Artykuł metodologiczny

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

DOI:

10.3791/60334

⸱

28 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste wykazują unikalną zdolność do reagowania na morfogeny in vitro poprzez samoorganizujące się wzorce specyfikacji losu komórki, które odpowiadają tworzeniu się pierwotnego listka zarodkowego podczas embriogenezy. Komórki te stanowią zatem potężne narzędzie do badania mechanizmów napędzających wczesny rozwój człowieka. Opracowaliśmy metodę hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na zgodnych podłożach, która zapewnia kontrolę zarówno nad geometrią kolonii, jak i ich środowiskiem mechanicznym w celu podsumowania parametrów fizycznych leżących u podstaw embriogenezy. Kluczową cechą tej metody jest zdolność do generowania hydrożeli poliakrylamidowych ze zdefiniowanymi wzorami ligandu macierzy zewnątrzkomórkowej na powierzchni w celu promowania przyłączania komórek. Osiąga się to poprzez wytwarzanie szablonów z pożądanymi wzorami geometrycznymi, używanie tych szablonów do tworzenia wzorów ligandów macierzy zewnątrzkomórkowej na szklanych szkiełkach nakrywkowych i przenoszenie tych wzorów do hydrożeli poliakrylamidowych podczas polimeryzacji. Metoda ta jest również kompatybilna z mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając użytkownikowi pomiar i mapowanie rozkładu sił generowanych przez komórki w zamkniętych koloniach. W połączeniu ze standardowymi testami biochemicznymi, pomiary te mogą być wykorzystane do zbadania roli, jaką wskazówki mechaniczne odgrywają w specyfikacji losu i morfogenezie we wczesnym rozwoju człowieka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1,2,3,4,5. Wynika to w dużej mierze z ograniczonego zrozumienia mechanizmów, które napędzają powstawanie tych tkanek podczas rozwoju człowieka. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, w ostatnich latach pojawiło się wiele metod modelowania wczesnego zarodka i kolejnych etapów rozwoju za pomocą embrionalnych komórek macierzystych6,7,8,9,10,11,12,13.

Krótko po wyprowadzeniu pierwszych linii hESC14, wykazano, że ciała embrionalne utworzone z hESC były zdolne do spontanicznego wytwarzania komórek trzech głównych listków zarodkowych6. Jednak ze względu na nieodłączny brak kontroli nad rozmiarem i morfologią ciał zarodkowych, organizacja listków zarodkowych różniła się znacznie i nie pasowała do organizacji wczesnego zarodka. Niedawno Warmflash i in. opracowali metodę ograniczania kolonii hESC na podłożach szklanych za pomocą mikrowzorców, zapewniając kontrolę i spójność nad rozmiarem i geometrią kolonii8. W obecności BMP4, ważnego morfogenu we wczesnym rozwoju, te ograniczone kolonie były zdolne do samoorganizujących się, powtarzalnych wzorców specyfikacji dla losów reprezentujących podstawowe listki rozrodcze. Chociaż dostarczyło to użytecznego modelu do badania mechanizmów, za pomocą których tworzone są pierwotne listki zarodkowe, wzorce specyfikacji losu nie pasowały dokładnie do organizacji i morfogenezy obserwowanej podczas embriogenezy15. Wierniejsze odwzorowanie wczesnego rozwoju embrionalnego uzyskano poprzez osadzenie hESC w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) matrigel11, dostarczając najsilniejszych jak dotąd dowodów na zdolność hESC do samoorganizacji i modelowania wczesnych etapów embriogenezy ex vivo. Jednak metoda ta daje niespójne wyniki, a zatem jest niezgodna z wieloma testami, które można by wykorzystać do ujawnienia podstawowych mechanizmów samoorganizacji i specyfikacji losu.

Biorąc pod uwagę te istniejące metody i ich ograniczenia, staraliśmy się opracować metodę powtarzalnej hodowli kolonii hESC o określonych geometriach w warunkach, które modelują środowisko zewnątrzkomórkowe wczesnego zarodka. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy hydrożele poliakrylamidowe o regulowanej elastyczności do kontrolowania właściwości mechanicznych podłoża. Korzystając z mikroskopii sił atomowych na zarodkach kurczaków w stadium gastrulacji, stwierdziliśmy, że elastyczność epiblastu wahała się od setek paskali do kilku kilopaskali . W związku z tym skupiliśmy się na wytworzeniu hydrożeli poliakrylamidowych o elastyczności w tym zakresie, które mogłyby służyć jako substrat dla kolonii hESC. Zmodyfikowaliśmy nasze poprzednie metody hodowli hESC na hydrożelach poliakrylamidowych7,9, aby zapewnić solidną kontrolę nad geometrią kolonii. Osiągnęliśmy to, najpierw wzorując ligandy ECM, a mianowicie matrigel, na szklanych szkiełkach nakrywkowych za pomocą mikroprefabrykowanych szablonów, jak wcześniej informowaliśmy16. Następnie opracowaliśmy nowatorską technikę przenoszenia wzorzystego liganda na powierzchnię hydrożeli poliakrylamidowych podczas polimeryzacji. Metoda, którą tutaj opisujemy, polega na wykorzystaniu fotolitografii do wytworzenia płytki krzemowej o pożądanych wzorach geometrycznych, stemple tych cech geometrycznych za pomocą polidimetylosiloksanu (PDMS) i użyciu tych stempli do wygenerowania szablonów, które ostatecznie umożliwiają naniesienie ligandu na powierzchnię szklanych szkiełek nakrywkowych i przeniesienie na poliakrylamid.

Oprócz rekapitulacji środowiska mechanicznego wczesnego zarodka, zamknięcie kolonii hESC na poliakrylamidzie umożliwia pomiar sił generowanych przez komórki za pomocą mikroskopii siły trakcyjnej (TFM), jak opisano w naszej poprzedniej metodzie9. Krótko mówiąc, kulki fluorescencyjne mogą być zatopione w poliakrylamidzie i używane jako znaczniki odniesienia. Siły generowane przez komórki są obliczane poprzez obrazowanie przemieszczenia tych kulek po wysianiu hESC na podłoże wzorzyste. Co więcej, uzyskane mapy siły trakcyjnej można połączyć z tradycyjnymi testami, takimi jak barwienie immunologiczne, w celu zbadania, w jaki sposób rozkład sił generowanych przez komórki w zamkniętych koloniach hESC może regulować lub modulować dalszą sygnalizację. Spodziewamy się, że te metody ujawnią, że siły mechaniczne odgrywają kluczową rolę w kształtowaniu specyfikacji losu komórki podczas wczesnego rozwoju embrionalnego, który jest obecnie pomijany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody dotyczące stosowania hESC zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań nad Ludzkimi Gametami, Zarodkami i Komórkami Macierzystymi (GESCR) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.

1. Przygotowanie płytki krzemowej o cechach geometrycznych

  1. Utwórz fotomaskę z pożądanymi cechami geometrycznymi. Użyj oprogramowania do rysowania wspomaganego komputerowo, aby zaprojektować funkcje. W przypadku stosowania z fotorezystem negatywowym, cechy maski powinny być nieprzezroczyste, a pozostała część maski przezroczysta.
    UWAGA: W przypadku tworzenia wzorów na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 18 mm, należy pogrupować cechy dla każdego warunku eksperymentalnego w obszary o wymiarach 10 x 10 mm, aby upewnić się, że szablony wygenerowane w kroku 3 pasują do szkiełek nakrywkowych.
  2. Odwiruj ujemny fotorezyst na 100 mm płytce krzemowej. Skorzystaj z karty katalogowej fotorezystu, aby określić prędkość i długość wirowania, aby wygenerować grubość warstwy 100-250 μm.
    UWAGA: Grubość folii należy dostosować tak, aby proporcje szerokości wzorów do wysokości szablonu były jak najbardziej zbliżone do 1:1. Zalecamy jednak minimalną grubość 100 μm, ponieważ wszystko mniej tworzy delikatne szablony, które łatwo się rozrywają.
  3. Przetwarzaj fotorezystor zgodnie z kartą danych produktu. Zazwyczaj obejmuje to miękkie pieczenie, ekspozycję na promieniowanie UV z fotomaską w nakładce do maski, wypalanie po ekspozycji, wywoływanie i twarde pieczenie. Na przykład procedura stosowana do przetwarzania płytek używanych w tym protokole jest przedstawiona w tabeli 1.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z płytkami silikonowymi, ponieważ są one delikatne. Po wygenerowaniu wafle mogą być używane wielokrotnie, o ile nie są uszkodzone.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

  1. Przygotowanie "górnych" szkiełek nakrywkowych płukanych kwasem
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm o grubości #1 w szklanej szalce Petriego. Odpowiednia ilość szkiełek nakrywkowych zależy od wielkości naczynia. Na danie o średnicy 100 mm przygotuj jednorazowo 50-100 szkiełek nakrywkowych. Objętości podane w pozostałej części tej sekcji odpowiadają czaszy o średnicy 100 mm.
    2. Dodać 20 ml 1 M HCl do szalki Petriego i delikatnie potrząsnąć naczyniem, aby rozproszyć szkiełka nakrywkowe. Upewnij się, że wszystkie szkiełka nakrywkowe są zanurzone i wypuść pęcherzyki powietrza spomiędzy szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
      UWAGA: HCl jest kwaśny i. Zachowaj ostrożność i noś odpowiednie środki ochrony osobistej podczas pracy z HCl.
    3. Zdekantować HCl z naczynia. Dodaj 20 ml ultraczystej wody i myj delikatnym wstrząsem przez 10 min. Wylej wodę i powtórz w sumie pięć prań.
    4. Po wyrzuceniu ostatniego prania dodaj do naczynia 20 ml 100% etanolu. Za pomocą kleszczy usuń szkiełka nakrywkowe pojedynczo i ułóż między dwoma kawałkami bibuły filtracyjnej do wyschnięcia.
    5. Wysuszone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku. Szkiełka nakrywkowe myte kwasem można przygotować wcześniej i przechowywać przez miesiąc lub dłużej w warunkach bezpyłowych.
  2. Przygotowanie "dolnych" szkiełek nakrywkowych aktywowanych aldehydem glutarowym
    UWAGA: Zapoznaj się z poprzednimi metodami, aby uzyskać dodatkowe informacje7,9.
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm o grubości #1 na szalce Petriego.
    2. Dodać 20 ml 0,2 M HCl do szalki Petriego i delikatnie potrząsnąć naczyniem, aby rozproszyć szkiełka nakrywkowe. Upewnij się, że wszystkie szkiełka nakrywkowe są zanurzone i wypuść pęcherzyki powietrza spomiędzy szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    3. Zdekantować HCl z naczynia. Dodaj 20 ml ultraczystej wody i myj delikatnym wstrząsem przez 10 min. Wylej wodę i powtórz w sumie pięć prań.
    4. Po odrzuceniu ostatniego płukania dodać 20 ml 0,1 M NaOH i delikatnie wstrząsnąć, aby rozproszyć i zanurzyć szkiełka nakrywkowe. Inkubować w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę.
    5. Zdekantować NaOH z naczynia. Dodaj 20 ml ultraczystej wody i myj delikatnym wstrząsem przez 10 min. Wylej wodę i powtórz w sumie pięć prań.
    6. Po odrzuceniu ostatniego płukania dodać 20 ml rozcieńczenia 3-aminopropylotrimetoksysilanu w stosunku 1:200 w ultraczystej wodzie i delikatnie wstrząsnąć, aby rozproszyć i zanurzyć szkiełka nakrywkowe. Inkubować w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę lub przez noc.
      UWAGA: 3-aminopropylotrimetoksysilan jest łatwopalny i może powodować podrażnienie skóry. Obchodź się ostrożnie, noś odpowiednie środki ochrony osobistej i wyrzucaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji.
    7. Zdekantować rozcieńczony roztwór 3-aminopropylotrimetoksysilanu z naczynia. Dodaj 20 ml ultraczystej wody i myj delikatnym wstrząsem przez 10 min. Wylej wodę i powtórz w sumie co najmniej pięć prań. Bardzo ważne jest, aby usunąć cały 3-aminopropylotrimetoksysilan przed kontynuowaniem.
    8. Po odrzuceniu ostatniego płukania dodać 20 ml rozcieńczenia 70% aldehydu glutarowego w stosunku 1:140 do buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) i delikatnie wstrząsnąć, aby rozproszyć i zanurzyć szkiełka nakrywkowe. Inkubować w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę lub przez noc.
      UWAGA: 70% aldehydu glutarowego jest toksyczny i może powodować podrażnienia skóry. Obchodź się ostrożnie, noś odpowiednie środki ochrony osobistej i wyrzucaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji.
    9. Zdekantować rozcieńczony roztwór aldehydu glutarowego z naczynia. Dodaj 20 ml ultraczystej wody i myj delikatnym wstrząsem przez 10 min. Wylej wodę i powtórz w sumie pięć prań.
    10. Po odrzuceniu ostatniego prania dodaj 20 ml 100% etanolu. Za pomocą kleszczy usuń szkiełka nakrywkowe pojedynczo i ułóż między dwoma kawałkami bibuły filtracyjnej do wyschnięcia.
    11. Wysuszone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku. Szkiełka nakrywkowe aktywowane aldehydem glutarowym można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać do sześciu miesięcy.

3. Generowanie szablonów do tworzenia wzorów ligandów ECM

  1. Generowanie stempli pośrednich z polidimetylosiloksanu (PDMS)
    1. Wymieszać bazę PDMS z utwardzaczem PDMS w proporcji wagowej 10:1. Dokładnie wymieszaj.
      UWAGA: Do początkowej aplikacji PDMS przygotuj około 100 g PDMS, aby napełnić naczynie o średnicy 100 mm. W przypadku kolejnych aplikacji należy usunąć PDMS tylko ze środka naczynia, w którym znajdują się cechy płytki krzemowej i przygotować 20-30 g nowego PDMS.
    2. Mieszaninę PDMS należy odgazować w eksykatorze przez 30-60 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.
    3. Umieść zmodyfikowaną płytkę silikonową z kroku 1 w plastikowym naczyniu o średnicy 100 mm. Powoli i równomiernie wylej mieszaninę PDMS na powierzchnię płytki. Postukaj naczyniem o powierzchnię roboczą, aby uwolnić pęcherzyki powietrza z powierzchni wafla.
    4. Odgazować mieszaninę PDMS wylewaną na płytkę przez 10 minut lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte lub dotrą do powierzchni PDMS.
    5. Piecz PDMS w temperaturze 70 °C przez 2 godziny. Pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    6. Za pomocą skalpela lub noża do pudełek wytnij część PDMS ze środka naczynia, które zawiera cechy geometryczne.
    7. Pokrój PDMS na kwadraty o wymiarach około 10 x 10 mm, z których każdy zawiera cechy dla pojedynczego warunku eksperymentalnego. Są one określane jako "pieczęcie" w kolejnych krokach protokołu.
  2. Generowanie płaskich płyt PDMS
    1. Wymieszać bazę PDMS z utwardzaczem PDMS w proporcji wagowej 8:1. Przygotuj około 20 g na każde naczynie o średnicy 100 mm, które ma być użyte. Dokładnie wymieszaj.
    2. Mieszaninę PDMS należy odgazować w eksykatorze przez 30-60 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.
    3. Powoli i równomiernie wlej PDMS do czystego naczynia o średnicy 100 mm. Postukaj naczyniem o powierzchnię roboczą, aby uwolnić pęcherzyki powietrza.
    4. Piecz PDMS w temperaturze 70 °C przez 2 godziny. Pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    5. Wyjmij PDMS z naczynia. Odwróć tak, aby powierzchnia PDMS, która stykała się z dnem naczynia, była skierowana do góry.
    6. Dla każdego stempla wygenerowanego w kroku 3.1 wytnij kwadrat PDMS o wymiarach 15 x 15 mm. W kolejnych krokach protokołu określa się je mianem "płaskich płyt".
  3. Generowanie szablonów
    1. Ułóż płaskie płyty PDMS na pokrywie naczynia o średnicy 150 mm lub innej płaskiej powierzchni, aby ułatwić obsługę. Zapewnij wystarczające odstępy między płytami (np. dla naczynia 150 mm ułóż dziewięć płaskich płyt w równych odstępach).
    2. Odwróć każdy stempel wygenerowany w kroku 3.1 na płaską płytę PDMS, tak aby elementy stempla stykały się z płaską płytą PDMS. Delikatnie dociśnij górną część stempla kleszczami, aby zapewnić równomierny kontakt.
    3. Ostrożnie podeprzyj pokrywkę przytrzymującą parę stempla/płyty PDMS na podstawie naczynia, tak aby pokrywka spoczywała pod kątem. Pomaga to w odprowadzaniu wilgoci z polimeru utwardzanego promieniami UV w następnym etapie.
    4. Umieść małą kroplę polimeru utwardzanego promieniami UV na górnym styku każdej pary stempla/płyty. Polimer zostanie przeniknięty między nimi przez napięcie powierzchniowe, wspomagane grawitacją.
      UWAGA: W tym protokole może działać wiele różnych polimerów utwardzanych promieniami UV. Wybraliśmy klej optyczny Norland Optical Adhesive 74 ze względu na następujące właściwości: i) Szybkie utwardzanie po wystawieniu na działanie światła UV, ii) Łatwe usuwanie ze stempli PDMS po utwardzeniu, iii) Solidna przyczepność do szklanych szkiełek nakrywkowych przy ręcznym nacisku.
    5. Gdy polimer zostanie całkowicie przesiąknięty, umieść pokrywkę z parami stempli/płyt płasko na powierzchni roboczej. Umieść małą kroplę polimeru utwardzanego promieniami UV na każdej z pozostałych trzech stron każdej granicy faz stempla/płyty.
    6. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl połącz krople polimeru wokół krawędzi styku stempla/płyty. Spowoduje to utworzenie obramowania, które będzie zawierało roztwór liganda w kroku 4.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas pracy z polimerem wokół krawędzi stempla. Jeśli interfejs stempla/płyty zostanie zakłócony, polimer będzie przenikał pod elementami i szablon nie uformuje się prawidłowo.
    7. Ostrożnie umieść pary stempla/płyty w pudełku do sterylizacji UV. Użyj sterylnego ustawienia mocy "Str" i naświetlaj przez 10 minut.
    8. Wyjmij pary stempla/płyty z pudełka do sterylizacji UV. Za pomocą dwóch par kleszczy delikatnie usuń stempel PDMS, przytrzymując płaską płytę i szablon, które utworzyły się z polimeru utwardzanego promieniami UV.
    9. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń szablon i odwróć go tak, aby powierzchnia, która stykała się z płaską płytą PDMS, była skierowana do góry.
      UWAGA: Szablony są delikatne. Zachowaj ostrożność podczas ich przekazywania, zwłaszcza podczas początkowego wyjmowania ich z PDMS, aby się nie rozerwały.
    10. Umieść odwrócone szablony z powrotem w pudełku do sterylizacji UV. Użyj sterylnego ustawienia mocy "Str" i naświetlaj przez 3 minuty.

4. Wzór liganda ECM na szkiełkach nakrywkowych

  1. Prasowanie szablonów na szkiełka nakrywkowe płukane kwasem
    1. Umieść jedno szkiełko nakrywkowe umyte kwasem dla każdego szablonu na czystym kawałku folii laboratoryjnej.
    2. Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść każdy szablon, płaską stroną do dołu, na szkiełku nakrywkowym umytym kwasem. Umieść tak, aby elementy były wyśrodkowane na szkiełku nakrywkowym.
    3. Umieść mały kawałek filmu laboratoryjnego na każdym szablonie. Mocno i równomiernie dociśnij szablon, aby uzyskać silny kontakt między szablonem a szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: To jest krytyczny krok! Dociśnij mocno i na całej powierzchni szablonu. Jeśli nie zostanie utworzony wystarczający kontakt, roztwór liganda będzie przeciekał między szablonem a szkiełkami nakrywkowymi, a wzór zakończy się niepowodzeniem. OPCJONALNIE: Aby potwierdzić wystarczający kontakt między szablonem a szkiełkiem nakrywkowym, należy odpipetować 100 μl ultraczystej sterylnej wody na powierzchnię każdego szablonu i inkubować w temperaturze pokojowej. Po 1 godzinie sprawdź, czy nie ma wycieków. Odessać wodę z pomyślnie połączonych szablonów i kontynuować.
  2. Plazmowe czyszczenie powierzchni szablonowych szkiełek nakrywkowych w celu zwiększenia hydrofilowości
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe z szablonami w myjce plazmowej. Zastosuj plazmę o dużej mocy przez 30 s.
  3. Przygotowanie roztworu liganda ECM
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki powinny być wykonywane w sterylnych warunkach, jeśli to możliwe.
    1. Umieść sterylny 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 roztwór na lodzie. Po ostygnięciu dodaj matrigel i kolagen, aby uzyskać stężenia odpowiednio 225 μg/ml i 25 μg/ml. OPCJONALNIE: W celu rozwiązywania problemów lub wizualizacji liganda należy dołączyć fluorescencyjnie znakowany ligand do roztworu liganda.
      1. UWAGA: W tej metodzie można używać różnych ligandów ECM. W przypadku różnych ligandów może być wymagana dodatkowa optymalizacja w celu określenia idealnego stężenia, czasu inkubacji i temperatury inkubacji. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać więcej informacji.
    2. Odpipetować roztwór liganda na powierzchnię każdego szablonu. W przypadku szablonów wykonanych ze stempli kwadratowych o wymiarach 10 x 10 mm należy nałożyć 100 μl na szablon.
    3. Sprawdź, czy w elementach szablonu nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby użyj kleszczyków z cienką końcówką lub końcówki do pipety o pojemności 2 μl, aby usunąć pęcherzyki powietrza z funkcji.
      UWAGA: To jest krytyczny krok! Jeśli pęcherzyki powietrza pozostaną uwięzione na powierzchni szkiełka nakrywkowego, ligand nie będzie adsorbował się na powierzchni, a uzyskany wzór będzie niekompletny.
    4. Umieścić szkiełka nakrywkowe z ligandem w naczyniu, owinąć folią laboratoryjną i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.

5. Przeniesienie ligandu do żelu poliakrylamidowego

  1. Usuwanie roztworu liganda i szablonu z każdego szkiełka nakrywkowego
    1. Odessać roztwór liganda z powierzchni szablonu. Roztwór liganda można zbierać i przechowywać w temperaturze 4 °C i ponownie używać przez okres do miesiąca.
    2. Za pomocą kleszczy zanurz na krótko szkiełko nakrywkowe z szablonem w naczyniu zawierającym sterylny PBS do umycia.
    3. Na krótko zanurz szkiełko nakrywkowe z szablonem w drugim naczyniu ze sterylnym PBS do umycia.
    4. Usuń szablon z powierzchni szkiełka nakrywkowego. Uważaj, aby nie złamać szkiełka nakrywkowego.
    5. Na krótko zanurz szkiełko nakrywkowe w naczyniu zawierającym ultraczystą sterylną wodę, aby usunąć sole z płynów do płukania PBS. Postukaj w krawędź szkiełka nakrywkowego, aby delikatnie wytrzeć chusteczkę, aby usunąć nadmiar wody.
    6. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe w obojętnym gazie, takim jak azot. Zaznacz spód szkiełka nakrywkowego, aby śledzić orientację od tego punktu do przodu. Uważaj, aby wzorzysta strona była skierowana do góry.
    7. Powtórzyć kroki od 5.1.1 do 5.1.6 dla każdego szablonu szkiełka nakrywkowego.
  2. Wytwarzanie hydrożeli poliakrylamidowych z wzorzystymi szkiełkami nakrywkowymi
    UWAGA: Zapoznaj się z poprzednimi metodami, aby uzyskać dodatkowe informacje7,9 Wysterylizuj wszystkie uchwyty nakrętek, probówki i przekładki używane do produkcji żeli poliakrylamidowych, myjąc je 10% wybielaczem przez noc, spłukując wodą co najmniej pięć razy w celu usunięcia wybielacza i myjąc krótko w 70% etanolu. Umieść wszystkie kawałki na delikatnych chusteczkach w sterylnej szafce bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia przed użyciem.
    1. Przygotować roztwór poliakrylamidu w celu uzyskania pożądanej elastyczności hydrożelu (tab. 2). Wymieszać ze sobą wszystkie składniki z wyjątkiem mikrosfer fluorescencyjnych i nadsiarczanu potasu (PPS).
      UWAGA: Za każdym razem przygotuj 1% świeży roztwór nadsiarczanu potasu.
    2. Odgazować roztwór poliakrylamidu, mikrosfery i PPS w oddzielnych probówkach pod próżnią przez 30 minut.
    3. Dla każdego wzorzystego szkiełka nakrywkowego należy przygotować "dolne" szkiełko nakrywkowe aktywowane aldehydem glutarowym z przekładką (średnica zewnętrzna 18 mm, średnica wewnętrzna 14 mm) umieszczoną na górze.
    4. Po odgazowaniu należy krótko poddać sonikacji mikrosfer i dodać odpowiednią objętość do roztworu poliakrylamidu. Mieszać, pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Krótko sonicate.
    5. Dodać odpowiednią objętość PPS do roztworu poliakrylamidu. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać roztwór, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Po dodaniu PPS należy szybko wykonać kroki od 5.2.6 do 5.2.11 przed polimeryzacją poliakrylamidu.
    6. Odpipetować 75-150 μL (w zależności od grubości przekładki) do środka każdego szkiełka nakrywkowego aktywowanego aldehydem glutarowym.
    7. Za pomocą kleszczy umieść wzorzyste szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku nakrywkowym aktywowanym aldehydem glutarowym z poliakrylamidem i przekładką, tak aby wzorzysty ligand był skierowany w stronę roztworu poliakrylamidu. Jeśli dodano wystarczającą ilość roztworu poliakryloamidu, napięcie powierzchniowe przeniesie poliakrylamid między dwa szkiełka nakrywkowe i nie będzie żadnych pęcherzyków powietrza.
    8. Podnieś każdą "kanapkę" z poliakryloamidu i ostrożnie dotknij jej boku delikatną chusteczką, aby usunąć nadmiar roztworu poliakrylamidu.
    9. Ostrożnie umieść każdą "kanapkę" z poliakryloamidu w uchwycie z gwintem kompatybilnym z probówkami o stożkowym dnie o pojemności 15 ml. Orientacja powinna być taka, aby spód szkiełka nakrywkowego z aldehydu glutarowego stykał się z dolną częścią uchwytu nasadki, a wzorzyste szkiełko nakrywkowe znajdowało się na górze.
    10. Wkręć probówkę o pojemności 15 ml ze stożkowym dnem w każdy uchwyt nasadki, aby utrzymać "kanapki" z poliakrylamidu na miejscu. Rurki powinny być szczelne, aby zapobiec przeciekaniu, ale należy uważać, aby nie dokręcić zbyt mocno i nie pęknąć szkiełek nakrywkowych.
    11. Odwirować "kanapki" z poliakryloamidu w probówkach w wiaderkach wahadłowych o sile 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij probówki z wirówki i umieść je w stojakach na probówki, aby utrzymać orientację przez dodatkowe 50 minut, aby zapewnić pełną polimeryzację. Przechowywać przykryte folią, aby zapobiec blaknięciu mikrosfer fluorescencyjnych.
      UWAGA: Wirowanie ma kluczowe znaczenie w przypadku stosowania tej metody do wykonywania TFM. Siła odśrodkowa przesuwa wszystkie mikrosfery do jednej płaszczyzny, która ostatecznie znajdzie się tuż pod powierzchnią hydrożelu. Jest to idealne rozwiązanie do obrazowania przemieszczeń mikrosfery, które są wykorzystywane do obliczania naprężeń trakcyjnych generowanych przez komórki. Jeśli TFM nie jest wykonywany, mikrosfery można pominąć w roztworze poliakrylamidu, a polimeryzacja może zachodzić na stole bez wirowania.
    12. Wyjmij spolimeryzowane "kanapki" z poliakrylamidu z probówek i zanurz w PBS w naczyniu o średnicy 100 mm. Zawinąć w folię laboratoryjną i inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotowanie wzorzystych żeli do wysiewu komórek
    1. Użyj skalpela i kleszczyków, aby ostrożnie usunąć wzorzyste szkiełko nakrywkowe i przekładkę z "kanapki" z poliakryloamidu, gdy pozostaje ona zanurzona w PBS. Wzorzysty ligand zostanie przeniesiony do poliakrylamidu podczas polimeryzacji i pozostanie po usunięciu szkiełka nakrywkowego. Żel poliakryloamidowy pozostanie połączony ze szkiełkiem nakrywkowym aktywowanym aldehydem glutarowym.
      UWAGA: To jest krytyczny krok! Poliakryloamid musi być zanurzony w PBS podczas usuwania szkiełka nakrywkowego, w przeciwnym razie wzory ligandów zostaną zniszczone.
    2. Umieść każde szkiełko nakrywkowe z wzorzystym poliakrylamidem w uchwycie na nakrętki. Umieść uszczelkę (średnica zewnętrzna 18 mm, średnica wewnętrzna 14 mm) na wierzchu szkiełka nakrywkowego i wokół poliakrylamidu, gdzie znajdowała się przekładka. Wkręć odpiłowaną rurkę o stożkowym dnie 15 mm do uchwytu nasadki, tworząc zagłębienie z wzorzystym poliakrylamidem na dole. Zespoły te pasują do studzienek standardowej 12-dołkowej płyty, co ułatwia obsługę.
    3. Umyj każdy żel, dodając 500 μl PBS do zestawu studzienki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Usuń PBS i powtórz dwukrotnie, w sumie trzy prania.
    4. Po ostatnim przemyciu PBS dodać 500 μl pożywki z wybijanym DMEM do żeli i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Żele można przechowywać w temperaturze 37 °C z podłożem do 5 dni przed wysiewem komórek.
    5. Dzień przed wysiewem komórek wymienić knockout-DMEM na kompletne podłoże KSR i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

6. Hodowla hESC na wzorzystych żelach

UWAGA: Jeśli planujesz przygotować próbki do barwienia immunologicznego po TFM, zrób zdjęcia pozycji niepodciążonych mikrosfer przed wysiewem komórek. W takim przypadku w kroku 4.3.1 należy użyć liganda znakowanego fluorescencyjnie, aby ostateczne lokalizacje komórek były znane przed wysiewem i można było obrazować mikrosfery w tych regionach.

  1. Utrzymuj hodowle hESC i wtórne kultury wolne od karmienia przygotowane na płytkach pokrytych matryżelem w kondycjonowanym podłożu KSR przed wysiewem na wzorzystych żelach poliakrylamidowych, jak opisano wcześniej9.
    UWAGA: Generuj kondycjonowane pożywki KSR poprzez hodowlę napromieniowanych mysich fibroblastów embrionalnych w pożywce KSR uzupełnionej 4 ng / ml zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF). Zbieraj i wymieniaj nośniki co 24 godziny.
  2. Odessać pożywkę z hESC. Krótko umyć mediami knockout-DMEM. Dodać 0,05% trypsyny-EDTA uzupełnionej 10 μM Y27632 (inhibitor kinazy Rho) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
  3. Dodaj pożywkę z surowicą, aby zahamować trypsynę. Delikatnie zassać pożywkę i pipetę nad naczyniem, aby usunąć komórki. Kontynuuj delikatne pipetowanie, aby usunąć wszystkie komórki i rozdzielić klastry komórek na pojedyncze komórki.
  4. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w równoważnej objętości pożywki KSR do przemycia. Wirować przy 200 x g przez 3 min.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w kondycjonowanym pożywce KSR uzupełnionej 10 ng/ml bFGF i 10 μM Y27632.
  7. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj zawiesinę komórek do stężenia 300 000 komórek na ml. Odpipetować 500 μl zawiesiny komórek na każdy wzorzysty żel (150 000 komórek na żel).
  8. 3 godziny po wysianiu ostrożnie odessać pożywkę z każdego żelu za pomocą pipety i zastąpić ją świeżo kondycjonowaną pożywką KSR uzupełnioną 10 ng/ml bFGF i 10 μM Y27632. Usuwa to nadmiar komórek, które nie przylegały do wzorzystych obszarów poliakrylamidu.
    UWAGA: To jest krytyczny krok! Na tym etapie komórki będą luźno przylegające do wzorzystego liganda. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wymiany nośników, aby nie odłączyć ogniw. W kolejnych krokach należy zachować równą ostrożność przy każdej z wymian nośników.
  9. 24 godziny po wysiewie za pomocą pipety ostrożnie zassać pożywkę i wymienić na kondycjonowaną pożywkę KSR uzupełnioną 10 ng/ml bFGF i 5 μM Y27632.
  10. Po 48 godzinach od wysiewu za pomocą pipety ostrożnie zassać pożywkę i wymienić ją na kondycjonowaną pożywkę KSR uzupełnioną 10 ng/ml bFGF. Spowoduje to usunięcie inhibitora kinazy Rho z pożywki i eksperymenty można rozpocząć następnego dnia, 72 godziny po wysiewie.

7. Wykonywanie TFM

  1. W razie potrzeby wykonaj TFM zgodnie z wcześniejszym opisem9 w żądanych warunkach eksperymentalnych.
  2. Jeśli nienaprężone pozycje mikrosfer zostały zobrazowane przed wysiewem komórek, utrwal komórki po zajęciu zestresowanych pozycji mikrosfery i wykonaj barwienie immunologiczne w celu określenia lokalizacji interesujących białek w stosunku do regionów o wysokich i niskich siłach pociągowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym wyzwaniem do pokonania przy próbie hodowli hESC w koloniach o kontrolowanej geometrii na zgodnych podłożach jest wygenerowanie jednorodnego wzoru ligandu ECM na powierzchni substratu. Strategia przedstawiona w tej metodzie polega najpierw na wygenerowaniu pożądanego wzoru na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego, a następnie przeniesieniu tego wzoru na powierzchnię hydrożelu poliakrylamidowego podczas polimeryzacji żelu (Rysunek 1A). Dlat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uprościć długi i szczegółowy protokół, metoda ta składa się z trzech krytycznych etapów: 1) generowania wzorów liganda ECM na szklanych szkiełkach nakrywkowych, 2) przenoszenia wzorów do hydrożeli poliakrylamidowych podczas polimeryzacji żelu oraz 3) wysiewu hESC na wzorzystym hydrożelu. Istnieją krytyczne kroki, które należy wziąć pod uwagę na każdym z tych trzech etapów. W celu wygenerowania wzorów o wysokiej wierności na szklanych szkiełkach nakrywkowych, szablon musi być mocno dociśnięty do szkiełka nakrywkowego,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za dofinansowanie z grantu CIRM RB5-07409. J.M.M. chciałby podziękować FuiBoon Kai, Dhruv Thakar i Roger Oria za różne dyskusje, które doprowadziły do powstania i rozwiązywania problemów z tą metodą. J.M.M. dziękuje również UCSF Discovery Fellowship za nieustające wsparcie jego pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% TrypsynaGibco25300054
100 mm szklana szalka PetriegoFisher Scientific08-747B
Plastikowa szalka Petriego 100 mmFisher Scientific FB0875712
150 mm plastikowa szalka PetriegoFisher ScientificFB0875714
18 mm średnica #1 szkiełka nakrywkoweThermo Scientific18CIR-1
2% bisakryloamidBio-Rad161-0142
3-aminopropylotrimetoksysilanACROS Organics313251000
40% akryloamidBio-Rad161-0140
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-100
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówSigma-AldrichF0291
WybielaczCloroxN/A
obrotowymiEppendorf22623508Model: 5804 R
CollagenCorning354236
DessicatorFisher Scientific08-642-7
EtanolFisher ScientificAC615095000
Płod Surowica bydlęcaGibco16000044
Mikrosfery fluorescencyjneThermo ScientificF8821
Kleszcze (do szkiełek nakrywkowych)Fisher Scientific16-100-122
Kleszcze (do wafli)Fisher Scientific17-467-328
Uchwyty na żelN/AN/AUchwyty żelowe są drukowane na zamówienie w 3D, rysunek CAD dostępny na życzenie
Aldehyd glutarowyFisher Scientific50-261-94
HEPESThermo ScientificJ16926A1
Płyta grzejnaFisher ScientificHP88854100
Kwas solnyFisher ScientificA144S-500
Alkohol izopropylowyFisher ScientificA416-500
Kimwipes (delikatne chusteczki do zadań)Kimberly-Clark Professional34120
Knockout-DMEMGibco10829018
Nakładka na maskę (do fotolitografii)Karl Suss America, Inc.Karl Suss MJB3 Mask Aligner
MatrigelCorning354277
Mikroskop do pomiaru siły pociągowejNikonN/AModel: Eclipse TE200 U
Zmotoryzowany stolik pozycjonowaniaPrior ScientificN/AModel: HLD117
Azot gazowyAirgas NI 250
Norland Klej optyczny 74 (polimer utwardzany promieniami UV)Norland ProduktyNOA 74
PiekarnikThermo Scientific PR305225G
Parafilm (folia laboratoryjna)Fisher Scientific13-374-12
PDMS (Sylgard 184)Fisher ScientificNC9285739
PhotomaskCAD/Art Services, Inc.Maski fotograficzne N/Asą wykonywane na zamówienie. Rysunek CAD dla naszych projektów dostępny na życzenie
Myjka plazmowaFisher ScientificNC9332171
Tworzywo sztuczne do uszczelkiMarian ChicagoHT6135
Tworzywo sztuczne do przekładkiTAP Tworzywasztuczne Nie dotyczyArkusz poliwęglanowy, grubość 01 cala
Chlorek potasu (do produkcji PBS)Fisher ScientificP217-500
Fosforan potasu jednozasadowy (do wytwarzania PBS)Fisher ScientificP285-500
Nadsiarczan potasuACROS Organics424185000
SkalpelFisher Scientific14-840-00
Mikroskopia elektronowawafla krzemowa71893-06Typ P, 3 cale, wafle krzemowe
Chlorek sodu (do produkcji PBS)Fisher ScientificS271-1
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-100
Fosforan sodu dwuwodny (do produkcji PBS)Fisher ScientificS472-500
SU8-3050 FotorezystorMicroChemSU8-3000
SU8-DeveloperMicroChemY020100
TEMEDBio-Rad161-0800
Pudełko do sterylizacji UVBio-RadN/ABio-Rad GS Gene Linker Komora UV
Y27632 (inhibitor kinazy Rho)StemCell Technologies72304
15 ml probówki ze stożkowym dnem Corning 352095 Wirówka z wiadrami Zamiennik serum do nokautowania Gibco 10828028 Sciences

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
  4. Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001(2017).
  5. Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
  6. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  7. Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
  8. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  9. Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
  10. Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
  11. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
  12. Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
  13. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
  16. Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Human Embryonic Stem CellsPolyacrylamide HydrogelsTraction Force MicroscopyColony Geometry ControlCompliant SubstratesExtracellular Matrix PatterningPDMS Stencil FabricationFluorescent Ligand TransferCell Fate SpecificationMechanical Cues Analysis

Powiązane artykuły