Ten protokół ma na celu standaryzację przygotowania głębokich systemów eutektycznych w całej społeczności naukowej, tak aby systemy te mogły być reprodukowane.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie binarnych i trójskładnikowych głębokich układów eutektycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przygotowanie głębokich systemów eutektycznych (DES) jest a priori prostą procedurą. Z definicji dwa lub więcej składników miesza się ze sobą w danym stosunku molowym, tworząc DES. Jednak z naszego doświadczenia w laboratorium wynika, że istnieje potrzeba ujednolicenia procedury przygotowania, scharakteryzowania i raportowania metodologii stosowanych przez różnych badaczy, tak aby można było odtworzyć opublikowane wyniki. W niniejszej pracy testujemy różne podejścia opisywane w literaturze do przygotowania systemów eutektycznych i oceniamy znaczenie wody w skutecznym przygotowaniu systemów ciekłych w temperaturze pokojowej. Opublikowane systemy eutektyczne składały się z kwasu cytrynowego, glukozy, sacharozy, kwasu jabłkowego, β-alaniny, kwasu L-winowego i betainy i nie wszystkie opisane metody otrzymywania można było odtworzyć. Jednak w niektórych przypadkach możliwe było odtworzenie opisanych systemów, z włączeniem wody jako trzeciego składnika mieszaniny eutektycznej.
Wprowadzenie
Rozpuszczalniki głęboko eutektyczne zostały nazwane rozpuszczalnikami XXI wieku i są uważane za rozpuszczalniki nowej generacji. Definiuje się je jako mieszaninę dwóch lub więcej związków chemicznych o określonym stosunku molowym, która powoduje znaczny spadek temperatury topnienia poszczególnych składników, stając się ciekłymi w temperaturze pokojowej1,2,3. W tym sensie przygotowanie rozpuszczalników nie wymaga żadnej reakcji chemicznej, a zatem wydajność produkcji wynosi 100%. W 2011 roku Choi i jego współpracownicy poinformowali o możliwości występowania naturalnie występującego DES i nazwali je naturalnymi rozpuszczalnikami głęboko eutektycznymi (NADES)3,4,5. NADES można przygotować z różnych kombinacji cukrów, aminokwasów, kwasów organicznych i pochodnych choliny; Systemy te przygotowane z naturalnych składników są z natury biokompatybilne i biodegradowalne, wykazując znacznie mniejszą toksyczność w porównaniu z innymi alternatywnymi rozpuszczalnikami (np. cieczami jonowymi)5,6,7,8. Od 2015 roku liczba publikacji w tej dziedzinie gwałtownie wzrosła, a możliwe zastosowania NADES są bardzo szerokie3. Mimo że opublikowano wiele manuskryptów i recenzji, istnieją fundamentalne pytania, które nadal istnieją, a naukowcy nie znaleźli jeszcze odpowiedzi na intrygujące pytania, takie jak mechanizmy leżące u podstaw powstawania DES. Zrozumienie mechanizmu tworzenia DES doprowadziłoby do skonsolidowanego podejścia do opracowywania nowych systemów, a nie do obecnego podejścia opartego na próbach i błędach. Co więcej, możliwości w tej dziedzinie rosną z każdym dniem, ponieważ konsumenci stają się coraz bardziej świadomi zrównoważonego rozwoju swoich produktów, nie tylko pod względem ich końcowego okresu użytkowania, ale także pod względem samego przetwarzania8,9,10. Aby wprowadzić znaczące innowacje w dziedzinie głębokich rozpuszczalników eutektycznych, najpierw potrzebna jest standaryzacja metod produkcji i charakteryzacji. Brak odtwarzalności niektórych systemów opisywanych w literaturze był motywacją do opracowania tej pracy, ponieważ kilkakrotnie mierzyliśmy się z tym problemem. W niniejszym artykule pokazujemy potrzebę i kluczowe znaczenie dokładnego opisania materiałów i metod oraz pokazujemy, że chociaż przygotowanie DES jest prostą i nieskomplikowaną procedurą, istnieją pewne kluczowe aspekty (np. obecność/ilość wody), które zawsze należy omówić.
Protokół
UWAGA: Badane NADES to betaina: kwas L-(+)-winowy (2:1), β-alanina:kwas DL-jabłkowy (3:2), glukoza:sacharoza (1:1) i kwas cytrynowy:glukoza (2:1). Systemy te przygotowano różnymi metodami: liofilizacji (FD), odparowywania próżniowego (VE) oraz podgrzewania i mieszania (HS) z wodą i bez. Jako przykład podano protokół dla systemu kwas cytrynowy:glukoza (2:1). NADES scharakteryzowano za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), spolaryzowanej mikroskopii optycznej (POM), zawartości wody i spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).
1. Przygotowanie do NADES
- Liofilizacja
- W osobnych pojemnikach dodaj 2 g monohydratu kwasu cytrynowego i 0,9530 g monohydratu glukozy. Dodaj 10 ml wody dejonizowanej do każdego i mieszaj, aż związki całkowicie się rozpuszczą.
- Wymieszaj ze sobą oba roztwory i upewnij się, że końcowy roztwór jest homogenizowany. Umieścić roztwór w kolbie okrągłodennej.
- Zamroź go za pomocą ciekłego azotu. Umieścić kolbę w liofilizatorze na 48 godzin, aby upewnić się, że cała woda została usunięta z próbki.
- Parowanie próżniowe
- Odważyć 2 g monohydratu kwasu cytrynowego i 0,9530 g monohydratu glukozy w oddzielnych pojemnikach. Dodaj 10 ml wody dejonizowanej do każdego i mieszaj, aż związki całkowicie się rozpuszczą.
- Wymieszaj ze sobą oba roztwory i upewnij się, że roztwór jest homogenizowany. Umieścić roztwór w kolbie okrągłodennej.
- Za pomocą wyparki obrotowej wysuszyć próbkę, aż powstanie klarowna, lepka ciecz.
- Podgrzewanie i mieszanie
- Do tej samej fiolki wsypać 2 g jednowodnego kwasu cytrynowego i 0,9530 g jednowodnego roztworu glukozy. Dodać 278 μl wody.
- Umieścić fiolkę z mieszadłem magnetycznym w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
- Pozostawić próbkę do momentu powstania klarownej, lepkiej cieczy.
2. Charakterystyka NADES
- Spolaryzowana mikroskopia optyczna (POM)
- Umieść kroplę NADES na szkiełku mikroskopowym w celu obserwacji.
- Korzystając z trybu transmisji mikroskopu, należy przeprowadzić charakterystykę optyczną próbki w temperaturze pokojowej.
- Miareczkowanie Karla-Fishera
- Zebrać 100 μl NADES do strzykawki, a następnie usunąć nadmiar płynu z zewnątrz.
- Umieścić strzykawkę na wadze i wytarować.
- Naciśnij przycisk START na urządzeniu KF i dodaj małą kroplę próbki do naczynia.
- Zważyć strzykawkę, wprowadzić masę na urządzeniu KF i nacisnąć ENTER. Wynik pojawi się na ekranie w ppm wody.
- Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)
- Umieścić 3-10 mg każdej próbki w hermetycznej aluminiowej misce z pokrywką. Zamknij patelnię za pomocą prasy do próbek.
- Analizować próbki przy użyciu DSC w zakresie temperatur od -90 °C do temperatury degradacji, z szybkością ogrzewania 10 °C/min. Wykonać dwa cykle z 2-minutowym zatrzymaniem izotermicznym i przeprowadzić analizę w atmosferze azotu (50 ml/min).
- Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)
- Przygotować probówkę NMR o średnicy 5 mm, rozpuszczając 250 μl NADES w 250 μl dimetylosulfotlenku-d6 (DMSO-d6).
- Uzyskać widma 1H i NOESY w temperaturze 25 °C na spektrometrze 400 MHz.
- Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy widm i użyj przesunięcia chemicznego DMSO-d6 (δ 2.50 ppm), aby przypisać wszystkie sygnały każdego składnika.
Wyniki
W wyniku przygotowania NADES spodziewamy się uzyskać rezultaty przedstawione na Rysunku 1. Poniżej znajduje się opis każdego z systemów. W przypadku zastosowania metody liofilizacji wynikiem powinno być ciało stałe lub bardzo gęsta pasta, ponieważ z układu usuwana jest cała woda. W przypadku zastosowania metody odparowywania wynikiem powinna być przejrzysta i lepka ciecz. Przy zastosowaniu metody ogrzewania i mieszania z dodatkiem niewielkich ilości wody wynikiem powinna być przejrzysta i bardzo lepka ciecz.
Wyniki uzyskane za pomocą POM przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku całkowitego utworzenia się NADES oczekujemy otrzymania czarnego obrazu, co wskazuje na to, że próbka jest całkowicie amorficzna i w układzie nie pozostały żadne kryształy. Wyniki uzyskane z miareczkowania metodą KF opisano w Tabeli 2. Poza ilością wody dodanej do układów, procentowa zawartość wody w końcowej mieszaninie zależy również od zawartości wody w odczynnikach.
W odniesieniu do DSC, celem tej techniki jest również potwierdzenie, że układ pozostaje w stanie ciekłym w zakresie temperatur, w których będzie stosowany; oczekiwanym wynikiem jest zatem termogram, który nie wykazuje żadnych zdarzeń termicznych w interesującym nas zakresie temperatur (Tabela 2). Technika NMR jest wykorzystywana do potwierdzenia tworzenia się wiązań wodorowych, które stanowią główną charakterystykę układów NADES. Można to potwierdzić poprzez obserwację zmian przesunięć chemicznych poszczególnych sygnałów oraz analizę widm NOESY, które wykazują korelacje przestrzenne i międzycząsteczkowe (Rysunek 2).
| Komponent 1 | Komponent 2 | Metoda przygotowania | Bibliografia |
| Betaina (Bet) | Kwas L-(+)-winowy (LTA) | Odparowywanie próżniowe (VE) | Dai i in. (2013)5 oraz Espino i in. (2016)6 |
| β-alanina (β-A) | Kwas DL-jabłkowy (MA) | Odparowanie próżniowe (VE) | Dai i wsp. (2013)5 oraz Espino i wsp. (2016)6 |
| Glukoza (Gluc) | Sacharoza (Suc) | Liofilizowany (FD) | Choi i in. (201)4 oraz Espino i wsp. (2016)6 |
| Kwas cytrynowy (CA) | Glukoza (Gluc) | Liofilizowane (FD) | Choi i in. (201)4 oraz Espino i wsp. (2016)6 |
Tabela 1: Układy opisane w literaturze oraz metoda ich przygotowania.
| NADES | Metoda przygotowania | Zawartość wody (%) |
| Pomiar metodą Karla Fischera | ||
| Bet:LTA (2:1 + 20% wody) | Ogrzewanie i mieszanie, dodawanie wody | 19.94 ± 1.28 |
| Bet:LTA (2:1) | Odparowywanie próżniowe | 1.36 ± 0.78 |
| β-A:MA (3:2 + 1% wody) | Ogrzewanie i mieszanie, dodawanie wody | 1.45 ± 0.25 |
| β-A:MA (3:2) | Odparowywanie próżniowe | 18.84 ± 1.78 |
| Gluc:Suc (1:1 + 21% wody) | Ogrzewanie i mieszanie, dodawanie wody | 20.8 ± 0.13 |
| Gluc:Suc (1:1) | Odparowywanie próżniowe | 22.56 ± 0.48 |
| CA:Gluc (2:1 + 17% wody) | Ogrzewanie i mieszanie, dodawanie wody | 17.3 ± 0.68 |
| CA:Gluc (2:1) | Odparowywanie próżniowe | 20.04 ± 0.26 |
Tabela 2: Zawartość wody (%) w systemach przygotowanych różnymi metodami.
Rycina 1: Reprezentatywne wyniki dla NADES przygotowanych przez a) liofilizację, b) odparowanie próżniowe oraz c) ogrzewanie i mieszanie z dodatkiem wody. Na obrazku widać, że w przypadku liofilizacji układu uzyskanym wynikiem jest kryształ, ponieważ z mieszaniny usunięto całą wodę, natomiast przy zastosowaniu metod VE i HS obecna jest ilość wody niezbędna do powstania NADES, a uzyskanym wynikiem jest jednorodna ciecz w temperaturze pokojowej. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Mikroskopia optyczna w świetle spolaryzowanym kompleksu CA:Glu (2:1) przygotowanego różnymi metodami, z polaryzatorami skrzyżowanymi (obraz po lewej) i polaryzatorami równoległymi (obraz po prawej) – 100 μm (powiększenie 10x). Czarne obrazy wskazują, że w temperaturze pokojowej próbka jest cieczą. Próbka poddana liofilizacji (FD) uległa całkowitej krystalizacji, ponieważ wynik uzyskany za pomocą tej techniki nie był cieczą. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: a) Nałożenie 1Widma H NMR (A) układu NADES kwas cytrynowy:glukoza:woda (2:1:4), (B) glukozy oraz (C) kwasu cytrynowego; b) widmo NOESY układu NADES kwas cytrynowy:glukoza:woda (2:1:4). Nałożone widma wykazują różnice w przesunięciach chemicznych każdego z komponentów po utworzeniu DES, co wynika z nawiązania między nimi wiązań wodorowych. Widmo NOESY wykazuje oddziaływanie protonu grupy OH kwasu cytrynowego z pozostałymi protonami obu komponentów. Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.
Dyskusja
Różne metodologie przygotowania NADES opisywane w literaturze obejmują metodę ogrzewania i mieszania (HS), odparowywanie próżniowe (VE) i liofilizację (FD). Systemy, które przygotowaliśmy w tej pracy, są opisane przez różnych autorów w literaturze 4,5,6,10,11. W tabeli 1 wymieniono składniki każdej mieszaniny, zgodnie z informacjami zawartymi w oryginalnym manuskrypcie, jak również metodę ich przygotowania.
Po naszych badaniach mających na celu odtworzenie opisanych systemów zdaliśmy sobie sprawę, że w niektórych przypadkach nie było możliwe uzyskanie podobnego NADES, jako klarownej, lepkiej, ciekłej próbki w temperaturze pokojowej. Przygotowanie NADES zależy od wielu czynników. Niektóre można łatwo kontrolować, ale inne są trudniejsze do standaryzacji. Najważniejszą rzeczą do rozważenia jest to, że produkt końcowy nie może opierać się na czynnikach zewnętrznych, takich jak używany sprzęt.
Następnie scharakteryzowano systemy przygotowane różnymi metodami. Za pomocą spolaryzowanej mikroskopii optycznej (POM) zaobserwowano, że przy metodzie HS bez wody, nawet w różnych temperaturach, NADES nie tworzył klarownej i lepkiej cieczy. Zaobserwowano jednak jednorodną i klarowną, lepką ciecz, jak pokazano na rysunku 1 podczas stosowania metody HS z niewielkimi ilościami wody i metody VE do przygotowania NADES.
Do określenia zjawisk termicznych mieszaniny wykorzystano DSC. Wyniki wykazały, że system jest ciekły w temperaturze pokojowej i do 130 °C, ponieważ termogram nie wykazuje żadnych zdarzeń termicznych. Zawartość wody w każdej próbce zmierzono metodą miareczkowania Karla-Fischera, a wyniki przedstawiono w tabeli 2. Należy podać zawartość wody w układach, ponieważ jest to parametr, który w największym stopniu wpływa na właściwości otrzymanej cieczy, takie jak lepkość i polarność. Zmiany te mają ogromny wpływ na wynik aplikacji, dla której zaprojektowano NADES.
NMR wykorzystano również do potwierdzenia powstawania wspomnianych układów NADES, poprzez tworzenie wiązań wodorowych pomiędzy cząsteczkami każdego układu. Jeden z przykładów podano na rysunku 2 dla układu NADES: kwas cytrynowy:glukoza (2:1) z 17% wodą otrzymaną przez HS, gdzie widmo protonów tego NADES i materiały wyjściowe (kwas cytrynowy i glukoza) są nałożone (rysunek 2a). Na tej podstawie można zaobserwować zmiany w przesunięciach chemicznych niektórych protonów z każdej cząsteczki. Główną zmianą jest przesunięcie protonu OH z kwasu cytrynowego. Pierwotnie sygnał ten pojawia się przy 5,16 ppm, ale sygnał ten zmienia się na 6,22 ppm z powodu tworzenia się wiązań wodorowych. Potwierdza to widmo NOESY (ryc. 2b), gdzie widoczne jest silne oddziaływanie między OH z kwasu cytrynowego a pozostałymi protonami. Podobną interakcję zaobserwowano w przypadku pozostałych systemów NADES.
W niniejszej pracy zaobserwowaliśmy, że opisy metody przygotowania systemów eutektycznych podawane w literaturze są czasami niekompletne, ze względu na brak informacji dotyczących zawartości wody w większości systemów. W metodzie VE woda jest dodawana poprzez przygotowanie roztworów różnych składników i mieszanie w temperaturze, która prowadzi do powstania systemów eutektycznych; Nie możemy być jednak pewni minimalnej wymaganej zawartości wody. Wiedza na temat procentowej zawartości wody potrzebnej do utworzenia systemów jest zatem uważana za kluczowy punkt, który zawsze powinien być zgłaszany, aby inni mogli odtworzyć przygotowanie różnych mieszanin eutektycznych.
Najlepszą metodą do zastosowania jest metoda HS z dodatkiem wody, ponieważ przygotowanie zajmuje mniej czasu, w przypadkach, gdy zawartość wody jest już opisana. Jeśli jednak informacje te nie są dostępne, najłatwiejszą metodą jest metoda VE, w której cała dostępna woda jest usuwana, a w systemie pozostaje tylko woda oddziałująca ze składnikami NADES. W każdym przypadku badacze powinni pozwolić systemom odparować przez wystarczająco dużo czasu, aby zapewnić, że wolna woda zostanie usunięta z systemu. Czas ten jest zależny od sprzętu i dlatego nie wystarczy opisać w sekcji dotyczącej materiałów czasu trwania metody VE, ale zawsze należy podać zawartość wody.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji, na podstawie umowy o grant nr ERC-2016-CoG 725034. Prace te były również wspierane przez Associate Laboratory for Green Chemistry-LAQV, które jest finansowane ze środków krajowych z FCT/MCTES (UID/QUI/50006/2019) oraz przez FCT/MCTES w ramach projektu CryoDES (PTDC/EQU-EQU/29851/2017).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurka NMR 5 mm | Norell | ||
| Acid monohydrat cytryny | Sigma-Aldrich | ||
| Advance III spektrometr | Bruker | ||
| Woda | |||
| dimetylosulfotlenek-d6 | Sigma-Aldrich | ||
| DSC Q200 | TA Instruments, USA | ||
| Liofilizator CHRIST ALPHA 1-4 | Braun Biotec International | ||
| Monohydrat glukozy | Cmd chemikalia | ||
| Karl Fisher Coulometer | Metrohm | ||
| Olympus BX-51 spolaryzowany mikroskop optyczny | Olympus |
Bibliografia
- Paiva, A., et al. Natural deep eutectic solvents - solvents for the 21st century. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 2, 1063-1071 (2014).
- Abbott, A. P., Capper, G., Davies, D. L., Rasheed, R. K., Tambyrajah, V. Novel solvent properties of choline chloride/urea mixtures. Chemical Communications. , 70-71 (2003).
- Liu, Y., et al. Natural deep eutectic solvents: properties, applications, and perspectives. Journal of Natural Products. 81, 679-690 (2018).
- Choi, Y. H., et al. Are natural deep eutectic solvents the missing link in understanding cellular metabolism and physiology. Plant Physiology. 156, 1701-1705 (2011).
- Dai, Y., Spromsen, J. V., Witkamp, G. -J., Verpoorte, R., Choi, Y. H. Natural deep eutectic solvents as new potential media for green technology. Analytica Chimica Acta. 766, 61-68 (2013).
- Espino, M., Fernández, M. A., Gomez, F. J. V., Silva, M. F. Natural designer solvents for greening analytical chemistry. Trends in Analytical Chemistry. 76, 126-136 (2016).
- Hayyan, M., et al. Natural deep eutectic solvents: cytotoxic profile. Springer Plus. 5, 913(2016).
- Dai, Y., Witkamp, G. -J., Verpoorte, R., Choi, Y. H. Tailoring properties of natural deep eutectic solvents with water to facilitate their applications. Food Chemistry. 187, 14-19 (2015).
- Choi, Y. H., Verpoorte, R. Green solvents for the extraction of bioactive compounds from natural products using ionic liquids and deep eutectic solvents. Current Opinion in Food Science. 26, 87-93 (2019).
- Guitérrez, M. C., Ferrer, M. L., Mateo, C. R., Del Monte, F. Freeze-drying of aqueous solutions of deep eutectic solvents: a suitable approach to deep eutectic suspensions of self-assembled structures. Langmuir. 25, 5509-5515 (2009).
- Gomez, F. J. V., Espino, M., Fernández, M. A., Silva, M. F. A greener approach to prepare natural deep eutectic solvents. Chemistry Select. 3, 6122-6125 (2018).
Przedruki i uprawnienia
