerwony zestaw do wykrywania chromogenu
Odczynniki do wyszukiwania celu RNAscopeACD322000bufor do wyszukiwania
SuperFrost Plus Szkiełka szklane ThermoFisherScientific12-550-17
TBSBOSTON BIOPRODUCTSBM-301-4Ldo mycia
TSA Plus Zestaw palety fluorescencyjnej TSA Plus (Cy3, Cy5, TMR, Fluoresceina)Perkin elmer NEL760001KTHRP Detekcja fluorescencji
Tween 20SIGMAP1379-1Ldo mycia
XYLENE 20LTThermoFisher ScientificAC422680200
fluorescencyjnych

Bibliografia

  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnosis. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Deleage, C., et al. Defining HIV and SIV Reservoirs in Lymphoid Tissues. Pathogens and Immunity. 1 (1), 68-106 (2016).
  3. Sengupta, S., Siliciano, R. F. Targeting the Latent Reservoir for HIV-1. Immunity. 48 (5), 872-895 (2018).
  4. Churchill, M. J., Deeks, S. G., Margolis, D. M., Siliciano, R. F., Swanstrom, R. HIV reservoirs: what, where and how to target them. Nature Reviews Microbiology. 14 (1), 55-60 (2016).
  5. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), e2005970(2018).
  6. Deleage, C., Chan, C. N., Busman-Sahay, K., Estes, J. D. Next-generation in situ hybridization approaches to define and quantify HIV and SIV reservoirs in tissue microenvironments. Retrovirology. 15 (1), 4(2018).
  7. Deleage, C., Turkbey, B., Estes, J. D. Imaging lymphoid tissues in nonhuman primates to understand SIV pathogenesis and persistence. Current Opinion in Virology. 19, 77-84 (2016).
  8. Estes, J. D., et al. Defining total-body AIDS-virus burden with implications for curative strategies. Nature Medicine. 23 (11), 1271-1276 (2017).
  9. Mavigner, M., et al. Simian Immunodeficiency Virus Persistence in Cellular and Anatomic Reservoirs in Antiretroviral Therapy-Suppressed Infant Rhesus Macaques. Journal of Virology. 92 (18), (2018).
  10. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogen. 14 (4), e1006956(2018).
  11. Deleage, C., et al. Impact of early cART in the gut during acute HIV infection. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (10), e87065(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie RNA wirusowegoWykrywanie DNA wirusowegoBadania nad HIVBadania nad SIVTkanki FFPENowoczesna ISHStrategia projektowania sondWzmocnienie sygna uT umienie t a
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.