Model pęcherza bez detrusorów umożliwia bezpośredni dostęp do błony podmoczowej w celu zbadania lokalnych mechanizmów regulacji dostępności biologicznie aktywnego mediatora w suburotelium/blaszce właściwej podczas przechowywania i oddawania moczu. Preparat bardzo przypomina napełnianie nienaruszonego pęcherza moczowego i pozwala na wykonanie badań ciśnienia i objętości bez wpływów ogólnoustrojowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zdecentralizowany (ex vivo) mysi model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym w celu uzyskania bezpośredniego dostępu do błony dróg moczowych podczas napełniania pęcherza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poprzednie badania wykazały uwalnianie substancji chemicznych z płaskich arkuszy błony śluzowej pęcherza moczowego umieszczonych w komorach Ussing i wystawionych na zmiany ciśnienia hydrostatycznego lub mechanicznego rozciągania oraz z hodowanych komórek urotelialnych przy zmianach ciśnienia hydrostatycznego, rozciąganiu, pęcznieniu komórek lub siłach oporu, a także w świetle pęcherza moczowego pod koniec napełniania. Takie odkrycia doprowadziły do założenia, że mediatory te są również uwalniane w suburothelium (SubU)/blaszce właściwej (LP) podczas napełniania pęcherza, gdzie wpływają na komórki głęboko w ścianie pęcherza, aby ostatecznie regulować pobudliwość pęcherza. Istnieją co najmniej dwa oczywiste ograniczenia w takich badaniach: 1) żadne z tych podejść nie dostarcza bezpośrednich informacji o obecności mediatorów w SubU/LP oraz 2) stosowane bodźce nie są fizjologiczne i nie podsumowują autentycznego wypełnienia pęcherza. W tym miejscu omówiono procedurę, która umożliwia bezpośredni dostęp do podurotelialnej powierzchni błony śluzowej pęcherza moczowego w trakcie napełniania pęcherza moczowego. Stworzony przez nas preparat bez mysich wytruzów bardzo przypomina napełnianie nienaruszonego pęcherza moczowego i umożliwia wykonywanie badań ciśnienia i objętości pęcherza moczowego przy braku zakłócającej sygnalizacji z odruchów rdzeniowych i wypieracza mięśni gładkich. Korzystając z nowatorskiego modelu pęcherza moczowego wolnego od wytruzów, wykazaliśmy niedawno, że pomiary śródpęcherzowe mediatorów nie mogą być używane jako wskaźnik zastępczy tego, co zostało uwolnione lub jest obecne w SubU/LP podczas napełniania pęcherza. Model umożliwia badanie cząsteczek sygnałowych pochodzących z nabłonka dróg moczowych, które są uwalniane, generowane przez metabolizm i/lub transportowane do SubU/LP w trakcie napełniania pęcherza moczowego w celu przekazywania informacji do neuronów i mięśni gładkich pęcherza moczowego oraz regulowania jego pobudliwości podczas trzymania moczu i mikcji.
Wprowadzenie
Celem tego modelu jest umożliwienie bezpośredniego dostępu do podśluzówkowej strony błony śluzowej pęcherza podczas różnych faz napełniania pęcherza.
Pęcherz musi powstrzymać się od przedwczesnego skurczu podczas napełniania i opróżnić się, gdy zostanie osiągnięta krytyczna objętość i ciśnienie. Nieprawidłowa nietrzymanie moczu lub oddawanie moczu są często związane z nieprawidłową pobudliwością mięśni gładkich wypieracza (DSM) w trakcie napełniania pęcherza. Pobudliwość DSM jest determinowana przez czynniki właściwe komórkom mięśni gładkich oraz przez wpływy generowane przez różne typy komórek w ścianie pęcherza moczowego. Ściana pęcherza moczowego składa się z nabłonka dróg moczowych (błona śluzowa), błony śluzowej (SubU)/blaszki właściwej (LP), mięśni gładkich wypieracza (DSM) i błony surowiczej (ryc. 1A). Nabłonek dróg moczowych składa się z komórek parasolowych (tj. Najbardziej zewnętrznej warstwy nabłonka dróg moczowych), komórek pośrednich i komórek podstawnych (tj. Najbardziej wewnętrznej warstwy nabłonka dróg moczowych). W SubU/LP znajdują się różne typy komórek, w tym komórki śródmiąższowe, fibroblasty, doprowadzające zakończenia nerwowe, małe naczynia krwionośne i komórki odpornościowe. Powszechnie przyjmuje się, że nabłonek moczowy pęcherza moczowego jest narządem czucia, który inicjuje odruchową mikcję i nietrzymanie moczu poprzez uwalnianie mediatorów do błony podśluzowej, które wpływają na komórki w SubU/ LP i DSM1,2,3. W większości takie założenia opierają się na badaniach, które wykazały uwalnianie mediatorów: z fragmentów błony śluzowej narażonych na zmiany ciśnienia hydrostatycznego4,5; z hodowanych komórek urotelialnych wystawionych na rozciąganie6,7, pęcznienie komórek wywołane hipotonicznością7 lub siły oporu8; z izolowanych pasków ściany pęcherza moczowego po aktywacji receptora lub nerwu9,10,11,12,13,14; oraz w świetle pęcherza moczowego na końcu wypełnienia pęcherza15,16,17,18,19. Chociaż takie badania miały zasadnicze znaczenie dla wykazania uwalniania mediatorów po mechanicznej stymulacji segmentów ściany pęcherza moczowego lub hodowanych komórek urotelialnych, muszą być poparte bezpośrednimi dowodami na uwalnianie mediatorów w błonie podśluzowej, które są wywoływane przez bodźce fizjologiczne odtwarzające wypełnienie pęcherza. Jest to trudne zadanie, biorąc pod uwagę, że SubU/LP znajduje się głęboko w ścianie pęcherza, co utrudnia bezpośredni dostęp do okolic SubU/LP podczas napełniania pęcherza.
Tutaj ilustrujemy zdecentralizowany (ex vivo) model mysiego pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypieracza13, który został opracowany w celu ułatwienia badań nad lokalnymi mechanizmami mechanotransdukcji, które uczestniczą w sygnalizacji między nabłonkiem moczowym, DSM i innymi typami komórek w ścianie pęcherza. Takie podejście jest lepsze niż stosowanie płaskich arkuszy ścian pęcherza moczowego, pasków ścian pęcherza moczowego lub hodowanych komórek urotelialnych, ponieważ umożliwia bezpośrednie pomiary w pobliżu SubU/LP mediatorów pochodzących z nabłonka dróg moczowych, które są uwalniane lub tworzone w odpowiedzi na fizjologiczne ciśnienia i objętości w pęcherzu moczowym i pozwala uniknąć potencjalnych zmian fenotypowych w hodowli komórkowej. Może być stosowany do pomiaru dostępności, uwalniania, metabolizmu i transportu przezurotelialnego mediatorów w SubU/LP na różnych etapach napełniania pęcherza moczowego (ryc. 1B). Preparat może być również stosowany do badania sygnalizacji urotelialnej i mechanotransdukcji w modelach zespołów pęcherza nadaktywnego i niedoaktywnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych oraz Instytucjonalnym Komitetem ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Nevady.
UWAGA: Prezentowany tutaj model polega na usunięciu mięśnia wypieracza, podczas gdy nabłonek dróg moczowych i SubU/LP pozostają nienaruszone (Rysunek 1B), aby umożliwić badaczom bezpośredni dostęp do SubU/LP w trakcie napełniania pęcherza.
1. Sekcja preparatu pęcherza bez truzów
- Umieścić odizolowany pęcherz moczowy w naczyniu preparacyjnym wypełnionym zimnym (10 °C) i natlenionym 5% roztworem wodorowęglanuCO2/95%O2 Krebsa (KBS) o następującym składzie (mM): 118,5 NaCl, 4,2 KCl, 1,2 MgCl2, 23,8 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,0 dekstroza, 1,8 CaCl2 (pH 7,4)13.
- Przypnij niewielką część kopuły izolowanego pęcherza moczowego do pokrytego Sylgardem naczynia preparacyjnego wypełnionego KBS. Upewnij się, że szpilka przechodzi przez kawałek błony surowiczej lub najbardziej zewnętrzną krawędź mięśnia wypieracza z dala od najbardziej wewnętrznej krawędzi mięśnia, który jest skierowany w stronę SubU/LP.
- Za pomocą mikroskopu zidentyfikuj cewkę moczową i moczowody i przypnij każdy z nich do dna naczynia preparacyjnego.
- Usuń nadmiar tkanki tłuszczowej i łącznej tak, aby wyświetlić całą główną część pęcherza moczowego, cewkę moczową i oba moczowody.
- Zawiąż moczowody nylonowymi szwami 6-0. Następnie przypnij otwarte końce moczowodów do dna naczynia preparacyjnego, aby zabezpieczyć preparat.
- Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie pociągnij kawałek błony surowiczej w rogu między moczowodem a trzonem pęcherza.
- Dostosuj światło mikroskopu, aby zwiększyć przezroczystość i rozróżnić brzeg błony podśluzowej pod mięśniem wypieracza.
- Rozpocznij nacinanie (nie złuszczanie!) ściany pęcherza nożyczkami z cienką końcówką wzdłuż wewnętrznej powierzchni warstwy mięśni wypieracza, jednocześnie delikatnie odciągając odcięty segment od preparatu. Przez cały czas upewnij się, że boczna krawędź błony śluzowej jest widoczna i unikaj jej dotykania.
- Całkowicie usunąć mięsień wypieracza, obracając naczynie preparacyjne tak, aby pozycja preparatu była wygodna do kontynuowania wycinania mięśnia wypieracza.
- Pozostaw mały kawałek mięśnia wypieracza na szczycie kopuły pęcherza, aby zapewnić możliwość unieruchomienia preparatu podczas pozostałych etapów protokołu.
- Zrób podwójną pętlę z nylonowej nici 6-0, umieść ją na szyi preparatu do pęcherza i pozostaw pętlę luźną.
- Dodaj drugą podwójną pętelkę z jedwabnej nici 6-0, umieść ją na szyi preparatu do pęcherza i pozostaw pętelkę luźną. Posiadanie dwóch szwów zapobiega przeciekaniu wokół szwów.
- Przeciąć około 2 cm rurki PE (cewnika), rozszerzyć końcówkę, powoli przesuwając końcówkę w pobliżu płomienia.
- Napełnij cewnik ciepłym (37 °C) natlenionym KBS.
- Wprowadzić cewnik do otworu cewki moczowej pęcherza moczowego i delikatnie popchnąć cewnik, aż końcówka cewnika dotrze mniej więcej do środka pęcherza.
- Zawiąż szew wokół cewnika i otaczającej tkanki szyjki pęcherza.
- Powoli napełnij pęcherz około 50-100 μl ciepłego (37 °C) natlenionego KBS, unieś go na chwilę (<10 s) nad powierzchnię KBS i monitoruj, czy nie ma wycieków na szwach i korpusie pęcherza.
- Jeśli nie zaobserwuje się wycieku, preparat jest gotowy do eksperymentu. Jeśli zaobserwuje się nieszczelność wokół szwu, zdejmij szew i wymień go. W przypadku zauważenia wycieku z otworu w korpusie pęcherza moczowego należy wyrzucić preparat.
2. Przygotowanie do wypełnienia odmulonego pęcherza
- Przeprowadzić perfuzję KBS (37 °C) w komorze o pojemności 3 ml naczynia organowego z płaszczem wodnym (37 °C) z dnem Sylgarda.
- Wyreguluj przewody tlenowe i ssące.
- Umieść preparat do obnażonego pęcherza moczowego w komorze.
- Przymocować cewnik z boku komory tak, aby preparat nie unosił się nad powierzchnią roztworu perfuzyjnego.
- Podłączyć cewnik pęcherza moczowego do dłuższej rurki PE20 (linii infuzyjnej) podłączonej do trójdrożnego kranu za pomocą łącznika o tym samym rozmiarze.
- Upewnij się, że przewody między pompą infuzyjną, przetwornikiem ciśnienia i pęcherzem są otwarte.
- Napełnić strzykawkę infuzyjną świeżym, ciepłym (37 °C) i natlenionym KBS.
- Dostosuj parametry pompy: rodzaj/objętość strzykawki (np. 1 ml), działanie (np. zaparzanie), przepływ (tj. stały) i natężenie przepływu (np. 15 μl/min).
- Naciśnij przycisk Start na pompie strzykawkowej, aby napełnić pęcherz.
- Monitoruj objętość napełnienia i ciśnienie śródpęcherzowe podczas napełniania pęcherza.
3. Wykrywanie mediatorów w aspekcie SubU/LP preparatu z odmulonym pęcherzem
- Zebrać podwielokrotności roztworu kąpieli do lodowatych probówek do mikrowirówek lub wkładek do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
- Przygotować i przetworzyć próbki zgodnie z odpowiednią aplikacją do wykrywania. W przypadku wykrycia dostępności puryn należy przetworzyć próbki za pomocą HPLC z detekcją fluorescencji13,18.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ściana preparatu pęcherza myszy pozbawionego mięśnia detrusora jest nienaruszona i zawiera wszystkie warstwy z wyjątkiem DSM i błony surowiczej. Badania potwierdzające zasadę działania wykazały, że ściana pęcherza pozbawiona DSM obejmuje urothelium oraz SubU/LP, podczas gdy tunica muscularis i błona surowicza są nieobecne (Rysunek 2)13.
Napełnianie pęcherza pozbawion...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pęcherz moczowy pełni dwie funkcje: magazynowanie i oddawanie moczu. Normalne działanie tych funkcji wymaga odpowiedniego mechanicznego wykrywania objętości i ciśnienia w świetle oraz transdukcji sygnałów przez komórki w ścianie pęcherza moczowego w celu regulacji pobudliwości mięśni wypieracza. Uważa się, że błona śluzowa pęcherza moczowego (nabłonek dróg moczowych) reguluje pobudliwość pęcherza moczowego poprzez uwalnianie różnych cząsteczek sygnałowych w SubU / LP, które wpływają na wiele typów komórek w ścianie pęche...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Część tej pracy została wcześniej opublikowana w czasopiśmie Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Firma Wiley and Sons, Inc. udzieliła zgody na wykorzystanie materiałów zawartych w tej publikacji. Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych ani innych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant DK41315.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| CaCl2 | Fisher | C79 | Źródło elastyczne |
| Dekstroza | Fisher | D16 | Źródło elastyczne |
| Szpilki preparacyjne | Fine Science Tools | 26002-20 | Źródło elastyczne |
| Pompa infuzyjna | Kent Scientific | GenieTouch | Źródło elastyczne |
| KCl | Fisher | P217 | Źródło elastyczne |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Źródło elastyczne |
| Źródło światła | SCHOTT ACEI | Źródło elastyczne | |
| Olympus SZX7 | Elastyczny w użyciu z dowolnym zakresem | ||
| MgCl2 | Fisher | M33 | Źródło elastyczne |
| NaCl | Fisher | S671 | Źródło elastyczne |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Źródło elastyczne |
| igły 25G | Becton Dickinson | 305122 | Źródło elastyczne |
| Kąpiel organowa | Wykonane | Elastyczne źródło; Wykonaliśmy go z naczynia preparacyjnego Radnoti | |
| rurki PE-20 | Intramedic | 427405 | Źródło elastyczne |
| Przetwornik ciśnienia | Przyrząd | Źródło elastyczne | |
| S & T Kleszcze | Narzędzia do nauki o naprawie | 00632-11 | Źródło elastyczne |
| oprogramowanie ciśnienie i objętość | AD Instruments | Power lab | |
| Szew nylonowy, 6-0 | AD chirurgiczny | S-N618R13 | Źródło elastyczny |
| szew Silk, 6-0 | Deknatel przez Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Źródło elastyczne |
| strzykawki 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source elastyczne |
| nożyczki sprężynowe Vannas | Narzędzia do nauki o nauce | 15000-08 | Źródło elastyczne |
| Cyrkulator wody | Baxter | K-MOD 100 | Źródło elastyczne |
Bibliografia
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Model pęcherza pozbawionego mięśnia detrusoralamina propria podurotelialnaprotokół napełniania pęcherzauwalnianie mediatorów urotelialnychbadania ciśnienia i objętościwykrywanie mediatorów purynowychobustronny transport przezcewkowypreparat pęcherza mysiegoperfuzja komory organowejanaliza metabolitów ATP
