Method Article

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

DOI:

10.3791/60339

⸱

December 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dartmouth College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO jest białkiem rusztowania, które odgrywa istotną rolę w szlaku NF-κB poprzez składanie kompleksu IKK z kinazami IKKα i IKKβ. Po aktywacji kompleks IKK fosforyluje cząsteczki IκB, prowadząc do translokacji jądrowej NF-κB i aktywacji docelowych genów. Hamowanie interakcji NEMO/IKK jest atrakcyjnym paradygmatem terapeutycznym do modulacji aktywności szlaku NF-κB, co sprawia, że NEMO jest celem do projektowania i odkrywania inhibitorów. Aby ułatwić proces odkrywania i optymalizacji inhibitorów NEMO, opracowaliśmy ulepszoną konstrukcję domeny wiążącej IKK NEMO, która pozwoliłaby na określenie struktury białka w postaci apo i podczas wiązania z inhibitorami o małej masie cząsteczkowej. W tym miejscu przedstawiamy strategię zastosowaną do projektowania, wyrażania i charakterystyki strukturalnej domeny wiązania IKK w NEMO. Białko ulega ekspresji w komórkach E. coli, rozpuszczanych w warunkach denaturacji i oczyszczanych w trzech etapach chromatograficznych. Omawiamy protokoły otrzymywania kryształów do wyznaczania struktury oraz opisujemy strategie pozyskiwania i analizy danych. Protokoły znajdą szerokie zastosowanie w określaniu struktury kompleksów NEMO i inhibitorów małocząsteczkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szlak NF-κB jest aktywowany w odpowiedzi na różne bodźce, w tym cytokiny, produkty mikrobiologiczne i stres, w celu regulacji ekspresji docelowych genów odpowiedzialnych za reakcję zapalną i immunologiczną, śmierć komórki lub przeżycie i proliferację1. Patologie, w tym choroby zapalne i autoimmunologiczne oraz nowotwory2,3,4,5 zostały skorelowane z hiperaktywacją szlaku, co sprawiło, że modulacja aktywności NF-κB stała się głównym celem dla rozwoju nowych terapii6,7.

Kanoniczny szlak NF-κB w szczególności różni się od szlaku niekanonicznego, odpowiedzialnego za limorganogenezę i aktywację komórek B, przez zależność tego pierwszego od białka rusztowania NEMO (niezbędny modulator NF-κB8) do składania kompleksu IKK z kinazami IKKα i IKKβ. Kompleks IKK jest odpowiedzialny za fosforylację IκBα (inhibitora κB), która kieruje go do degradacji, uwalniając dimery NF-κB do translokacji do jądra w celu transkrypcji genu1 i dlatego jest atrakcyjnym celem dla rozwoju inhibitorów modulujących aktywność NF-κB.

Nasze badania koncentrują się na charakterystyce interakcji białko-białko pomiędzy NEMO i IKKβ, celując w NEMO w celu opracowania małych cząsteczek inhibitorów tworzenia kompleksu IKK. Minimalna domena wiążąca NEMO, wymagana do wiązania IKKβ, obejmuje reszty 44-111, a jej struktura została określona w kompleksie z peptydem odpowiadającym sekwencji IKKβ 701-7459. NEMO i IKKβ tworzą wiązkę czterech helis, w której dimer NEMO mieści dwie helisy IKKβ (701-745) w wydłużonym otwartym rowku z rozszerzonym interfejsem interakcji. IKKβ(734-742), znana również jako domena wiążąca NEMO (NBD), określa najważniejszy gorący punkt wiązania, w którym dwa niezbędne tryptofany (739,741) zakopują się głęboko w kieszeni NEMO. Szczegóły złożonej struktury mogą pomóc w projektowaniu i optymalizacji inhibitorów małocząsteczkowych ukierunkowanych na NEMO. Jednocześnie trudno jest, aby wiązanie małej cząsteczki lub peptydu odtworzyło w NEMO pełną zmianę konformacyjną (tj. rozległe otwarcie dimera zwiniętej cewki NEMO) spowodowaną wiązaniem długiego IKKβ (701-745), jak obserwowano w krysztale, a struktura niezwiązanego NEMO lub NEMO związanego z inhibitorem małej cząsteczki może stanowić lepszy cel dla projektowania leków opartych na strukturze i optymalizacji inhibitorów.

Pełne konstrukcje NEMO i mniejsze konstrukcje obcinające obejmujące domenę wiążącą IKK okazały się trudne do określenia struktury w formie niezwiązanej za pomocą krystalografii rentgenowskiej i metod magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)10, co skłoniło nas do zaprojektowania ulepszonej wersji domeny wiążącej IKK NEMO. Rzeczywiście, NEMO (44-111) w postaci niezwiązanej jest tylko częściowo pofałdowany i ulega wymianie konformacyjnej, dlatego postanowiliśmy ustabilizować jego dimeryczną strukturę, fałd zwiniętego zwoju i stabilność, zachowując przy tym powinowactwo wiązania do IKKβ. Dołączając trzy heptady idealnych dimerycznych sekwencji zwiniętych cewek11 na końcach N i C białka oraz serię czterech mutacji punktowych, wygenerowaliśmy NEMO-EEAA, konstrukt w pełni dimeryczny i złożony w zwiniętą cewkę, który uratował powinowactwo wiązania IKK do zakresu nanomolowego, jak obserwowano dla pełnej długości NEMO12. Jako dodatkową zaletę mieliśmy nadzieję, że adaptery ze zwiniętą cewką (oparte na sekwencji GCN4) ułatwią krystalizację i ostatecznie pomogą w określeniu struktury promieniowania rentgenowskiego poprzez wymianę molekularną. Adaptery ze zwiniętymi cewkami zostały podobnie wykorzystane zarówno do zwiększenia stabilności, poprawy zachowania roztworu, jak i ułatwienia krystalizacji zwiniętych cewek trimerycznych i fragmentów przeciwciał13,14. NEMO-EEAA łatwo ulega ekspresji i oczyszczaniu z Escherichia. komórki coli z rozszczepialnym znacznikiem histydyny, są rozpuszczalne, złożone w stabilną dimeryczną zwiniętą cewkę i łatwo krystalizują, z dyfrakcją do 1,9 A. Obecność uporządkowanych regionów zwiniętych cewek GCN4 może dodatkowo pomóc w fazowaniu danych z kryształów NEMO-EEAA poprzez wymianę molekularną przy użyciu znanej struktury GCN415.

Biorąc pod uwagę wyniki uzyskane za pomocą apo-NEMO-EEAA, uważamy, że opisane tutaj protokoły mogą być również zastosowane do krystalizacji NEMO-EEAA w obecności małych peptydów (takich jak peptyd NBD) lub inhibitorów małych cząsteczek, w celu zrozumienia wymagań dotyczących inhibicji NEMO i optymalizacji opartej na strukturze początkowych inhibitorów ołowiu do wysokiego powinowactwa. Biorąc pod uwagę plastyczność i dynamiczną naturę wielu domen zwojów zwojów16, zastosowanie adapterów zwojów może znaleźć bardziej ogólne zastosowanie w określaniu struktury.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt konstrukcji do krystalografii

  1. Sklonuj sekwencję NEMO-EEAA, jak w poprzedniej publikacji12 w wektorze do ekspresji w E. coli, używając promotora T7, w tym N-końcowego znacznika heksa-histydyny i miejsca rozszczepienia proteazy.
    UWAGA: W tym protokole użyliśmy wektora zmodyfikowanego tak, aby zawierał N-końcowy znacznik heksa-histydyny i miejsce rozszczepienia wirusa wytrawiania tytoniu (TEV)10. Wektor ten ułatwia rozszczepienie znacznika He w celu krystalizacji białka i pozostawia tylko krótkie wydłużenie reszt GSW przed rozpoczęciem pożądanej sekwencji białka. Wektor, z którego to wyprowadzono, oraz wektory alternatywne są wymienione w Tabeli materiałów. W tym protokole kolejne modyfikacje oryginalnej sekwencji NEMO(44-111) były wprowadzane stopniowo, jak opisano wcześniej10, przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej po stronie. Początkowo próbowaliśmy ustabilizować dimer cewki spiralnej NEMO, dołączając idealne adaptery cewki spiralnej (o długości co najmniej trzech heptadów) do końca N-końcowego lub C-końcowego lub do obu. Podwójnie zwinięta cewka była najbardziej obiecująca z wcześniejszych prób krystalizacji, a następnie została zmodyfikowana, wprowadzając mutacje w celu poprawy krystalizacji, jak opisano wcześniej12.

2. Wielkoskalowa ekspresja Jego6 oznaczonych NEMO-EEAA

  1. Przekształć konstrukt w kompetentne komórki BL21(DE3). Przechowywać w temperaturze -80 °C jako zapas glicerolu komórkowego.
  2. Dzień 1 - Przygotuj komórkową kulturę starterową. Do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml dodaj 20 ml roztworu Terrific Bulth i 20 μl 100 mg/ml preparatu ampicyliny. Dodać kilka mikrolitrów zapasu glicerolu komórkowego (z -80 °C przechowywanie kompetentnych komórek BL21(DE3) przekształconych wektorem).
  3. Wstrząsnąć 10 ml kultury starterowej przez noc w temperaturze 37 °C, 220 obr./min (około 15 godzin).
  4. Dzień 2 - Z zaczynu rozcieńczyć do OD600 = 0,1 w 250 ml Terrific Broth. Dodać ampicylinę do końcowego stężenia 100 μg/ml. Osiągnij OD600 = 0,8-1,0.
    1. Dodać β-D-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG) do 500 μM i rosnąć przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Zmierz OD600 indukowanej kultury po 4 godzinach. Kultura powinna osiągnąć OD600 = 6-10.

3. Oczyszczanie Jego6 oznaczonych NEMO-EEAA

  1. Wirować kulturę komórkową w temperaturze 3 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Zachowaj osad komórkowy i wyrzuć pożywkę.
    UWAGA: W tym momencie osad komórkowy można zapisać i przechowywać w temperaturze -20 °C, w celu oczyszczenia w późniejszym czasie.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 40 ml buforu do lizy zawierającego 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolu, 2 mM MgCl2, 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 2 mM ditiotreitolu (DTT) i 3 μl nukleazy benzonazy.
    UWAGA: Zastosowana kolumna do chromatografii powinowactwa jonów metali immobilizowanych niklem (IMAC) jest kompatybilna z 2 mM DTT. Alternatywnie można zastosować 0,2 mM tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP).
  4. Podziel zawieszone komórki na dwie podwielokrotności o pojemności 20-25 ml.
  5. Lizować komórki za pomocą prasy francuskiej (przybliżone ciśnienie 25 000 psi), powtarzając 2-3 razy dla każdej podwielokrotności (w chłodni).
    UWAGA: Alternatywnie, komórki mogą być poddawane lizie za pomocą sonikacji (nie testowane w tym protokole).
  6. Dodać mocznik do lizatu komórkowego do końcowego stężenia 8 M, pozostawić do inkubacji na platformie bujanej przez co najmniej 2 godziny lub do nocy. Ten i wszystkie kolejne etapy oczyszczania, z wyjątkiem dializy, można przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
  7. Dzień 3 - Przenieś lizat do probówek ultrawirówek i zrównoważ wagę, upewniając się, że lizat wypełnia probówki do co najmniej 3/4 wysokości. Wirować lizat w temperaturze 125 000 x g przez 45 minut w temperaturze 25 °C. Zdekantować supernatant do zlewki o pojemności 100 ml w celu załadowania do kolumny.
    UWAGA: Wirowanie w temperaturze 4 °C spowoduje wylanie się mocznika.
  8. W systemie szybkiej chromatografii cieczowej usunąć etanol z kolumny IMAC 5 ml z 25 ml ultraczystegoH2Oo o stężeniu 5 ml/min, a następnie 25 ml buforu elucyjnego zawierającego 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazolu, 2 mM DTT, pH 8,0, a następnie 25 ml buforu wiążącego zawierającego 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM DTT, 8 M mocznik, pH 8,0.
  9. Załadować supernatant inkubowany mocznikiem w ilości 3 ml/min do kolumny IMAC, zbierając przepływ. Przemyć kolumnę na 10 objętości kolumny buforem wiążącym o stężeniu 3 ml/min.
  10. Ponownie zawinąć konstrukt NEMO-EOAA na kolumnie, przemłukując kolumnę buforem do ponownego składania na 20 objętości kolumny przy 3 ml/min, zawierającej 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolu, 2 mM DTT, pH 8,0.
  11. Przeprowadzić elucję gradientową NEMO-EEAA, od 10 do 500 mM Imidazolu w 12-kolumnowym gradiencie objętościowym, zbierając cały eluat na płytce do zbierania frakcji (frakcje 1 ml).
  12. Kontynuować elucję przy 500 mM imidazolu przez dwie objętości kolumny, kontynuując zbieranie.
  13. Uruchomić elektroforezę frakcji dodecylosiarczanu sodu (SDS) - żelu poliakrylamidowego (PAGE) w celu określenia obecności NEMO-EEAA we frakcjach elucyjnych.
    UWAGA: Użyliśmy 10% akrylamidu, bufora MES.
  14. Frakcje puli zawierające czyste białko docelowe.
  15. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda17.
    UWAGA: Jest to konieczne do oszacowania ilości proteazy do rozszczepienia znacznika.

4. Jego6 tagów rozszczepienia i oczyszczenia

  1. Dodaj TEV w stosunku wagowym 1:10 białka TEV:NEMO-EEAA, aby rozszczepić znacznik His6. Proteaza TEV została oczyszczona w domu.
    UWAGA: Zoptymalizuj osobno ilość TEV, czas i temperaturę wymagane do całkowitego rozszczepienia.
    1. Ekspresja proteazy TEV, mut18 w komórkach BL21 (DE3) -RIL i oczyść zgodnie z wcześniejszym opisem < klasa sup = "xref">19. Krótko wyhoduj komórki zgodnie z opisem w kroku 2, poddaj lizie za pomocą prasy francuskiej i oczyść za pomocą kolumny IMAC. Białko końcowe należy przechowywać w 25 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v glicerolu.
  2. Próbkę należy dializować przez noc (około 15 godzin) w 4 l 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0, aby umożliwić rozszczepienie i usunąć nadmiar imidazolu z próbki w celu późniejszego oczyszczenia.
  3. Dzień 4 – Pobranie próbki z dializy. Uruchom żel SDS-PAGE z próbki z rozszczepienia TEV, aby upewnić się, że rozszczepienie zostało zakończone.
  4. W systemie szybkiej chromatografii cieczowej usunąć etanol z kolumny IMAC o pojemności 5 ml z 25 ml ultraczystegoH2Oo o stężeniu 5 ml/min, a następnie 25 ml buforu elucyjnego zawierającego 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazolu, 2 mM DTT, pH 8,0, a następnie bufor wiążący zawierający 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolu, 2 mM DTT, pH 8,0.
  5. Załadować kolumnę z prędkością 1 ml/min za pomocą NEMO-EEAA z rozszczepieniem TEV. Rozszczepiony NEMO-EEAA wymywa się w przepływie: zebrać w 96-dołkowej płytce zbiorczej frakcji (frakcje 1 ml). Przemyć kolumnę na pięć objętości kolumny po 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolu w stężeniu 1 ml/min, kontynuując zbieranie na płytce do zbierania frakcji.
  6. Elute TEV i rozszczepił Jego 6-NEMO-EEAA z trzema objętościami kolumn po 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazolu, 2 mM DTT, pH 8,0, zbierając elucję w kolbie o pojemności 50 ml.
  7. Uruchomić SDS-PAGE żel frakcji przepływowych w celu określenia obecności rozszczepionego NEMO-EEAA.
  8. Zebrać frakcje przepływowe zawierające rozszczepiony konstrukt NEMO-EEAA i skoncentrować za pomocą koncentratora z mieszanymi komórkami do 5 ml. Odcięcie masy cząsteczkowej membrany (MWCO) = 3 kDa.
  9. Używając membrany MWCO o stężeniu 3 kDa, dializuj zagęszczoną próbkę w 2 l 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0 przez 2 godziny. Zmień bufor dializacyjny na 2 l świeżego buforu dializacyjnego do dializ nocnej (około 15 godzin), w temperaturze 4 °C.
  10. Dzień 5 - Załadować 5 ml dializowanej próbki do chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) kolumna 16 mm x 60 cm (średnia wielkość cząstek 34 μm) przy 1 ml/min w 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0. Powtórzyć z dodatkowymi kolumnami w zależności od objętości próbki.
  11. Zbierz frakcje odpowiadające dimerycznemu NEMO-EEAA.
    UWAGA: NEMO-EEAA eluuje od 60 do 65 ml, co odpowiada białku o większej masie cząsteczkowej, ze względu na wydłużony charakter dimerycznej zwiniętej cewki.
  12. Zagęścić za pomocą koncentratora z mieszanymi komórkami i membrany MWCO = 3 kDa do końcowego stężenia 113 μM (1,65 mg/ml).
  13. Porcjować białko i przechowywać w temperaturze 4 °C (stabilnie przez ponad 1 miesiąc).

5. Rzadkie ekranowanie matrycowe

UWAGA: Protokół przeprowadza próby krystalizacji przy użyciu dostępnych na rynku ekranów i przeprowadza eksperymenty z opadaniem w pozycji siedzącej za pomocą robota krystalizującego. Obrazy kryształowe są zbierane automatycznie przez imager.

  1. Korzystając z dostępnych w handlu sit o rzadkiej matrycy (patrz tabela materiałów), należy odpipetować 60 μl rzadkiego roztworu matrycowego do każdej z 96 studzienek 2-komorowej płytki krystalizacyjnej w celu dyfuzji par w kroplach osadzających (roztwór zbiornikowy).
  2. Za pomocą zrobotyzowanego urządzenia do ustawiania kropli dozować 100 nl roztworu białkowego o stężeniu 1,65 mg/ml w stosunku 1:1 z roztworem zbiornikowym w kropli 1 dla końcowej objętości 200 nL; następnie 66 nl roztworu białkowego ze 134 nL roztworu rezerwuarowego dla końcowej objętości 200 nL w kropli 2 (stosunek 1:2).
  3. Uszczelnij płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej o szerokości 3 cali natychmiast po dozowaniu.
    UWAGA: Krople wyschną, jeśli zostaną wystawione na działanie atmosfery dłużej niż 2-3 minuty.
  4. Przechowuj tace w magazynie imagera krystalizacyjnego w temperaturze 20 °C, sprawdzając automatycznie zebrane obrazy pod kątem obecności kryształów, począwszy od dwóch dni.
    UWAGA: Badanie przesiewowe krystalizacji przebiegało równolegle z optymalizacją konstrukcji. Początkowe kryształy powstałe w następujących warunkach (ekrany handlowe wymienione w Tabeli Materiałów): a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30 % v/v glikol polietylenowy (PEG) MME 550, 5% kwas poli-γ-glutaminowy, polimer niskocząsteczkowy 200-400 kDa (PGA -LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Rzadkie kryształy ekranu matrycowego będą miały słabą jednorodność sieci; Dlatego będą wyglądać słabo przy użyciu obrazowania spolaryzowanego krzyżowo. Użyj obrazowania UV, aby upewnić się, że kryształy zawierają białko. Następujący etap generowania materiału siewnego jest niezbędny do uzyskania końcowej jakości kryształów o jakości dyfrakcyjnej.

6. Generowanie materiału siewnego

UWAGA: Powtarzalnie otrzymujemy kryształy do generowania nasion w 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w/v PEG 20k. Jednak kryształy będą wykazywały wysoką mozaikowatość i nie nadają się do zbierania danych na tym etapie.

  1. Korzystając z zestawu do generowania nasion, przygotuj wywar siewny, odpipetowując całą kroplę z obecnym kryształem i umieść w 50 μl roztworu warunkującego krystalizację w dołączonej fiolce.
  2. Wiruj materiał siewny przez 3 minuty, pulsując 20 s i 10 s off.
  3. Seryjnie rozcieńczany materiał siewny w krokach co 1:10 aż do 1:10 000. Przechowywać wszystkie rozcieńczenia w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania.

7. Dobre ekrany

  1. Zaprojektuj drobne ekrany zmieniające warunki dla Tris, PGA-LM i PEG. Różna długość PEG dla poszczególnych tacek.
    UWAGA: Drobne sito, które wytworzyło kryształ wykorzystany do oznaczania struktury NEMO-EEAA, wykorzystywało następujące warunki: 0,1 M Tris pH 8; PGA-LM wahał się od 8 do 0% w kolumnach 1-12. W rzędach A-H przesiewano różne PEG-i, których stężenia różniły się w kolumnach 1-12 w następujący sposób. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Kryształ pojawił się w studzience H4 (5,45% w/v PEG 20k, 5,8% w/v PGA-LM). W tym protokole do budowy ekranów wykorzystano płynny konstruktor do krystalografii białek.
  2. Wysiewać białko w stosunku objętościowym 1:25 o rozcieńczeniu 1:1,000.
    UWAGA: Stężenie NEMO-EEAA nieznacznie spadnie, ale kryształy nadal będą się tworzyć.
  3. Powtórz krok 2, stosując rozcieńczenie nasion 1:10 000, ten sam stosunek objętości 1:25.
  4. Za pomocą naczywarki do zakraplania dozować 100 nl roztworu białkowego o stężeniu 1,65 mg/ml, z rozcieńczeniem nasion w stosunku 1:1 000 w stosunku 1:1 z roztworem zbiornikowym w kropli 1 do końcowej objętości 200 nL. Powtórz dla kropli 2, ale z obecnym rozcieńczeniem nasion 1:10 000.
  5. Uszczelnij płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej o szerokości 3 cali natychmiast po dozowaniu.
    UWAGA: Krople wyschną, jeśli zostaną wystawione na działanie atmosfery dłużej niż 2-3 minuty.
  6. Przechowuj tace w pamięci termowizora w temperaturze 20 °C, sprawdzając obrazy zebrane po dwóch dniach pod kątem obecności kryształów.
  7. Sprawdź kryształy za pomocą imagera z polaryzatorem krzyżowym pod kątem jednorodności sieci, aby wybrać pojedyncze warunki, aby ustawić następujące tace.

8. Generowanie kryształów do zbierania danych

  1. Zaprojektuj ekrany o pojedynczych warunkach wokół warunków Tris, PGA-LM i PEG, które wytworzyły jednolite kryształy analizowane za pomocą obrazów spolaryzowanych krzyżowo i największe możliwe kryształy.
    UWAGA: Kryształy z tych warunków mają nieregularny kształt, przeważnie są to prostokątne cienkie arkusze. Kluczowe jest, aby wybrać stan, w którym krawędzie kryształu są dobrze zdefiniowane i mają największą możliwą grubość.
  2. Ręcznie przygotować 20 ml warunków krystalizacji.
  3. Za pomocą pipetora wielokanałowego dozować 60 μl na studzienkę na 2-komorową 96-dołkową płytkę krystalizacyjną do dyfuzji pary w pozycji siedzącej.
  4. Przygotować materiał siewny zgodnie z opisem w kroku 6.2.
  5. Dozować białko zgodnie z opisem w kroku 6.3.
  6. Uszczelnij płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej o szerokości 3 cali natychmiast po dozowaniu.
    UWAGA: Krople wyschną, jeśli zostaną wystawione na działanie atmosfery dłużej niż 2-3 minuty.
  7. Przechowuj tace w termowizorze w temperaturze 20 °C i codziennie sprawdzaj obrazy pod kątem obecności kryształów.
  8. Sprawdź spolaryzowane krzyżowo obrazy kryształów pod kątem jednorodności sieci, aby wybrać kryształy do zbierania danych.

9. Określenie krioprotektoru

  1. Aby przetestować krio-protekcje, należy utworzyć roztwory podstawowe odpowiadające warunkom krystalizacji, ale zawierające o 30%, 20%, 10% i 5% wyższe stężenie każdego składnika. Dodanie objętości krioprotektoru spowoduje końcowe stężenie składników, które jest takie samo jak warunki krystalizacji.
    UWAGA: W celu przetestowania krioprotektoru w stężeniu 30% objętościowym dla warunków krystalizacji 0,1 M Tris, należy rozpocząć od roztworu podstawowego 0,143 M Tris przed dodaniem krioprotektorantu.
  2. Z zestawu krioodczynników utwórz 10 μl próbki do testu krioprotektoru, mieszając 30% objętościowo warunku kriogenicznego z 70% roztworem podstawowym warunku krystalizacji, aby uzyskać końcowe stężenie 30% krioprotektoru w oryginalnych warunkach krystalizacji. Dokładnie wymieszaj.
    1. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl pobrać 5 μl testowego roztworu chronionego przed kriogeniczną powłoką i zanurzyć końcówkę pipety w ciekłym azocie. Jeśli zaobserwuje się lód, wyrzuć.
    2. Przetestuj wszystkie środki krioochronne na poziomie 30%. Aby uzyskać pomyślne rozwiązania, powtórz proces przy 20%, a następnie 10% i 5% krioprotektoru.
    3. Wykorzystując skuteczny roztwór krioprotekcji z najmniejszym procentem krioprotektoru, dodaj 0,5 μl roztworu do kropli testowej z obecnymi kryształami. Obserwuj pod mikroskopem, mierząc czas, jak długo kryształ utrzymuje się w stanie, jeśli nie nieokreślony.
      UWAGA: Te kryształy są przeznaczone wyłącznie do testów i zostaną wyrzucone. Dla NEMO-EEAA 12% 1,2-propanodiol jest optymalnym roztworem krioochronnym. 12% odpowiada za rozcieńczenie, jakiemu ulegnie roztwór krioprotekcji po dodaniu do kropli kryształu o długości około 100 nl, co daje przybliżone końcowe stężenie 1,2-propanodiolu wynoszące 10%.

10. Pętla kryształowa

  1. Kryształy pętlowe 1-2 dni przed wysyłką do synchrotron.
    UWAGA: Kryształy będą miały średnicę około 60-100 μm: pętle 0,05 – 0,10 mm są idealne do zapętlania.
  2. Wytnij taśmę od góry studni.
  3. Dodać 0,5 μl roztworu krystalizacyjnego zawierającego 12% krioprotektoru 1,2-propanodiolu bezpośrednio do studzienki.
    UWAGA: Końcowe stężenie 1,2-propanodiolu wynosi obecnie około 10%, ze względu na rozcieńczenie 100 nL roztworu kroplowego (przybliżone zmniejszenie objętości kropli z początkowych 200 nL, ze względu na dyfuzję pary).
  4. Zapętl kryształ ze studni.
    UWAGA: Kryształy często rosną na dnie studni, ale usuwają się z delikatnym szturchnięciem pętli. Po usunięciu pętli.
  5. Przechowywać kryształ zawierający kriopętle w krążkach zanurzonych w cieczyN2.
  6. Przechowuj te krążki w cieczyN2 w kolbie Dewara, aż będą gotowe do wysyłki do dyfrakcji rentgenowskiej w synchrotronie.

11. Zbieranie danych

  1. Zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej. W tym protokole należy użyć linii AMX (ID: 17-ID-1), National Synchrotron Light Source II.
    UWAGA: Dane zostały zebrane na miejscu, ale można je zbierać zdalnie. Zbierz dane w obszarze kryształu, który wykazał jednorodność sieci na obrazach spolaryzowanych krzyżowo. Umieść kryształy w pętli tak, aby zbieranie danych nie obejmowało "słabych" obszarów kryształu, podczas gdy kryształ obraca się w goniometrze. Dane, które zapewniły najlepszą rozdzielczość, pochodziły z zebrania na krawędzi przedłużenia kryształu o wymiarach około 5 x 5 μm. Użyj rastra, aby zidentyfikować najlepsze obszary kryształu do zebrania20.

12. Przetwarzanie danych rentgenowskich

  1. Przetwarzanie zbioru danych do najwyższej rozdzielczości zebranej (1,8 A) za pomocą programu XDS IDXREF w celu określenia grupy przestrzeni, komórki elementarnej i zawartości rozpuszczalnika.
  2. Integracja danych za pomocą programu XDS INTEGRATE.
  3. Skalowane intensywności przetwarzania z programu XDS XSCALE przy użyciu serwera STARANISO przy użyciu średniej odcięcia I/σI wynoszącej 1,2 dla powierzchni granicznej dyfrakcji dla danych.
    UWAGA: Dane nie zostaną przecięte w prawdziwej elipsoidzie. Zachowaj wszystkie dane powyżej wartości granicznej I/σI 1,2. Statystyki dotyczące danych obliczonych dla kompletności sferycznej będą ubogie ze względu na niesferyczne obcięcie. Kompletność eliptyczna wyniosła 88% przy najwyższych rozdzielczościach: 1,88 A, 2,10 A i 2,55 A odpowiednio wzdłuż osi a*, b* i c.

13. Rozwiązanie strukturalne

  1. Wykorzystaj strukturę rentgenowską GCN4 (PDB: 4DMD)15 jako model wyszukiwania wymiany molekularnej za pomocą MRage21 w PHENIX22. Struktura 4DMD została zdefiniowana w MRage jako "zespół", a rozwiązanie MRage z powodzeniem zbudowało część struktury odpowiadającą adapterowi cewki spiralnej N-end NEMO-EEAA, homologicznemu do modelu wyszukiwania, dla obu łańcuchów w dimerze.
    UWAGA: Wyłącz korekcję anizotropii w PHASER, w przeciwnym razie dane zostaną jeszcze bardziej przeskalowane.
  2. Wykorzystaj kolejne rundy Autobuild23 w PHENIX i ręczne budowanie (przy użyciu map 2Fo-F c i Fo-F c, w Coot24), aby zbudować pozostałą część struktury.
  3. Ręcznie zbuduj pozostałości, których jeszcze brakuje w modelu na podstawie map 2Fo-F c i Fo-F c, używając Coot24.
    UWAGA: Ostatni etap polegał na zbudowaniu 4 reszt N-końcowych i 4 reszt C-końcowych dla każdego monomeru. Rozmieszczenie bocznego łańcucha zostało również ręcznie dostosowane w razie potrzeby.
  4. Oblicz złożoną mapę pominięć za pomocą PHENIX i 10% pominięcia struktury.

14. Udoskonalenie struktury

  1. Udoskonal struktury za pomocą PHENIX Refine. Uruchom początkowe udoskonalenia względem mas rozpuszczalników i stereochemii, zmniejszając ograniczenia RMSbond i RMSangle odpowiednio do 0,01 i 1,0. Kontynuuj doskonalenie poszczególnych czynników B, parametrów TLS i zajęć.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonowanie, ekspresja i oczyszczanie domeny NEMO wiążącej IKK.
Protokół zastosowany w tym badaniu w celu uzyskania końcowej sekwencji NEMO-EEAA (Rysunek 1A), która wytworzyła kryształy o jakości dyfrakcyjnej, obejmował ekspresję i charakterystykę wszystkich konstruktów pośrednich, w tym dodanie adapterów cewki zwijanej na końcu N i lub C, mutacje C76A, C95S i mutacje E56A, E57A. Rysunek 1B wyświetla żel SDS-PAGE z próbek pobran...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próby krystalizacji NEMO w postaci niezwiązanej zakończyły się niepowodzeniem, w tym próby użycia białka o pełnej długości i kilku konstruktów skracających obejmujących domenę wiążącą IKK. Nasza biofizyczna charakterystyka domeny wiążącej IKK NEMO (reszty 44-111) za pomocą dichroizmu kołowego, spektroskopii NMR i anizotropii fluorescencji wykazała, że konstrukt, choć zdolny do wiązania IKKβ, istniał w stanie wymiany konformacyjnej, nienadającym się do krystalizacji 9,10

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Prof. D. Maddenowi za wiele pomocnych dyskusji podczas tego projektu. Dziękujemy prof. D. Bolonowi za dar plazmidu zawierającego zoptymalizowaną cewkę spiralną GCN4. Dziękujemy dr B. Guo za plazmidy NEMO. Dziękujemy Christinie R. Arnoldy, Tamar Basiashvili i Amy E. Kennedy za zademonstrowanie procedury. Dziękujemy BioMT Crystallography Core Facility oraz wydziałom Chemii oraz Biochemii i Biologii Komórki w Dartmouth za korzystanie ze sprzętu krystalograficznego oraz personelowi BioMT za ich wsparcie. W badaniach wykorzystano linię AMX National Synchrotron Light Source II, należącej do Biura Użytkowników Nauki Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) obsługiwanej dla Biura Nauki Departamentu Energii przez Brookhaven National Laboratory na podstawie umowy nr 1. DE-SC0012704. Dziękujemy pracownikom NSLS II za wsparcie. Praca ta została sfinansowana z grantów NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 i P20GM113132 oraz grantu Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20% w/v γ-PGA (forma Na+, LM)Wymiary molekularneMD2-100-150Do drobnej krystalizacji przesiewowej NEMO-EEAA
3,5 kDa MWCO DializaMembrane Spectra/Por132724Do dializy usuwania imidazolu
Amicon Stirred CellMillipose SigmaUFSC 05001Do stężenia białka
Chlorek amonuMillipore SigmaG8270Do minimalnego etykietowania nośników
Nukleaza benzonazyMillipore Sigma9025-65-4Do trawienia kwasu nukleinowego
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Kompetentne komórkiAgilent TechnologiesModel: 230245Ekspresja TEV
CryoProHampton ResearchHR2-073Zestaw krioochrony
D-Glucose (dekstroza)Millipore SigmaA9434Do Minimalne etykietowanie nośników
Difco Terrific BrothThermoFisherDF043817Do wzrostu kultur
Dithiothreitol > 99%GoldbioDTT25Do redukcji dwusiarczków
E. coli: Rosetta 2 (DE3)Novagen71400-3Ekspresja nieznakowanego NEMO-EEAA
FORMULATORFormulatrixPłynna obsługa/ producent sita
HCl i ndash; Roztwór 1,0 MHampton ResearchHR2-581Do drobnej krystalizacji ekranu NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare28989333Do oczyszczania z wykluczeniem wielkości
Kolumna HisTrap HP 5 mLGE Healthcare17524802Do oczyszczania NEMO-EEAA
96 MIDASWymiary molekularneMD1-59Do badań przesiewowych z matrycą rzadką NEMO-EEAA
HT 96 Morfealnewymiary molekularneMD1-46Do badań przesiewowych NEMO-EEAA
ImidazolThermoFisher288-32-4Do elucji z kolumny pułapki Hisa
Izopropylo-beta-D-tiogalaktozydGoldbioI2481C5Do indukcji kultur
Płytka krystalizacyjna MRC2Hampton ResearchHR3-083Płytka krystalizacyjna
NT8 - KroplówkaFormulatrixKrystalizacja
pET-16bMillipore Sigma69662Do klonowania NEMO-EOAA
pET-45bMillipore Sigma71327Do klonowania NEMO-EOAA
Fluorek fenylometylosulfonyluThermoFisher36978Do inhibicji proteaz
Butelka z poliwęglanu do stosowania w wirniku ultrawirówki Typ 45 TiBeckmann Coulter339160Butelka do ultrawirówki
Glikol polietylenowy 20 000Hampton ResearchHR2-609Do drobnej krystalizacji przesiewowej NEMO-EOAA
pRK793 (TEV)AddgenePlasmid 8827Do produkcji TEV
QuikChange XL IIAgilent Technologies200522Mutageneza ukierunkowana na miejsce
Wymagany montaż nasadki:Zakrętka do butelki Beckmann Coulter 355623Ultracenttrifuge
ROCK IMAGERFormulatrixCrystallization Imager
Hampton ResearchHR2-320Wytwarzanie nasion
Chlorek sodu ≥ 99%miliporów SigmaS9888Do buforowania roztworów oczyszczających
TCEP (chlorowodorek fosforyny tris (2-karboksyetylo))GoldbioŚrodek redukującyTCEP1
Ekran BerkeleyRigakuMD15-BerekelyDo badań przesiewowych NEMO-EEAA
Ekran PGAWymiary molekularneMD1-50Do drobnej krystalizacji ekranu NEMO-EEAA
Tris – 1,0 M RoztwórHampton ResearchHR2-589Do drobnej krystalizacji NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (proszek) format)Thermofisher15504020Do buforowania roztworów oczyszczających
MocznikThermoFisher29700Do denaturacji NEMO-EEAA
Zestaw kulek nasiennych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663(2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950(2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

IKK binding DomainNEMO ProteinProtein ExpressionChromatographic PurificationSize ExclusionCrystallization ScreeningX ray DiffractionMolecular ReplacementCoiled coil AdapterTEV Protease

Related Articles