Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60347

⸱

3 grudnia 2019

 , 
1Department of Neurobiology, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Streszczenie

Jako makrofagi rezydujące w ośrodkowym układzie nerwowym, mikroglej aktywnie kontrolują rozwój mózgu i homeostazę, a ich dysfunkcje mogą napędzać choroby ludzkie. Poczyniono znaczne postępy w celu odkrycia sygnatur molekularnych homeostatycznego mikrogleju, a także zmian w ekspresji genów w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Wraz z pojawieniem się i dojrzewaniem metodologii genomu pojedynczej komórki coraz częściej uznaje się, że heterogenny mikroglej może leżeć u podstaw różnych ról, jakie odgrywają w różnych stanach rozwojowych i patologicznych. Dalsza analiza takiej heterogeniczności może być osiągnięta poprzez skuteczną izolację mikrogleju z danego obszaru zainteresowania, a następnie czułe profilowanie poszczególnych komórek. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół szybkiej izolacji mikrogleju z różnych obszarów mózgu w jednej dorosłej półkuli mózgowej myszy. Pokazujemy również, jak wykorzystać ten posortowany mikroglej do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki na płytkach. Omawiamy możliwość dostosowania tej metody do innych scenariuszy i przedstawiamy wytyczne dotyczące ulepszania systemu w celu dostosowania go do badań na dużą skalę.

Wprowadzenie

Mikroglej, stanowiący 5%−10% wszystkich komórek nerwowych, to makrofagi rezydentne rozproszone w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1. Chroniony za barierą krew-mózg, typowy mikroglej w zdrowym dorosłym mózgu zawiera wiele drobnych procesów, które szybko rozszerzają się i cofają, aby wchodzić w interakcje z neuronami i innymi komórkami glejowymi w miąższu. Mikroglej może również przyjąć morfologię ameboidalną związaną ze zwiększoną funkcją fagocytarną podczas określonych etapów rozwoju lub w przypadku wyzwań immunologicznych w urazach i chorobach1,2,3,4. Ostatnie ekscytujące odkrycia wyraźnie wykazały, że mikroglej w żadnym wypadku nie jest biernym obserwatorem sygnałów pochodzących z mózgu lub patologicznych, ale odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu rozwoju mózgu i homeostazy, na przykład poprzez wspieranie przeżycia neuronów, przycinanie niedojrzałych synaps, promowanie różnicowania komórek linii oligodendrocytów, a także angiogenezę1. W miarę jak wyjaśnianych jest coraz więcej funkcji mikrogleju, emocje są dodatkowo podsycane przez badania genetyczne na ludziach, które wykazały, że wiele genów ryzyka chorób neurodegeneracyjnych, takich jak TREM2, jest głównie lub wyłącznie wyrażanych przez mikroglej5,6,7. Biorąc pod uwagę ich znaczenie w rozwoju i prawdopodobne role w napędzaniu chorób, ostatnio włożono ogromny wysiłek w zrozumienie regulacji i funkcji genów mikrogleju w nadziei na znalezienie nowych celów terapeutycznych dla chorób neurodegeneracyjnych1,8.

Sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) pozwala na bezstronną charakterystykę ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, co z kolei prowadzi naukowców do badania funkcji genów w gęstych sieciach komórkowych7. Sekwencja RNA została wykonana głównie na próbkach masowych, co doprowadziło do odkrycia homeostatycznej sygnatury genu mikrogleju, która odróżnia je od innych komórek nerwowych i odpornościowych9. Jednak takie podejście może przeoczyć różnice molekularne i funkcjonalne między mikroglejem, zwłaszcza te przejściowo obecne w rozwoju lub związane ze starzeniem się i chorobami. Rzeczywiście, sekwencja RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) oferuje czułość i rozdzielczość, które zrewolucjonizowały tę dziedzinę, ujawniając wcześniej niedocenianą heterogeniczność mikrogleju w różnych kontekstach2,3,10. Ponadto, ze względu na obecność innych podobnych komórek odpornościowych na styku ośrodkowego układu nerwowego i krążenia, scRNA-seq dostarcza informacji wspomagających projektowanie nowych narzędzi do oddzielania i funkcjonalnej analizy tych pokrewnych komórek przy niewielkiej wcześniejszej wiedzy2,11.

Wynaleziono różnorodny wachlarz platform sekwencyjnych scRNA, z których każda nadaje się do określonych zastosowań12. Ogólnie rzecz biorąc, metody oparte na kropelkach, takie jak 10x Genomics, mają wyższą przepustowość z (dziesiątkami) tysięcy komórek sekwencjonowanych w każdym przebiegu i są mniej selektywne dla danych wejściowych, które mogą zawierać mieszane populacje komórek wymagające szerokiej kategoryzacji. Metody oparte na płytkach zapewniają wyższą czułość i głębokość odczytu13,14, zwykle celując w określone populacje z sortowania komórek, aby ujawnić subtelne różnice lub rzadkie transkrypty. Biorąc pod uwagę niewielki odsetek komórek mikrogleju, szczególnie tych związanych z rozwojem lub chorobą, wśród wszystkich typów komórek OUN, często pożądane jest wyizolowanie mikrogleju z określonego regionu zainteresowania i uzyskanie głębokich i pełnowymiarowych informacji transkryptomicznych w celu zrozumienia ich niejednorodności.

Tutaj podajemy szczegóły dotyczące sposobu izolowania mikrogleju z różnych obszarów mózgu myszy wypreparowanych z jednej półkuli, które są używane do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (lub masowo) zgodnie z półautomatyczną procedurą przygotowania biblioteki opartej na płytkach. Druga półkula może być następnie wykorzystana do walidacji histologicznej. Ten protokół izolacji, uproszczony na podstawie wcześniej opublikowanej metody9, ma na celu maksymalizację wydajności z niewielkiej ilości materiałów wyjściowych, a jednocześnie utrzymanie endogennych profili ekspresji genów mikrogleju. Używamy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu wzbogacenia mikrogleju (lub innych pokrewnych komórek odpornościowych będących przedmiotem zainteresowania) na płytki 96-dołkowe i miniaturyzacji objętości odczynników do przygotowania biblioteki w celu zwiększenia przepustowości. Zwracamy uwagę na tę wrażliwą platformę sekwencyjną scRNA, chociaż można zastosować inne strategie oparte na płytkach. Metodę tę można łatwo dostosować do izolowania mikrogleju od innych wypreparowanych tkanek, takich jak ogniska urazowe lub chorobowe, a wiek myszy może się różnić w prawie każdym stadium pourodzeniowym. Skuteczna izolacja regionalnego mikrogleju na potrzeby badań transkryptomicznych pojedynczych komórek ułatwi lepsze zrozumienie ich funkcji w zdrowiu i chorobie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące gryzoni były zgodne z wytycznymi Uniwersytetu Stanforda, które są zgodne z krajowymi i stanowymi prawami i politykami. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Panel Administracyjny ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi Uniwersytetu Stanforda.

UWAGA: Wszystkie kompozycje roztworów i są podane w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie w dniu izolacji komórek

  1. Przygotuj następujące odczynniki i schładzaj je na lodzie: pożywka A (50 ml), bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS) (30 ml), bufor FACS (25 ml), sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS; 30 ml), DNaza (320 μl) i inhibitor RNazy (30 μl).
    nuta: Podane tutaj objętości są wystarczające do wyizolowania mikrogleju z 4 regionów mózgu (np. kory, móżdżku, hipokampa i prążkowia) pojedynczej półkuli mózgu myszy. Zwiększ skalę, jeśli używa się więcej tkanek.
  2. Umieść cztery czyste homogenizatory Dounce o pojemności 2 ml na lodzie i dodaj 2 ml pożywki A z 80 μl DNazy (12 500 jednostek/ml) i 5 μl inhibitora RNazy do każdego homogenizatora Dounce. Schłodzić tłoki w probówkach o pojemności 15 ml.
  3. Oznaczyć cztery 6-centymetrowe szalki Petriego z obszarami mózgu do pobrania tkanek i dodać 200 μl zimnej pożywki A do każdej pożywki na lodzie. Dodać około 5 ml pożywki A do 6 cm szalki Petriego w celu rozwarstwienia.
    nuta: Przed użyciem upewnij się, że wszystkie odczynniki są sterylne i nadają się do zastosowań RNA. Narzędzia stołowe i preparacyjne należy oczyścić i spryskać roztworem do odkażania RNazy (tabela materiałów).

2. Sekcja obszaru mózgu

UWAGA: Ten krok powinien zająć ~30 min.

  1. Wstrzyknąć 400-500 μl ketaminy/ksylazyny (24 mg/ml ketaminy i 2,4 mg/ml ksylazyny) do otrzewnej myszy w stadium młodocianym i dorosłym (>1 miesiąc).
    >nuta: Do ilustracji użyto tutaj samca myszy, ale każda płeć jest odpowiednia.
  2. Odczekaj 5 minut i uszczypnij tylną łapę, aby upewnić się, że nie ma się chowania.
  3. Natychmiast użyj igły 26 G x 3/8, aby wykonać perfuzję przezsercową z 20-30 ml lodowatego PBS, aż bufor wyczerpie się bez widocznej krwi.
  4. Odetnij głowę myszy nożyczkami chirurgicznymi. Użyj małych nożyczek, aby rozciąć skórę, aby odsłonić spód czaszki, a następnie przeciąć szew strzałkowy, szew lambdoidalny i szew koronowy. Użyj kleszczy, aby ściągnąć obie strony kości ciemieniowej i międzyciemieniowej bez uszkadzania tkanki i ostrożnie przenieś mózg do płytki Petriego z pożywką A.
  5. Użyj wstępnie schłodzonego ostrza, aby przeciąć mózg przez linię środkową na dwie półkule.
    nuta: Cztery opisane tutaj regiony mózgu z jednej półkuli wytwarzają wystarczającą liczbę mikrogleju do zastosowań jednokomórkowych lub masowych sekwencji RNA. Druga półkula może być wykorzystana do immunohistochemii lub walidacji RNA in situ.
  6. Oddziel móżdżek od płata korowego i pnia mózgu za pomocą kleszczy #55 i przenieś tkankę na kolekcjonerską szalkę Petriego.
  7. Użyj kleszczy #55, aby ostrożnie wyciąć hipokamp i prążkowie z kory i przenieść każdą tkankę na szalkę Petriego.

3. Mechaniczna dysocjacja tkanek

UWAGA: Utrzymuj komórki i odczynniki w chłodzie przez cały czas, z wyjątkiem etapów barwienia. Ten krok powinien zająć ~30 min.

  1. Pokrój każdą tkankę mózgową żyletką na <1 mm3 drobne kawałki.
  2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml (z odciętymi końcówkami) przenieść fragmenty tkanek do wstępnie schłodzonych homogenizatorów Dounce, z których każdy zawiera 2 ml pożywki A z inhibitorem DNazy i RNazy.
  3. Homogenizuj tkankę, powoli wkręcając i wysuwając tłok z homogenizatora Dounce przez 6-10 pełnych ruchów, aż nie będzie żadnych widocznych kawałków.
    nuta: Douncing zabija neurony i większość innych komórek glejowych, ale pozostawia komórki mikrogleju raczej nienaruszone. Zarówno niewystarczająca, jak i nadmierna liczba komórek może prowadzić do niskiej wydajności komórek.
  4. Przenieś zdysocjowane tkanki do probówek o pojemności 50 ml przez sitka o średnicy 70 μm.
  5. Przepłukać każdy homogenizator i tłok Dounce łącznie 6 ml zimnego podłoża A i przefiltrować roztwór płuczący przez to samo sitko do odpowiedniej probówki.
  6. Przenieść zawiesiny jednokomórkowe (około 8 ml każda) do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem = 5.

4. Usuwanie mieliny

UWAGA: Ten krok powinien zająć ~60 min.

  1. Przygotuj 1 kolumnę dużego zubożenia (LD) (dla kory) i 3 kolumny dużej selekcji (LS) (dla pozostałych 3 regionów) w separatorze magnetycznym (Tabela materiałów). Przepłukać każdą kolumnę 3 ml buforu MCS.
  2. Po zakończeniu wirowania odpipetować i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. W przypadku tkanek kory i móżdżku należy ponownie zawiesić komórki w 850 μl buforu MCS z 1,8 μl inhibitora RNazy. W przypadku tkanek hipokampa i prążkowia ponownie zawiesić komórki w 400 μl buforu MCS z 0,9 μl inhibitora RNazy.
    nuta: Kolumny (LD vs. LS) i objętość używana do rezawiesiny są optymalizowane w oparciu o ilość mieliny obecnej w tkance. Jeśli badane są inne obszary mózgu, warunki te mogą wymagać dostosowania w zależności od wielkości tkanki i ilości mieliny. Skuteczność usuwania mieliny można oszacować w kroku 4.9.
  3. Dodaj po 100 μl kulek do usuwania mieliny do komórek kory i móżdżku oraz dodaj po 50 μl kulek do usuwania mieliny do komórek hipokampa i prążkowia.
  4. Delikatnie wymieszaj komórki z kulkami i inkubuj probówki na lodzie przez 10 minut.
  5. Doprowadzić objętość probówki z komórkami korowymi do 2 ml za pomocą buforu MCS, a wszystkie inne do 1 ml (tj. dodać 1 ml dla komórek korowych; 500 μl dla komórek hipokampa i prążkowia; nie ma potrzeby dodawania buforu do komórek móżdżku).
  6. Gdy kolumny są opróżnione z buforu do płukania, umieść probówkę o pojemności 15 ml pod każdą kolumną. Załaduj komórki korowe (2 ml) do kolumny LD, a wszystkie inne (po 1 ml każda) do kolumn LS. Natychmiast użyć po 1 ml buforu MCS do przemycia oryginalnych probówek i załadować roztwór do odpowiednich kolumn.
  7. Przemyć kolumnę LD raz 1 ml buforu MCS i przemyć każdą kolumnę LS dwukrotnie 1 ml buforu MCS przy każdym przemyciu. Kontynuuj zbieranie roztworu przepływowego podczas mycia.
  8. Przefiltruj komórki do okrągłodennych probówek FACS przez nasadki sitka 35 μm.
    nuta: Każda probówka powinna zebrać około 4 ml zawiesiny jednokomórkowej zubożonej w mielinę.
  9. Opcjonalnie należy pobrać 10 μl zawiesiny komórek i wymieszać ją z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Zbadaj komórki pod mikroskopem 10x jasnego pola, aby oszacować wydajność, wskaźnik przeżycia i poziom resztkowej mieliny.
    nuta: Udany preparat powinien wytworzyć ponad 90% żywych komórek (o okrągłym kształcie i bez niebieskiego barwnika) z niewielką ilością lub bez resztek mieliny.
  10. Komórki osadkowe w probówkach FACS w temperaturze 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, z hamulcem = 5. Powoli wylej supernatant i przetrzyj brzeg probówki na bibułce. Zawiesić komórki w każdej probówce za pomocą 300 μl buforu FACS.
    nuta: Jeśli preferowane jest sortowanie MCS, kulki CD11b mogą być używane do selekcji mikrogleju i innych komórek szpikowych po usunięciu mieliny. Komórki te mogą być następnie wykorzystywane do sekwencjonowania scRNA na bazie bez płytki, a także do sekwencjonowania masowego RNA. Zastrzeżenie tego alternatywnego podejścia polega na tym, że kulki CD11b nie oddzielają mikrogleju od innych pokrewnych komórek odpornościowych, które również są dodatnie dla tego antygenu.

5. Barwienie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

UWAGA: Ten krok powinien zająć ~40 min.

  1. Dodać 5 μl odczynnika blokującego mysie receptory Fc (tabela materiałów) do każdej probówki. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
  2. Dodać 1 μl CD45-PE-Cy7 i 1 μl CD11b-BV421 do każdej probówki.
    nuta: Można stosować przeciwciała z innymi sprzężonymi fluoroforami. Przeciwciała przeciwko TMEM119, specyficzny marker homeostatycznego mikrogleju9, mogą być również włączone, ale zaleca się stosowanie ich razem z CD45 i CD11b, ponieważ niektóre subpopulacje mikrogleju mogą stracić TMEM119 ekspresję powierzchniową.
  3. Inkubować probówki na wytrząsarce przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Dodaj 2 ml buforu FACS do przemycia.
  5. Granulki w temperaturze 4 °C, 400 x g przez 5 min. Powoli wylać supernatant i przetrzeć brzeg probówki na bibułce. Ponownie zawiesić komórki w każdej probówce, używając 400 μl buforu FACS z 1 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl jodku propidyny (PI, rozcieńczenie 1:1,000).

6. Sortowanie indeksu FACS

UWAGA: Ten krok powinien zająć ~1 h.

  1. Postępując zgodnie ze standardową procedurą FACS, narysuj bramki na podstawie rozproszenia (z wyłączeniem szczątków), pojedynczych komórek, żywych komórek (PI ujemnych), mikrogleju i komórek szpikowych (CD45+, CD11b+).
    nuta: Typowe komórki mikrogleju wyrażają CD45 na niższych poziomach w porównaniu z innymi makrofagami związanymi z granicą, takimi jak makrofagi okołonaczyniowe i oponowe, a zatem bramkowanie na CD45 o niskiej zawartości CD11b+ powinno być wystarczające, jeśli badanie koncentruje się na profilach ekspresji genów w tych klasycznych mikrogleju1,2. Jednak niektóre podgrupy mikrogleju mogą mieć wyższą ekspresję CD45, co jest szczególnie ważne podczas rozwoju lub w stanach chorobowych. Aby zapewnić bezstronną analizę ekspresji genów mikrogleju, można rejestrować wysokie i niskie immunofenotypy CD45 za pomocą sortowania indeksów, a obie populacje można zbierać do sekwencjonowania i dalszej analizy. Ponadto, ekspresja powierzchniowa TMEM119 może być wykorzystana do celowania w populację homeostatycznego mikrogleju (patrz krok 5.2) i analizowana razem z poziomami CD45 i wynikami sekwencjonowania.
  2. Sortuj pojedynczy mikroglej (z dyszą 100 μm) na 96-dołkowe płytki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), zawierające 4 μl buforu do lizy w każdym dołku (szczegóły w opublikowanym protokole14).
    nuta: Mieszankę impulsów RNA External RNA Control Consortium (ERCC) (Tabela materiałów) można dodać w proporcji 1:2,4 x 107 w buforze do lizy w celu kontroli jakości i normalizacji2.
  3. Krótko zawiruj płytki i odwiruj w dół za pomocą wirówki stołowej.
  4. Próbki należy natychmiast zamrozić na suchym lodzie. Przechowywać płyty w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania biblioteki.
    nuta: Alternatywnie, więcej komórek można zebrać do probówek o pojemności 1,5 ml z buforem do ekstrakcji RNA w celu sekwencjonowania masowego RNA. Z doświadczenia autorów wynika, że 3 000 komórek wystarcza do wygenerowania dobrej jakości bibliotek zgodnie z opublikowanym protokołem2,14.

7. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

UWAGA: Tutaj opublikowany protocol14 jest stosowany do generowania bibliotek scRNA-seq za pomocą robotyki do obsługi płynów i kilku modyfikacji. W tym artykule procedura jest tylko pokrótce opisana, a różnice są podkreślone. Przetwarzanie 4 płyt jednocześnie trwa około 2,5 dnia.

  1. Rozmrozić płytki na lodzie i przeprowadzić odwrotną transkrypcję za pomocą startera Oligo-dT30VN (w buforze do lizy) w celu wytworzenia cDNA za pomocą termocyklerów (Tabela 1): 42 °C 90 min; 70 °C 5 min; 4 °C trzymać. Następnie amplifikować cDNA dodatkowym etapem trawienia egzonukleazą na początku (Tabela 2) przy użyciu głównej mieszanki PCR i starterów in situ PCR (ISPCR) (tabela materiałów) i w następujących warunkach PCR: 37 °C 30 min; 95 °C 3 min; 23 cykle po 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 min; 72 °C 5 min.
  2. Oczyść cDNA za pomocą 18 μl kulek magnetycznych na studzienkę (stosunek 0,7:1). Inkubować płytkę na stojaku magnetycznym przez 5 minut i dwukrotnie przemyć próbki świeżo przygotowanym 80% etanolem, za każdym razem 80 μl na studzienkę. Po suszeniu płytki przez 15-20 minut, wymyć cDNA za pomocą 20 μl buforu elucyjnego na dołek.
    nuta: Do kontroli jakości należy użyć analizatora fragmentów (analiza fragmentów sekwencjonowania nowej generacji o wysokiej czułości [NGS], 1−6 000 pz) do sprawdzenia rozkładu wielkości i stężenia cDNA, a następnie przetwarzać tylko próbki o rozmazie między 500-5 000 pz i wyższym niż 0,05 ng/μl.
  3. Aby wygenerować biblioteki, zmieszaj 0,4 μl każdej próbki cDNA z 1,2 μl odczynników do znakowania Tn5 z zestawu do przygotowania biblioteki (Tabela materiałów) na 384-dołkowej płytce za pomocą nanolitrowej maszyny do pipetowania, w temperaturze 55 °C 10 min.
    nuta: W tym przypadku dodaje się 1/12,5 sugerowanej objętości reakcji (5 μl próbki i 15 μl odczynników do znakowania) w celu obniżenia kosztów i jednocześnie zwiększenia przepustowości. Maszyna do pipetowania o pojemności nanolitrów (Tabela materiałów) służy do przenoszenia odczynników (ten i następne kroki) z i do płytek 384-dołkowych.
  4. Dodać 0,4 μl buforu neutralizacyjnego, aby zatrzymać reakcję znakowania w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  5. Dodać 384 indeksy (tabela materiałów, 0,4 μl do przodu i 0,4 μl do tyłu), 1,2 μl mieszanki PCR do próbek (po 2 μl każda) i amplifikować biblioteki w następujących warunkach: 72 °C 3 min; 95 °C 30 s; 10 cykli po 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 min; 72 °C 5 min.
  6. Połącz ze sobą wszystkie indywidualne biblioteki (po 1 μl każda) z tej samej płytki 384-dołkowej i użyj kulek magnetycznych (tabela materiałów, stosunek 0,7:1), aby oczyścić końcowe biblioteki pulowe.
  7. Użyj fluorometru (Tabela materiałów) do pomiaru stężeń i bioanalizatora (Tabela materiałów) do zbadania rozkładów rozmiarów połączonych bibliotek przed sekwencjonowaniem. Docelowa głębokość sekwencjonowania wynosi 1 milion nieprzetworzonych odczytów na komórkę.
  8. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami bioinformatycznymi, aby filtrować i przycinać odczyty sekwencjonowania oraz wykonywać alignment2. Użyj tabeli zliczania i metadanych jako danych wejściowych, aby przeprowadzić analizę klastrów za pomocą Seurat package15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji i sortowania mikrogleju z różnych obszarów mózgu w jednej przepłukanej półkuli mózgu dorosłego zwierzęcia, a następnie analizę scRNA-seq. Do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek oraz jako pierwszy etap wzbogacania mikrogleju stosujemy douncing. Niewystarczający lub zbyt intensywny douncing zmniejsza wydajność procesu. Ponadto mózgi dorosłych myszy zawierają wysoką zawartość mieliny, która może obniżyć efektywność sortowania i wydajność, jeśli nie zostanie odpowiednio usu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikroglej aktywnie oddziałuje z innymi typami komórek w OUN i jest bardzo wrażliwy na bodźce środowiskowe. W celu zminimalizowania reakcji zapalnych i nieprawidłowych zmian w ekspresji genów podczas procesu izolacji, protokół ten został uproszczony w stosunku do wcześniej opublikowanej metody9 i jest teraz odpowiedni do równoległego izolowania mikrogleju z wielu regionów jednej półkuli mózgu myszy. Tkanki i odczynniki są przechowywane w niskiej temperaturze, a eksperymenty są przeprowadzane w odpo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Mariko L. Bennett, Lianie Nicole Bonanno i Spyrosowi Darmanisowi za pomoc podczas rozwoju tego protokołu. Dziękujemy również Stanford Shared FACS Facility, w szczególności Meredith Weglarz i Lisie Nichols; Yen Tran, Michael Eckart ze Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) za ich wielkie wsparcie podczas kręcenia filmu. Praca ta jest finansowana przez Fundację JPB i Fundację Vincenta J. Coatesa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5 M BetainaSigma-AldrichCat# B0300-5VL
10 mM dNTP mixThermo Fisher ScientificCat# R0192
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher ScientificCat# 15575020
10X Hanks' Zrównoważony roztwór soliThermo Fisher ScientificCat# 14185-052
1 M HEPESThermo Fisher ScientificCat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master MixKapa BiosciencesCat# KK2602
mL Probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z nasadką sitka CorningCat# 352235
AATI, zestaw do analizy fragmentów NGS o wysokiej czułości (1 pz – 6,000 bp)ZaawansowanyAnalityczny Kot# DNF-474-1000
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichCat# A8806
DNase IWorthingtonCat# LS002007Roztwór roboczy: 12500 jednostek/ml
DTT, klasa molekularnaPromegaCat# P1171
ERCC RNA Spike-In MixThermo Fisher ScientificCat# 4456740
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher ScientificCat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Zestaw A (96 indeksów)IlluminaCat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Zestaw B (96 indeksów)IlluminaCat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Zestaw C (96 indeksów)IlluminaCat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Zestaw D (96 indeksów)IlluminaCat# FC-131-2004
Egzonukleaza lambda (5 U/μ l)New England BioLabsCat# M0262S
Mouse Fc blockBD PharmingenCat# 553142
Koraliki do usuwania mielinyMiltenyl BiotecCat# 130-096-433
Zestaw do przygotowania próbek DNA Nextera XTIlluminaCat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 cykli)IlluminaCat# 20024907
PBS ( 10X), pH 7,4Thermo Fisher ScientificCat# 70011044
Koraliki PCRClean DXAline BiosciencesCat# C-1003-50
Jodek propidiumThermo Fisher ScientificCat# P3566Barwienie: 1:1000
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermal Fisher ScientificCat# Q32851
Szczur monoklonalny anty mysz / człowiek CD11b, Brilliant Violet 421 (klon M1/70)BioLegendKot# 101236; RRID: AB_11203704Barwienie: 1:300
Szczur monoklonalny anty myszy CD45, PE / Cy7 (klon 30-F11)Thermo Fisher ScientificCat # 25-0451-82; RRID: AB_469625Barwienie: 1:300
Rekombinowany inhibitor RNazyTakara BioCat# 2313B
SMARTScribe Odwrotna transkryptaza (100 U/μ l)ClontechCat # 639538Zawierający 5x bufor pierwszej nici
< silny>oligonukleotydy< / silny>
0,1 i mu; M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'		(Picelli et al., 2014)
Starter Oligo-dT30VN: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'		(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" to forrybozasady, a "+" oznacza zasadę LNA)		(Picelli i wsp., 2014)
Solutions
FACS bufferReceptura: sterylnie filtrowany 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES w buforze
MCS Receptura: sterylnie filtrowany 0,5% BSA, 2 mM EDTA w 1X PBS
Medium AReceptura: 15 mM HEPES, 0,5% glukozy w 1X HBSS bez fenolu czerwone
Płytki
384-dołkowe mikropłytki do PCR Rigi-Plate, Axygen ScientificVWR89005-556
96-dołkowe płytki PCR z twardą skorupąBio-RadHSP9631
Inne
Dumont #55Narzędzia do nauki11295-51
Homogenizator Dounce, 2 mlWheaton
Duża kolumna zubożającaMiltenyi Biotec130-042-901
Duża kolumna selekcyjnaMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
RNAzapThermo Fisher ScientificAM9780
Sitko (70 μ m)Falcon352350
Equipment
BD FACSAria IIBD Bioscienceshttp://www.bdbiosciences.com/
BioanalyzerAgilent2100
Analizator fragmentówAgilent5300
Mosquito HTS nanolitrowy robot pipetującyTTP Labtechhttps://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 FluorometrThermo Fisher ScientificQ33226
5 1X PBS o naczyniu 357422

Bibliografia

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122(2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mikroglejusekcja obszar w m zgusortowanie metod cytometrii przep ywowejkulek do usuwania mielinyprzygotowanie buforu do FACSbarwienie CD45 CD11Bocena ywotno ci kom rekprotok przygotowania bibliotekianaliza g bokiego sekwencjonowania
Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.