Method Article

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

DOI:

10.3791/60335

⸱

November 19th, 2019

 ,  ,  , 
1Dana-Farber/Boston Children's Cancer and Blood Disorders Center, 2Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek pobranych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania lub scharakteryzowania czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych lub do ilościowego określenia zakresu celowania w komórki po podaniu in vivo wektorów wirusowych lub nanocząstek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy w dziedzinie wektorów wirusowych i nanomateriałów otworzyły drogę dla nowych, nowatorskich podejść do badania lub manipulowania ośrodkowym układem nerwowym (OUN). Jednak dalsza optymalizacja tych technologii przyniosłaby korzyści dzięki metodom umożliwiającym szybkie i sprawne określenie zakresu celowania w OUN i komórkę po podaniu wektorów wirusowych lub nanocząstek w organizmie. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który wykorzystuje wysoką przepustowość i możliwości multipleksowania cytometrii przepływowej, aby umożliwić prostą kwantyfikację różnych podtypów komórek wyizolowanych z mózgu lub rdzenia kręgowego myszy, a mianowicie mikrogleju / makrofagów, limfocytów, astrocytów, oligodendrocytów, neuronów i komórek śródbłonka. Stosujemy to podejście, aby podkreślić krytyczne różnice między dwiema metodami homogenizacji tkanek pod względem wydajności, żywotności i składu komórek. Może to poinstruować użytkownika, aby wybrał najlepszą metodę w zależności od interesującego typu komórki i konkretnego zastosowania. Metoda ta nie nadaje się do analizy rozmieszczenia anatomicznego, ponieważ tkanka jest homogenizowana w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Pozwala jednak na pracę z żywotnymi komórkami i może być łączona z sortowaniem komórek, otwierając drogę do kilku zastosowań, które mogą rozszerzyć repertuar narzędzi w rękach neurobiologa, począwszy od ustanawiania kultur pierwotnych pochodzących z czystych populacji komórek, po analizy ekspresji genów i testy biochemiczne lub funkcjonalne na dobrze zdefiniowanych podtypach komórek w kontekście chorób neurodegeneracyjnych. po leczeniu farmakologicznym lub terapii genowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie dostarczania genów i leków (takie jak wektory wirusowe i nanocząsteczki) stały się potężnym narzędziem, które można zastosować do uzyskania lepszego wglądu w specyficzne szlaki molekularne zmienione w chorobach neurodegeneracyjnych oraz do rozwoju innowacyjnych podejść terapeutycznych1,2,3. Optymalizacja tych narzędzi opiera się na ilościowym określeniu: (1) zakresu penetracji OUN przy różnych drogach podania oraz (2) ukierunkowania na określone populacje komórek. Analizy histologiczne są zwykle stosowane do wizualizacji fluorescencyjnych genów reporterowych lub f....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Instytutu Raka Dana Farber (numer protokołu 16-024).

1. Przygotowanie roztworów potrzebnych do eksperymentu

  1. Przygotuj 1x zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), rozcieńczając 10x HBSS sterylną wodą. Wstępnie schłodzić roztwór na lodzie. Na każdą próbkę potrzeba co najmniej 25 ml roztworu.
  2. Przygotować izotoniczny roztwór Percollu (IPS) mieszając 10x sterylny HBSS 1:10 z podłożem o gradiencie gęstości (tj. Percoll). Wstępne schładzanie na lodzie.
    UWAGA: IPS może być przechowywany do 30 dni w ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównaliśmy dwie różne metody homogenizacji (DH kontra PD) zastosowane do mózgu i rdzenia kręgowego myszy, aby przetestować skuteczność w odzyskiwaniu różnych typów żywotnych komórek odpowiednich do dalszych zastosowań. W tym celu wykorzystaliśmy 9-kolorowy panel cytometrii przepływowej przeznaczony do scharakteryzowania w tej samej próbce różnych typów komórek OUN, w tym mikrogleju, limfocytów, neuronów, astrocytów, oligodendrocytów i śródbłonka.

Tkanki mózgu i rdzenia kręgowego zostały pobr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule opisano protokół współoczyszczania i jednoczesnej analizy cytometrycznej przepływu niektórych z najważniejszych komórek OUN z mózgu myszy i rdzenia kręgowego. Tradycyjnie, analizy histologiczne były stosowane w celu opisania rozmieszczenia nanocząstek lub skuteczności transdukcji wektorów wirusowych w OUN 5,13 lub w celu uzyskania wglądu w zmiany morfologiczne i molekularne zachodzące w określonych typach komórek podczas patologii lub leczen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez fundusze startowe Boston Children's Hospital dla A.B., grant ALSA nr 17-IIP-343 dla M.P., oraz Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia poprzez Program Badań nad Stwardnieniem Zanikowym Bocznym pod Nagrodą nr W81XWH-17-1-0036 dla M.P. Dziękujemy DFCI Flow Cytometry Core za wsparcie techniczne.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (bez wapnia, chlorku magnezu i siarczanu magnezu)Gibco14185-052
70 mm Sitko do komórekCorning431751
Przeciwciało przeciw myszom ACSA/ACSA2Miltenyi Biotec130-117-535APC sprzężona
albumina surowicy bydlęcejSigmaAldrich A9647-1KG
CD11b szczurze przeciwciałoanty-mysieInvitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 sprzężone
szczurze przeciwciało anty-mysie CD31BD Bioscience562939BV421 sprzężone
szczurze przeciwciało anty-mysie CD45Biolegend103138Brilliant Violet 510 sprzężone
CD90.1/Thy1.1 szczurze przeciwciało anty-mysieBiolegend202518PE/Cy7 sprzężone
CD90.2/Thy1.2 szczurze przeciwciałoanty-myszyProbówkisprzężone Biolegend 1005325 PE/Cy7
(15 ml)Probówki229411
(50 ml)CellTreat229422
Dounce (zawiera moździerz oraz tłuczki A i B)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Blokowe przeciwciało anty-mysie szczuraBD Pharmingen553142
Płodowa surowica bydlęcaBenchmark100-106
Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 przeciwciało przeciw myszy/szczurom/ludziomMiltenyi Biotec130-095-895Sprzężony z biotyną
PercollGE Healthcare10266569sprzedawany jako niesterylny odczynnik
PercollSigma65455529odczynnik sterylny (do stosowania w zastosowaniach wymagających sterylności)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01zawierający bardzo mało śladowych ilości endotoksyny
StreptavidinInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 sprzężony
stożkowe stożkowe CellTreat Zestaw młynka do tkanek Odczynnik

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryCell IsolationTissue HomogenizationMouse BrainSpinal CordCell ViabilityCell YieldEnzymatic DigestionAntibody StainingCell Sorting

Related Articles