Przygotowanie binarnych i trójskładnikowych głębokich układów eutektycznych

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu standaryzację przygotowania głębokich systemów eutektycznych w całej społeczności naukowej, tak aby systemy te mogły być reprodukowane.

Streszczenie

Przygotowanie głębokich systemów eutektycznych (DES) jest a priori prostą procedurą. Z definicji dwa lub więcej składników miesza się ze sobą w danym stosunku molowym, tworząc DES. Jednak z naszego doświadczenia w laboratorium wynika, że istnieje potrzeba ujednolicenia procedury przygotowania, scharakteryzowania i raportowania metodologii stosowanych przez różnych badaczy, tak aby można było odtworzyć opublikowane wyniki. W niniejszej pracy testujemy różne podejścia opisywane w literaturze do przygotowania systemów eutektycznych i oceniamy znaczenie wody w skutecznym przygotowaniu systemów ciekłych w temperaturze pokojowej. Opublikowane systemy eutektyczne składały się z kwasu cytrynowego, glukozy, sacharozy, kwasu jabłkowego, β-alaniny, kwasu L-winowego i betainy i nie wszystkie opisane metody otrzymywania można było odtworzyć. Jednak w niektórych przypadkach możliwe było odtworzenie opisanych systemów, z włączeniem wody jako trzeciego składnika mieszaniny eutektycznej.

Wprowadzenie

Rozpuszczalniki głęboko eutektyczne zostały nazwane rozpuszczalnikami XXI wieku i są uważane za rozpuszczalniki nowej generacji. Definiuje się je jako mieszaninę dwóch lub więcej związków chemicznych o określonym stosunku molowym, która powoduje znaczny spadek temperatury topnienia poszczególnych składników, stając się ciekłymi w temperaturze pokojowej^1,2,3. W tym sensie przygotowanie rozpuszczalników nie wymaga żadnej reakcji chemicznej, a zatem wydajność produkcji wynosi 100%. W 2011 roku Choi i jego współpracownicy poinformowali o możliwości występowania naturalnie występującego DES i nazwali je naturalnymi rozpuszczalnikami głęboko eutektycznymi (NADES)^3,4,5. NADES można przygotować z różnych kombinacji cukrów, aminokwasów, kwasów organicznych i pochodnych choliny; Systemy te przygotowane z naturalnych składników są z natury biokompatybilne i biodegradowalne, wykazując znacznie mniejszą toksyczność w porównaniu z innymi alternatywnymi rozpuszczalnikami (np. cieczami jonowymi)^5,6,7,8. Od 2015 roku liczba publikacji w tej dziedzinie gwałtownie wzrosła, a możliwe zastosowania NADES są bardzo szerokie³. Mimo że opublikowano wiele manuskryptów i recenzji, istnieją fundamentalne pytania, które nadal istnieją, a naukowcy nie znaleźli jeszcze odpowiedzi na intrygujące pytania, takie jak mechanizmy leżące u podstaw powstawania DES. Zrozumienie mechanizmu tworzenia DES doprowadziłoby do skonsolidowanego podejścia do opracowywania nowych systemów, a nie do obecnego podejścia opartego na próbach i błędach. Co więcej, możliwości w tej dziedzinie rosną z każdym dniem, ponieważ konsumenci stają się coraz bardziej świadomi zrównoważonego rozwoju swoich produktów, nie tylko pod względem ich końcowego okresu użytkowania, ale także pod względem samego przetwarzania^8,9,10. Aby wprowadzić znaczące innowacje w dziedzinie głębokich rozpuszczalników eutektycznych, najpierw potrzebna jest standaryzacja metod produkcji i charakteryzacji. Brak odtwarzalności niektórych systemów opisywanych w literaturze był motywacją do opracowania tej pracy, ponieważ kilkakrotnie mierzyliśmy się z tym problemem. W niniejszym artykule pokazujemy potrzebę i kluczowe znaczenie dokładnego opisania materiałów i metod oraz pokazujemy, że chociaż przygotowanie DES jest prostą i nieskomplikowaną procedurą, istnieją pewne kluczowe aspekty (np. obecność/ilość wody), które zawsze należy omówić.

Protokół

UWAGA: Badane NADES to betaina: kwas L-(+)-winowy (2:1), β-alanina:kwas DL-jabłkowy (3:2), glukoza:sacharoza (1:1) i kwas cytrynowy:glukoza (2:1). Systemy te przygotowano różnymi metodami: liofilizacji (FD), odparowywania próżniowego (VE) oraz podgrzewania i mieszania (HS) z wodą i bez. Jako przykład podano protokół dla systemu kwas cytrynowy:glukoza (2:1). NADES scharakteryzowano za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), spolaryzowanej mikroskopii optycznej (POM), zawartości wody i spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

1. Przygotowanie do NADES

1. Liofilizacja
   1. W osobnych pojemnikach dodaj 2 g monohydratu kwasu cytrynowego i 0,9530 g monohydratu glukozy. Dodaj 10 ml wody dejonizowanej do każdego i mieszaj, aż związki całkowicie się rozpuszczą.
   2. Wymieszaj ze sobą oba roztwory i upewnij się, że końcowy roztwór jest homogenizowany. Umieścić roztwór w kolbie okrągłodennej.
   3. Zamroź go za pomocą ciekłego azotu. Umieścić kolbę w liofilizatorze na 48 godzin, aby upewnić się, że cała woda została usunięta z próbki.
2. Parowanie próżniowe
   1. Odważyć 2 g monohydratu kwasu cytrynowego i 0,9530 g monohydratu glukozy w oddzielnych pojemnikach. Dodaj 10 ml wody dejonizowanej do każdego i mieszaj, aż związki całkowicie się rozpuszczą.
   2. Wymieszaj ze sobą oba roztwory i upewnij się, że roztwór jest homogenizowany. Umieścić roztwór w kolbie okrągłodennej.
   3. Za pomocą wyparki obrotowej wysuszyć próbkę, aż powstanie klarowna, lepka ciecz.
3. Podgrzewanie i mieszanie
   1. Do tej samej fiolki wsypać 2 g jednowodnego kwasu cytrynowego i 0,9530 g jednowodnego roztworu glukozy. Dodać 278 μl wody.
   2. Umieścić fiolkę z mieszadłem magnetycznym w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
   3. Pozostawić próbkę do momentu powstania klarownej, lepkiej cieczy.

2. Charakterystyka NADES

1. Spolaryzowana mikroskopia optyczna (POM)
   1. Umieść kroplę NADES na szkiełku mikroskopowym w celu obserwacji.
   2. Korzystając z trybu transmisji mikroskopu, należy przeprowadzić charakterystykę optyczną próbki w temperaturze pokojowej.
2. Miareczkowanie Karla-Fishera
   1. Zebrać 100 μl NADES do strzykawki, a następnie usunąć nadmiar płynu z zewnątrz.
   2. Umieścić strzykawkę na wadze i wytarować.
   3. Naciśnij przycisk START na urządzeniu KF i dodaj małą kroplę próbki do naczynia.
   4. Zważyć strzykawkę, wprowadzić masę na urządzeniu KF i nacisnąć ENTER. Wynik pojawi się na ekranie w ppm wody.
3. Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)
   1. Umieścić 3-10 mg każdej próbki w hermetycznej aluminiowej misce z pokrywką. Zamknij patelnię za pomocą prasy do próbek.
   2. Analizować próbki przy użyciu DSC w zakresie temperatur od -90 °C do temperatury degradacji, z szybkością ogrzewania 10 °C/min. Wykonać dwa cykle z 2-minutowym zatrzymaniem izotermicznym i przeprowadzić analizę w atmosferze azotu (50 ml/min).
4. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)
   1. Przygotować probówkę NMR o średnicy 5 mm, rozpuszczając 250 μl NADES w 250 μl dimetylosulfotlenku-d6 (DMSO-d₆).
   2. Uzyskać widma ¹H i NOESY w temperaturze 25 °C na spektrometrze 400 MHz.
   3. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy widm i użyj przesunięcia chemicznego DMSO-d6 (δ 2.50 ppm), aby przypisać wszystkie sygnały każdego składnika.

Wyniki

Z przygotowania NADES, wyniki, które spodziewamy się uzyskać, są pokazane na Rysunek 1. Opis każdego systemu znajduje się poniżej. Stosując metodę liofilizacji, wynikiem powinna być stała lub bardzo gęsta pasta, ponieważ cała woda jest usuwana z systemu. Stosując metodę odparowywania, wynikiem powinna być klarowna i lepka ciecz. Stosując metodę ogrzewania i mieszania z dodatkiem niewielkich ilości wody, wynikiem powinna być klarowna i bardzo lepka ciecz.

Wyniki uzyskane z POM można zobaczyć na stronie Rysunek 1. Kiedy NADES jest całkowicie uformowany, spodziewamy się zobaczyć obraz, wskazujący, że próbka jest całkowicie amorficzna i że w układzie nie pozostały żadne kryształy. Wyniki uzyskane metodą miareczkowania KF przedstawiono w tabeli 2. Oprócz ilości wody dodawanej do systemów, procentowa zawartość wody w końcowej mieszaninie zależy również od zawartości wody w odczynnikach.

Jeśli chodzi o DSC, celem tej techniki jest również potwierdzenie, że system jest płynny w zakresie temperatur, w którym zostanie zastosowany, więc oczekiwanym wynikiem jest posiadanie termogramu, który nie pokazuje żadnych zdarzeń termicznych w interesującym nas zakresie temperatur (Tabela 2). Technika NMR służy do potwierdzenia istnienia tworzenia wiązań wodorowych, które są główną cechą układów NADES. Można to potwierdzić poprzez obserwację zmian w przesunięciach chemicznych każdego sygnału oraz przez analizę widm NOESY, które pokazują korelacje przestrzenne i międzycząsteczkowe (Rysunek 2).

Składnik 1	Składnik 2	Sposób przygotowania	odniesienie
Betaina (Zakład)	Kwas L-(+)-winowy (LTA)	Parowanie próżniowe (VE)	Dai et al. (2013)5 oraz Espino et al. (2016)6
β-alanina (β-A)	Kwas DL-jabłkowy (MA)	Parowanie próżniowe (VE)	Dai et al. (2013)5 oraz Espino et al. (2016)6
Glukoza (Gluc)	Sacharoza (Suc)	Liofilizowane (FD)	Choi et al. (2011)4 oraz Espino et al. (2016)6
Kwas cytrynowy (CA)	Glukoza (Gluc)	Liofilizowane (FD)	Choi et al. (2011)4 oraz Espino et al. (2016)6

Tabela 1: Systemy opisywane w literaturze i metoda ich przygotowania.

NADES	Metoda przygotowania	Zawartość wody (%)
		Miara Karla Fischera
Zakład:LTA (2:1 + 20% wody)	Podgrzewanie i mieszanie, dodawanie wody	19,94 ± 1,28
Zakład:LTA (2:1)	Parowanie próżniowe	11,36 ± 0,78
β-A:MA (3:2 + 11% wody)	Podgrzewanie i mieszanie, dodawanie wody	11,45 ± 0,25
β-A:MA (3:2)	Parowanie próżniowe	18,84 ± 1,78
Gluc:Suc (1:1 + 21% wody)	Podgrzewanie i mieszanie, dodawanie wody	20,88 ± 0,13
Gluc:Suc (1:1)	Parowanie próżniowe	22,56 ± 0,48
CA:Gluc (2:1 + 17% wody)	Podgrzewanie i mieszanie, dodawanie wody	17,33 ± 0,68
CA:Gluc (2:1)	Parowanie próżniowe	20,04 ± 0,26

Tabela 2: Zawartość wody (%) w systemach przygotowanych różnymi metodami.

Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki NADES przygotowanego przez a) liofilizację, b) odparowanie próżniowe oraz c) ogrzewanie i mieszanie z dodatkiem wody. Rysunek pokazuje, że gdy system jest liofilizowany, otrzymany wynik jest kryształem, ponieważ cała woda jest usuwana z mieszaniny, podczas gdy gdy stosowane są metody VE i HS, ilość wody potrzebna do powstania NADES jest obecna, a uzyskany wynik jest jednorodną cieczą w temperaturze pokojowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Spolaryzowana mikroskopia optyczna CA:Glu (2:1) przygotowana różnymi metodami, z polaryzatorami krzyżowymi (zdjęcie po lewej) i polaryzatorami równoległymi (ilustracja po prawej) – 100 μm (wzmocnienie 10x). Czarne obrazy pokazują, że próbka jest cieczą w temperaturze pokojowej. Próbka FD jest całkowicie skrystalizowana, ponieważ wynik uzyskany tą techniką nie był cieczą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: a) Nakładanie widm ¹H NMR dla (A) systemu NADES kwas cytrynowy:glukoza:woda (2:1:4), (B) glukoza i (C) kwas cytrynowy; b) Widmo NOESY układu NADES kwas cytrynowy:glukoza:woda (2:1:4). Nałożone widma pokazują różnicę w przesunięciach chemicznych każdego składnika podczas tworzenia DES, zapoczątkowaną powstawaniem wiązań wodorowych między nimi. Widmo NOESY pokazuje oddziaływanie między protonem OH z kwasu cytrynowego a pozostałymi protonami z obu składników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Różne metodologie przygotowania NADES opisywane w literaturze obejmują metodę ogrzewania i mieszania (HS), odparowywanie próżniowe (VE) i liofilizację (FD). Systemy, które przygotowaliśmy w tej pracy, są opisane przez różnych autorów w literaturze 4,5,6,10,11. W tabeli 1 wymieniono składniki każdej mieszaniny, zgodnie z informacjami zawartymi w oryginalnym manuskrypcie, jak również metodę ich przygotowania.

Po naszych badaniach mających na celu odtworzenie opisanych systemów zdaliśmy sobie sprawę, że w niektórych przypadkach nie było możliwe uzyskanie podobnego NADES, jako klarownej, lepkiej, ciekłej próbki w temperaturze pokojowej. Przygotowanie NADES zależy od wielu czynników. Niektóre można łatwo kontrolować, ale inne są trudniejsze do standaryzacji. Najważniejszą rzeczą do rozważenia jest to, że produkt końcowy nie może opierać się na czynnikach zewnętrznych, takich jak używany sprzęt.

Następnie scharakteryzowano systemy przygotowane różnymi metodami. Za pomocą spolaryzowanej mikroskopii optycznej (POM) zaobserwowano, że przy metodzie HS bez wody, nawet w różnych temperaturach, NADES nie tworzył klarownej i lepkiej cieczy. Zaobserwowano jednak jednorodną i klarowną, lepką ciecz, jak pokazano na rysunku 1 podczas stosowania metody HS z niewielkimi ilościami wody i metody VE do przygotowania NADES.

Do określenia zjawisk termicznych mieszaniny wykorzystano DSC. Wyniki wykazały, że system jest ciekły w temperaturze pokojowej i do 130 °C, ponieważ termogram nie wykazuje żadnych zdarzeń termicznych. Zawartość wody w każdej próbce zmierzono metodą miareczkowania Karla-Fischera, a wyniki przedstawiono w tabeli 2. Należy podać zawartość wody w układach, ponieważ jest to parametr, który w największym stopniu wpływa na właściwości otrzymanej cieczy, takie jak lepkość i polarność. Zmiany te mają ogromny wpływ na wynik aplikacji, dla której zaprojektowano NADES.

NMR wykorzystano również do potwierdzenia powstawania wspomnianych układów NADES, poprzez tworzenie wiązań wodorowych pomiędzy cząsteczkami każdego układu. Jeden z przykładów podano na rysunku 2 dla układu NADES: kwas cytrynowy:glukoza (2:1) z 17% wodą otrzymaną przez HS, gdzie widmo protonów tego NADES i materiały wyjściowe (kwas cytrynowy i glukoza) są nałożone (rysunek 2a). Na tej podstawie można zaobserwować zmiany w przesunięciach chemicznych niektórych protonów z każdej cząsteczki. Główną zmianą jest przesunięcie protonu OH z kwasu cytrynowego. Pierwotnie sygnał ten pojawia się przy 5,16 ppm, ale sygnał ten zmienia się na 6,22 ppm z powodu tworzenia się wiązań wodorowych. Potwierdza to widmo NOESY (ryc. 2b), gdzie widoczne jest silne oddziaływanie między OH z kwasu cytrynowego a pozostałymi protonami. Podobną interakcję zaobserwowano w przypadku pozostałych systemów NADES.

W niniejszej pracy zaobserwowaliśmy, że opisy metody przygotowania systemów eutektycznych podawane w literaturze są czasami niekompletne, ze względu na brak informacji dotyczących zawartości wody w większości systemów. W metodzie VE woda jest dodawana poprzez przygotowanie roztworów różnych składników i mieszanie w temperaturze, która prowadzi do powstania systemów eutektycznych; Nie możemy być jednak pewni minimalnej wymaganej zawartości wody. Wiedza na temat procentowej zawartości wody potrzebnej do utworzenia systemów jest zatem uważana za kluczowy punkt, który zawsze powinien być zgłaszany, aby inni mogli odtworzyć przygotowanie różnych mieszanin eutektycznych.

Najlepszą metodą do zastosowania jest metoda HS z dodatkiem wody, ponieważ przygotowanie zajmuje mniej czasu, w przypadkach, gdy zawartość wody jest już opisana. Jeśli jednak informacje te nie są dostępne, najłatwiejszą metodą jest metoda VE, w której cała dostępna woda jest usuwana, a w systemie pozostaje tylko woda oddziałująca ze składnikami NADES. W każdym przypadku badacze powinni pozwolić systemom odparować przez wystarczająco dużo czasu, aby zapewnić, że wolna woda zostanie usunięta z systemu. Czas ten jest zależny od sprzętu i dlatego nie wystarczy opisać w sekcji dotyczącej materiałów czasu trwania metody VE, ale zawsze należy podać zawartość wody.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka NMR 5 mm	Norell
Acid monohydrat cytryny	Sigma-Aldrich
Advance III spektrometr	Bruker
Woda
dimetylosulfotlenek-d6	Sigma-Aldrich
DSC Q200	TA Instruments, USA
Liofilizator CHRIST ALPHA 1-4	Braun Biotec International
Monohydrat glukozy	Cmd chemikalia
Karl Fisher Coulometer	Metrohm
Olympus BX-51 spolaryzowany mikroskop optyczny	Olympus