Ten protokół dostarcza otwarty program MATLAB, który generuje spektrogramy wielostożkowe dla danych elektroencefalograficznych.
Artykuł metodologiczny
Ten protokół dostarcza otwarty program MATLAB, który generuje spektrogramy wielostożkowe dla danych elektroencefalograficznych.
Obecne zasoby internetowe dostarczają ograniczonych, przyjaznych dla użytkownika narzędzi do obliczania spektrogramów do wizualizacji i kwantyfikacji danych elektroencefalograficznych (EEG). W tym artykule opisano oparty na systemie Windows, otwarty kod źródłowy do tworzenia spektrogramów wielostożkowych EEG. Skompilowany program jest dostępny dla użytkowników systemu Windows bez licencji na oprogramowanie. W przypadku użytkowników komputerów Macintosh program jest ograniczony do osób z licencją na oprogramowanie MATLAB. Program jest zilustrowany za pomocą spektrogramów EEG, które różnią się w zależności od stanów snu i czuwania oraz zmian wywołanych przez opiaty w tych stanach. EEG myszy C57BL / 6J rejestrowano bezprzewodowo przez 4 godziny po dootrzewnowym wstrzyknięciu soli fizjologicznej (kontrola nośnika) i antynocyceptywne dawki morfiny, buprenorfiny i fentanylu. Spektrogramy wykazały, że buprenorfina i morfina powodowały podobne zmiany w mocy EEG przy 1−3 Hz i 8−9 Hz. Spektrogramy po podaniu fentanylu wykazały maksymalne średnie pasma mocy przy 3 Hz i 7 Hz. Spektrogramy ujawniły zróżnicowany wpływ opiatów na częstotliwość i moc EEG. Te metody komputerowe można uogólnić na różne klasy leków i można je łatwo modyfikować w celu ilościowego określenia i wyświetlenia szerokiego zakresu rytmicznych sygnałów biologicznych.
Dane EEG mogą być produktywnie analizowane w dziedzinie częstotliwości w celu scharakteryzowania poziomów pobudzenia behawioralnego i neurofizjologicznego1. Spektrogramy wielostożkowe przekształcają przebieg EEG w domeny czasu i częstotliwości, co skutkuje wizualizacją dynamicznej mocy sygnału przy różnych częstotliwościach w czasie. Spektrogram wielostożkowy wykorzystuje analizę Fouriera do oszacowania gęstości spektralnej. Oszacowanie gęstości spektralnej rozdziela przebieg na czyste fale sinusoidalne składające się na sygnał i jest analogiczne do dyfrakcji białego światła przez pryzmat, aby zobaczyć całe spektrum kolorów2. Wielostożkowy spektrogram EEG reprezentuje połączoną aktywność wielu sieci neuronów o wzorcach wyładowań, które oscylują z różnymi częstotliwościami2. Ze względu na niezmiennik przesunięcia w czasie, transformata Fouriera jest uważana za najlepszą transformację między dziedzinami czasu i częstotliwości3. Analiza Fouriera ma również szereg ograniczeń. Sygnały EEG są niestacjonarne. W związku z tym małe zmiany mogą nie być zauważalne w metodach Fouriera, a analiza może się zmieniać w zależności od wielkości zbioru danych. Jednak okienkowanie jest używane podczas stosowania transformaty Fouriera do sygnału niestacjonarnego. Zakłada to, że widmo sygnału zmienia się tylko nieznacznie w krótkich okresach czasu. Alternatywną metodą analizy spektralnej jest transformacja falkowa, która może być bardziej odpowiednia do wykrywania chorób mózgu3.
Z funkcjonalnego punktu widzenia, różne oscylacje składające się na sygnał EEG są fenotypami niższego poziomu, cechami charakterystycznymi dla fenotypów wyższego poziomu, stanów takich jak sen i czuwanie2, lub utrata czuwania spowodowana przez ogólne znieczulenie4,5,6. Jeśli chodzi o stany snu i czuwania, spektrogram wyraźnie pokazuje, że endogennie generowane rytmy snu są ciągłe i dynamiczne7. Ilościowe opisy stanów snu i czuwania tradycyjnie obejmowały proces kategoryzacji, który przypisuje klasyfikację snu lub czuwania do każdej konkretnie zdefiniowanej epoki (np. 10 s) zapisu EEG. Te przedziały stanów są następnie wykreślane jako funkcja czasu. Wykresy danych przebiegu czasu, często określane jako hipnogramy, są używane do odróżniania normalnego snu od snu zakłóconego przez chorobę, podawanie leków, zmiany rytmu okołodobowego, pracę zmianową itp. Ograniczeniem wykresów hipnogramów jest to, że błędnie przedstawiają one sygnały EEG, wyrażając stany pobudzenia jako przebiegi prostokątne. Kreślenie hipnogramu obejmuje dyskretyzację stanów pobudzenia2 i nie pozwala na drobnoziarniste wyświetlanie etapów pośrednich lub przejściowych. Co więcej, epoki punktacji 10 s powodują dyskretyzację czasu poprzez nałożenie dolnej granicy na skalę czasu. Wynikiem dyskretyzacji zarówno stanu, jak i czasu jest utrata informacji neurofizjologicznych dotyczących dynamicznego oddziaływania między stanami świadomości2 oraz wywołane przez leki zakłócenie tych stanów4. Na przykład różne środki znieczulające działają na różne cele molekularne i sieci neuronowe. Farmakologiczna manipulacja tymi sieciami neuronowymi niezawodnie tworzy spektrogramy unikalne dla leku, dawki i drogi podawania4.
Obecny protokół został opracowany w celu ułatwienia badań nad mechanizmami, za pomocą których opioidy wpływają na sen8, breathing9, nociception10, and brain neurochemistry11. Protokół ten opisuje kroki wymagane do stworzenia wielotapetkowego spektrogramu do analiz EEG, które można wykonać przy użyciu zastrzeżonego oprogramowania lub systemu, który nie ma licencji MATLAB. Myszy C57BL/6J (B6) wykorzystano do walidacji zdolności tej metody komputerowej do tworzenia nowych spektrogramów EEG podczas normalnych, niezakłóconych stanów snu i czuwania oraz po ogólnoustrojowym podawaniu opiatów. Wiarygodność i trafność analiz potwierdzono poprzez systematyczne porównania różnic między spektrogramami EEG po tym, jak myszy B6 otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcia soli fizjologicznej (kontrola nośnika) i antynocyceptywne dawki morfiny, buprenorfiny i fentanylu.
Badania ilościowe dynamiki EEG u noworodków u myszy mają znaczenie translacyjne, dostarczając modelu do badań mających na celu lepsze zrozumienie EEG u noworodków u ludzi12. Kwantyfikacja dynamiki EEG nie jest jedynie opisowa i może przyczynić się do opracowania podejść do uczenia maszynowego, które mogą przewidywać pobudzenie częściowo na podstawie danych EEG13. Celem niniejszego raportu jest promowanie nauki translacyjnej poprzez dostarczenie szeroko dostępnego, przyjaznego dla użytkownika kodu do obliczania spektrogramów wielostożkowych, które charakteryzują zmiany w EEG myszy wywołane przez leki.
Wszystkie procedury z udziałem myszy były zgodne z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych (8edycja, National Academies Press, Waszyngton, 2011) i zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tennessee.
1. Implantacja elektrod rejestrujących i wstępne zbieranie danych
2. Udogodnienia i wyposażenie
3. Obliczenia spektrogramu
4. Rozwiązywanie problemów
Poniższe rysunki ilustrują rodzaj nowych wniosków dotyczących wskaźników pobudliwości mózgu w EEG, jakie dostarczają spektrogramy.
Rysunek 1A przedstawia podobieństwa i różnice w korowym EEG podczas czuwania, snu NREM oraz snu REM. Wielu badaczy wykorzystuje tego typu zapisy wraz z rejestracjami EMG (nie pokazano), aby ilościowo określić czas snu i czuwania. Rysunek 1B wykorzystuje wykres hipnogramu do przedstawienia organizacji czasowej stanów snu i czuwania na podstawie analizy zapisów EEG i EMG. Stany oceniano w 10 s epokach, a epoki te naniesiono na hipnogram w ciągu 14 400 s obejmujących 4 h rejestracji. Wykresy hipnogramów nie oddają faktu, że przejścia między stanami są ciągłe i nieliniowe. W przeciwieństwie do wykresu hipnogramu, spektrogram (Rysunek 1C) ilustruje wysoce dynamiczne zmiany częstotliwości i mocy EEG w funkcji czasu. Spektrogram podkreśla również podobieństwa między sygnałem korowym EEG podczas czuwania a sygnałem podczas snu REM. Trzy ramki nałożone na spektrogram (Rysunek 1C) zaznaczają stany zidentyfikowane jako czuwanie (WAKE), sen NREM i sen REM w powyższym hipnogramie (Rysunek 1B) i służą one ułatwieniu wizualizacji szczegółowych zmian częstotliwości i mocy EEG. Spektrogram z całego okresu rejestracji pozwala na niuansowe ujęcie EEG jako procesu ciągłego.
Rysunek 2 przedstawia cztery spektrogramy wielookienne, z których każdy podsumowuje 4 h zapisów EEG po podaniu doszpikowym soli fizjologicznej, morfiny, buprenorfiny i fentanylu. Wszystkie cztery zapisy pochodzą od tej samej myszy i rozpoczęto je 2 h po wystąpieniu fazy światła. Opioidy, w przeciwieństwie do soli fizjologicznej, hamowały sen NREM i REM oraz zwiększały czas czuwania. Na spektrogramach widocznych jest szereg nowych cech. Wykrycie nowych cech EEG sugeruje możliwość zastosowania tej metody do rozróżniania opioidów w środowisku zagrożenia chemicznego. Po wstrzyknięciu soli fizjologicznej (Rysunek 2A) największa moc koncentrowała się w zakresie 2−4 Hz, co wskazuje na sen NREM. Należy zauważyć, że spektrogramy EEG uległy zasadniczej zmianie pod wpływem podania opioidu i że każdy z nich wywołał unikalne zmiany spektralne.
Rysunek 3 pokazuje, że zmiany w EEG przedstawione na spektrogramach mogą zostać skwantyfikowane i wyrażone jako średnia dominująca moc widmowa każdej połowy częstotliwości (Rysunek 3A) oraz jako średnia moc widmowa w określonych pasmach częstotliwości EEG (Rysunek 3B). Największe różnice w stosunku do soli fizjologicznej wywołała buprenorfina, a wystąpiły one w zakresach delta i theta.

Rycina 1: Rejestracje kory EEG wykorzystane do stworzenia hypnogramów i spektrogramów. (A) Formy fal EEG zarejestrowane podczas czuwania, snu NREM i snu REM podczas pomiaru bazowego (bez iniekcji). Każły ślad przedstawia 90 s rejestracji. (B) Hypnogram wykorzystuje wysokość słupków do określenia stanu świadomości (oś rzędnych) w funkcji 4 h rejestracji (oś odciętych). (C) Spektrogram zwężony (tapered spectrogram) wykorzystujący pasek kolorów do przedstawienia mocy EEG w decybelach (dB, prawa oś rzędnych) lub gęstości mocy spektralnej przy różnych częstotliwościach EEG w hercach (Hz, lewa oś rzędnych) jako funkcję 4 h czasu rejestracji (oś odciętych). Do spektrogramu dodano czarne linie pionowe, aby wyznaczyć po jednym epizodzie czuwania, snu NREM i snu REM. (Parametry spektrogramu: częstotliwość próbkowania = 500 Hz, fpass = 0.3 Hz i 30 Hz, padding = 2, time-bandwidth = 15, liczba taperów 29, średnia z prób = 1, czas obliczeń FFT ~30 s, wielkość kroku okna dla obliczeń FFT = 5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Spektrogramy ilustrujące zmiany mocy i częstotliwości EEG wywołane podaniem opioidów. Każdy spektrogram przedstawia częstotliwość EEG w hercach (Hz, oś rzędnych po lewej) oraz moc EEG w decybelach (dB) przy użyciu paska kolorów (oś rzędnych po prawej) przez 4 h (oś odciętych) po podaniu (A) soli fizjologicznej, (B) morfiny, (C) buprenorfiny oraz (D) fentanylu. (Parametry spektrogramu: częstotliwość próbkowania = 500 Hz, fpass = 0.3 Hz i 30 Hz, padding = 2, time-bandwidth = 15, liczba taperów 29, średnia z prób = 1, czas obliczeń FFT ~30 s, wielkość kroku okna dla obliczeń FFT = 5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3: Opioidy w różny sposób zmieniały średnią moc EEG w pasmach częstotliwości delta i theta. (A) Podsumowanie średniej mocy EEG podczas każdego 4-godzinnego zapisu przedstawionego na Rycini 2. Oś rzędnych przedstawia średnią moc EEG dla każdej połowy częstotliwości (oś odciętych). W stosunku do kontroli z solą fizjologiczną, każda z trzech pozostałych funkcji wykazuje specyficzne dla danego opioidu zmiany średniej mocy EEG. (B) Ilustracja średniej mocy EEG w czterech pasmach częstotliwości EEG (delta, theta, alfa i beta) po podaniu soli fizjologicznej (S), buprenorfiny (B), morfiny (M) i fentanylu (F). Kodowanie kolorystyczne jest takie samo dla funkcji mocy w części A oraz średnich pasm mocy w części B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Opisany tutaj program został opracowany w celu stworzenia spektrogramu przy użyciu dziewięciu kroków opisanych w sekcji 3 protokołu, Obliczenia spektrogramu. Kroki te obejmują nabycie programu do spektrogramu, zapewnienie prawidłowego formatu pliku i zmianę parametrów obliczeniowych w celu wygenerowania unikalnych spektrogramów użytkownika. Użytkownicy mogą tworzyć spektrogramy, które są dostosowane do szeregu pytań koncepcyjnych i projektów eksperymentalnych. Aby zwiększyć łatwość i wydajność tego procesu rozwoju, konieczne jest dostarczenie surowych danych EEG w odpowiednim formacie pliku, nazwanym zgodnie z ograniczeniami opisanymi powyżej. Chociaż podano przykładowe sygnały dla danych EEG myszy, program spektrogramu można łatwo zastosować do danych EEG pochodzących od ludzi i innych osób, które są wolne od ograniczeń przetwarzania sygnału.
Zalecanym podejściem do rozwiązywania problemów i modyfikacji metody jest rozpoczęcie od przeanalizowania małego zestawu danych. Główne wyniki programu, które należy wziąć pod uwagę, obejmują wykresy przefiltrowanego EEG, a także spektrogram. Atrakcyjnym aspektem stożkowego spektrogramu jest to, że można go zastosować do szerokiej gamy okresowych sygnałów biologicznych. Różnorodność waha się od długotrwałych rytmów okołodobowych (24 godziny)17 do bardzo szybkich rytmów, takich jak szybkość rozładowania 1,000 Hz ogniwa Renshawa18.
Formatowanie danych jest ograniczeniem tego protokołu spektrogramu. Europejski format danych (EDF) jest szeroko stosowany w przypadku danych EEG. Istnieje jednak wiele innych opcji formatowania. Z tego powodu dołączono plik z nieprzetworzonym kodem (patrz 3.2 powyżej) na wypadek, gdyby użytkownik chciał zmienić format pliku. W odniesieniu do surowego pliku programu kolejnym ograniczeniem jest konieczność posiadania doświadczenia z językiem programowania komputerowego w celu zmiany formatu pliku. Nie wszyscy śledczy mają dostęp do zastrzeżonego oprogramowania i pełnej gamy wtyczek. Ten protokół został opracowany w celu obejścia tego problemu poprzez dostarczenie skompilowanego programu, który działa na urządzeniu z systemem Windows bez licencji na oprogramowanie. Osiąga się to za pomocą wtyczki RUNTIME, która jest zawarta w skompilowanym programie i nie wymaga żadnej rejestracji oprogramowania przez użytkownika.
Ta procedura spektrogramu EEG jest nowatorskim programem komputerowym o otwartym kodzie źródłowym, który umożliwia użytkownikom tworzenie spersonalizowanych, wielostożkowych spektrogramów z szerokiego zakresu danych. Użytkownik ma pełną kontrolę nad wszystkimi aspektami obliczeniowymi generowania spektrogramu. Bez wcześniejszej wiedzy na temat przetwarzania sygnałów i programowania komputerowego generowanie spektrogramów może być trudne. Opisany tutaj protokół ułatwi generowanie spektrogramu. Zapoznaj się z sekcją materiałów uzupełniających, aby uzyskać dalsze odczyty przetwarzania sygnału i wskazówki dotyczące spektrogramu wielostożkowego.
Materiały uzupełniające
http://chronux.org
http://www-users.med.cornell.edu/~jdvicto/pdfs/pubo08.pdf
http://www.fieldtriptoolbox.org/tutorial/timefrequencyanalysis/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4502759/#SD3-data
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Ta praca jest częściowo wspierana przez grant NIH HL-65272. Autorzy dziękują Zachary'emu T. Glovakowi i Clarence'owi E. Locklearowi za ich wkład w ten projekt.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Akryl dentystyczny | Lang Dental Manufacturing Co | Jet w proszku i płynny | |
| wzmacniacz EEG/EMG | Data Science International | model MX2 | |
| macOS Mojave | Apple | v10.14.4 | |
| MATLAB | Mathworks | v9.4.0.813654 | oprogramowanie do spektrogramu comp. |
| Maska anestezjologiczna dla myszy | David Kopf Instruments | model 907 | |
| Neuroscore | Data Science International | v3.3.9317-1 | oprogramowanie do oceny snu i czuwania |
| Ponemah | Data Science International | v5.32 | do akwizycji danych EEG/EMG |
| Ramka stereotaktyczna | David Kopf Instruments | model 962 | |
| Ramka stereotaktyczna, adapter myszy | David Kopf Instruments | model 921 | |
| Windows 10 | Microsoft | v10.0.17763.503 | |
| Bezprzewodowy telemetr | Data Science | International model HD-X02 |