Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60357

⸱

13 grudnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Pathology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago, 3University of Illinois Cancer Center, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Streszczenie

Pomimo postępów w badaniach nad dorosłymi komórkami macierzystymi, identyfikacja i izolacja komórek macierzystych z próbek tkanek pozostaje głównym wyzwaniem. Podczas gdy rezydentne komórki macierzyste są stosunkowo spokojne z niszowymi ograniczeniami w dorosłych tkankach, wchodzą do cyklu komórkowego w trójwymiarowej hodowli bez kotwicy (3D) i przechodzą zarówno symetryczny, jak i asymetryczny podział komórkowy, dając początek zarówno komórkom macierzystym, jak i progenitorowym. Te ostatnie szybko się namnażają i są główną populacją komórek na różnych etapach zaangażowania w linię, tworząc heterogeniczne sferoidy. Wykorzystując pierwotne normalne ludzkie komórki nabłonka gruczołu krokowego (HPrEC), opracowano test oparty na sferoidach i zatrzymywaniu znaczników, który umożliwia identyfikację i funkcjonalną izolację komórek macierzystych inicjujących sferoidę w rozdzielczości pojedynczej komórki.

HPrEC lub linie komórkowe są dwuwymiarowo (2D) hodowane za pomocą BrdU przez 10 dni, aby umożliwić jego włączenie do DNA wszystkich dzielących się komórek, w tym samoodnawiających się komórek macierzystych. Wymywanie rozpoczyna się po przeniesieniu do hodowli 3D na 5 dni, podczas których komórki macierzyste samoodnawiają się poprzez asymetryczny podział i inicjują tworzenie sferoidów. Podczas gdy stosunkowo spokojne potomne komórki macierzyste zachowują DNA rodzicielskie znakowane BrdU, przodkowie potomni szybko się namnażają, tracąc etykietę BrdU. BrdU można zastąpić barwnikami CFSE lub Far Red, które umożliwiają izolację żywych komórek macierzystych za pomocą FACS. Charakterystyka komórek macierzystych jest potwierdzana przez tworzenie sferoidów in vitro, testy regeneracji tkanek in vivo oraz poprzez dokumentowanie ich symetrycznych/asymetrycznych podziałów komórkowych. Wyizolowane komórki macierzyste zachowujące znaczniki mogą być rygorystycznie badane przez dalsze badania molekularne i biologiczne, w tym sekwencję RNA, sekwencję ChIP, wychwytywanie pojedynczych komórek, aktywność metaboliczną, profilowanie proteomu, immunocytochemię, tworzenie organoidów i regenerację tkanek in vivo. Co ważne, to wolne od markerów podejście do funkcjonalnej izolacji komórek macierzystych identyfikuje komórki macierzyste ze świeżych próbek nowotworowych i linie komórek rakowych z wielu narządów, co sugeruje szerokie zastosowanie. Może być stosowany do identyfikacji biomarkerów nowotworowych komórek macierzystych, badań przesiewowych leków ukierunkowanych na nowotworowe komórki macierzyste oraz odkrywania nowych celów terapeutycznych w nowotworach.

Wprowadzenie

Ludzki gruczoł krokowy zawiera nabłonek świetlny z funkcją wydzielniczą i komórki podstawne leżące pod nim wraz z niezwykłym składnikiem komórek neuroendokrynnych. Komórki nabłonkowe, w tym przypadku, są generowane z rzadkiej populacji komórek macierzystych prostaty, które są stosunkowo spokojne in vivo i działają jako system naprawczy w celu utrzymania homeostazy gruczołów przez całe życie1. Pomimo wielu postępów, identyfikacja i funkcjonalna izolacja komórek macierzystych gruczołu krokowego pozostaje głównym wyzwaniem w tej dziedzinie. Biomarkery komórek macierzystych, w tym metodologie oparte na markerach powierzchniowych komórek w połączeniu z cytometrią przepływową, są powszechnie stosowane w badaniach nad komórkami macierzystymi2,3,4. Jednak wyniki wzbogacania i izolacji różnią się znacznie w zależności od kombinacji markerów i swoistości przeciwciał5,6, co rodzi pytania o tożsamość izolowanych komórek. Innym szeroko stosowanym podejściem do wzbogacania komórek macierzystych jest trójwymiarowa (3D) hodowla sferoidalna2,3,4. Podczas gdy rezydentne komórki macierzyste są stosunkowo spokojne in vivo z ograniczeniami niszowymi, przechodzą podział komórek w hodowli matrycowej 3D (zarówno symetrycznej, jak i asymetrycznej), generując zarówno komórki macierzyste, jak i progenitorowe, które szybko rozmnażają się w kierunku zobowiązania linii7,8. Utworzone sferoidy są niejednorodną mieszaniną zawierającą zarówno komórki macierzyste, jak i komórki progenitorowe na różnych etapach zaangażowania w linię, w tym komórki progenitorowe we wczesnym i późnym stadium. W związku z tym testy z wykorzystaniem całych sferoid nie są przeznaczone wyłącznie dla komórek macierzystych, co sprawia, że identyfikacja unikalnych właściwości komórek macierzystych jest niejednoznaczna. Dlatego tak ważne jest stworzenie testów w celu identyfikacji i oddzielenia komórek macierzystych prostaty od ich potomnych przodków. W tym celu celem obecnego protokołu jest ustanowienie systemu testów, który pozwoli na skuteczną identyfikację i izolację komórek macierzystych z tkanek ludzkiej prostaty, a następnie dogłębną analizę ich funkcji biologicznych.

Długoterminowe przechowywanie znaczników 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) jest szeroko stosowane do śledzenia linii komórkowych in vivo i in vitro na podstawie ich przedłużonego czasu podwojenia9,10. Obecne podejście do identyfikacji i izolacji komórek macierzystych gruczołu krokowego opisane w niniejszym dokumencie opiera się na ich względnej charakterystyce spoczynkowej i właściwościach zatrzymywania etykiet w mieszanej populacji nabłonkowej. Ponadto, w oparciu o hipotezę nieśmiertelnej nici DNA, tylko komórki macierzyste mogą ulegać asymetrycznemu podziałowi komórkowemu. Komórka macierzysta reprezentuje komórkę potomną, która zawiera starsze rodzicielskie DNA, podczas gdy komórka progenitorowa, która jest zaangażowaną komórką potomną, otrzymuje nowo zsyntetyzowane DNA. Opisana powyżej unikalna właściwość komórek macierzystych jest wykorzystywana do znakowania BrdU w rodzicielskich komórkach macierzystych w hodowlach pierwotnych, a następnie śledzenia ich etykiety po wypłukaniu BrdU po przeniesieniu do hodowli sferoidalnej 3D bez kotwicy. Podczas gdy większość pierwotnych komórek nabłonka prostaty zachowuje fenotyp podstawowy i amplifikujący tranzyt w hodowli 2D, istnieje również rzadka populacja multipotencjalnych komórek macierzystych, które uzupełniają i utrzymują homeostazę nabłonka, o czym świadczy tworzenie sferoidów lub w pełni zróżnicowanych organoidów z odpowiednimi pożywkami hodowlanymi po przeniesieniu do systemów 3D3,12. W naszym obecnym protokole, używając sferoidów prostaty HPrEC lub testów retencji BrdU, CFSE lub Far Red opartych na prostasferze, a następnie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), identyfikujemy komórki macierzyste zachowujące znaczniki w sferoidach na poziomie pojedynczej komórki13.

Co ważne, dodatkowo potwierdziliśmy cechy komórek macierzystych komórek zachowujących etykietę we wczesnych stadiach sferoid w porównaniu z komórkami progenitorowymi z zaangażowaniem w linię. Należą do nich asymetryczny podział komórek macierzystych, zdolność do tworzenia sferoidów in vitro i zdolność do regeneracji tkanek in vivo, podwyższona aktywność autofagii, zwiększona biogeneza rybosomów i zmniejszona aktywność metaboliczna. Następnie przeprowadzono analizę RNAseq. Zaobserwowano geny o zróżnicowanej ekspresji w komórkach sferoidalnych zachowujących etykiety, które mogą służyć jako nowe biomarkery dla ludzkich komórek macierzystych prostaty. To oparte na sferoidach podejście do zachowywania etykiet może mieć zastosowanie do próbek nowotworów w celu podobnej identyfikacji niewielkiej liczby nowotworowych komórek macierzystych, zapewniając w ten sposób możliwości translacyjne do zarządzania populacjami opornymi na leczenie13. Poniżej przedstawiono test retencji znaczników oparty na prostasferze na przykładzie ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty (HPrEC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie czynności związane z komórkami i przygotowaniem pożywek powinny być wykonywane z zachowaniem aseptyki w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC).

1. Hodowla i utrzymanie komórek HPrEC w 2D

  1. Pokryj szalki hodowlane o średnicy 100 mm 2 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 2,5 μg/cm2 przez noc w temperaturze pokojowej (RT). Odessać roztwór i pozostawić szalki hodowlane do wyschnięcia na powietrzu w BSC przez 45 minut. Szalki hodowlane pokryte fibronektyną można przechowywać przez 2–4 tygodnie w temperaturze 4 °C.
  2. Dodać 9 ml pożywki do wzrostu komórek nabłonka gruczołu krokowego (np. PrEGM) do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm pokrytego fibronektyną i utrzymywać naczynie w cieple w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  3. Rozmrozić jedną fiolkę z zamrożonymi komórkami HPrEC (2 x 105/ml) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i ponownie zawiesić komórki w 10 ml ciepłego podłoża.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.
  5. Dokładnie zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej. Komórki nasienne przez pipetowanie 1 ml zawiesiny komórkowej bezpośrednio do pokrytego fibronektyną 100 mm naczynia hodowlanego zawierającego 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki (całkowita objętość pożywki i komórek wynosi 10 ml). Umieścić szalki hodowlane z powrotem w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  6. Uzupełniaj podłoże co 2 dni. W tym celu należy ostrożnie odessać wszystkie podłoża i dodać 10 ml świeżego, ciepłego podłoża.
  7. Po około 5 dniach upewnij się, że kultury są zlewające się w ~70–80%. Trawienie enzymatyczne przeprowadzić przez inkubację komórek z 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  8. Zatrzymaj trawienie, dodając 3 ml ciepłego PBS zawierającego 10% FBS.
  9. Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Odessać i odrzucić supernatant.
  10. Zawiesić osad komórkowy w 30 ml ciepłej pożywki i równomiernie rozmieścić go w trzech nowych naczyniach hodowlanych o średnicy 100 mm pokrytych fibronektyną do następnego przejścia.
    UWAGA: Pierwotne komórki HPrEC mogą być pasażowane ~3-5x bez zmiany ich charakterystyki komórek nabłonkowych. Fenotyp nabłonka bada się za pomocą ekspresji markerów komórek podstawnych nabłonka, cytokeratyny 5 i p63, za pomocą testów immunocytochemicznych/immunofluorescencyjnych (ICC/IF).

2. Etykietowanie HPrEC za pomocą barwników BrdU, CFSE lub Far Red

UWAGA: Komórki mogą przejść do kroku 2.1 lub kroku 2.2, po którym następuje transfer do hodowli prostasfery 3D, jak opisano w kroku 3.1.

  1. Pojedyncze znakowanie ogniw za pomocą BrdU
    1. Hodowla 2 x 105 komórek HPrEC na pokrytych fibronektyną 100 mm szalkach hodowlanych z 10 ml ciepłej pożywki zawierającej 1 μM BrdU. Hoduj komórki przez 10 dni (przez dwa pasaże), aby zapewnić znakowanie wszystkich komórek, w tym komórek macierzystych prostaty i komórek progenitorowych.
    2. Po 10 dniach ostrożnie odessać pożywkę PrEGM zawierającą BrdU i przemyć komórki 5 ml ciepłego PBS. Powtórz 1x.
    3. Przeprowadź trawienie enzymatyczne przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA, jak opisano w krokach 1.7–1.8. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.
    4. Ponownie zawiesić granulowane komórki znakowane BrdU (5 x 104) w 500 μl lodowatej (1:1) matrycy/pożywki błony podstawnej i przenieść do hodowli prostasfery 3D (opisanej w kroku 3.1) na 5 dni, aby umożliwić wymywanie BrdU podczas tworzenia sferoidy (~6 cykli komórkowych).
  2. Podwójne znakowanie komórek barwnikami BrdU i CFSE lub Far Red
    1. Jeśli pożądane jest wspólne znakowanie żywych komórek, należy pobrać wstępnie znakowane komórki inkubowane z BrdU przez 10 dni od kroku 2.1 i wspólnie znakować 5 μM CFSE lub fluorescencyjnymi barwnikami fluorescencyjnymi z żywych komórek Far Red przez 30 minut. Wykonaj wspólne znakowanie w dniu 10.
    2. Ostrożnie odessać pożywkę zawierającą barwniki BrdU i CFSE lub Far Red. Umyj komórki 5 ml ciepłego PBS. Powtórz pranie 1x.
    3. Przeprowadź trawienie enzymatyczne przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA, jak opisano w krokach 1.7–1.8. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć i wyrzucić supernatant.
    4. Ponownie zawiesić współznakowane komórki (5 x 104) w 500 μl lodowatej (1:1) macierzy/pożywki błony podstawnej i przenieść do hodowli prostasfery 3D (opisanej w sekcji 3.1) na 5 dni, aby umożliwić wymywanie BrdU i CFSE lub Far Red podczas tworzenia sferoidy (~6 cykli komórkowych).
  3. Wykonaj wykrywanie komórek zatrzymujących etykiety w kulach (prostasfery dnia 5) zgodnie z opisem w krokach 4.1, 4.2, 4.3 lub 5.
    UWAGA: Karboksyfluoresceina dioctan sukcynimidylu ester (CFSE) i Far Red są długotrwałymi fluorescencyjnymi barwnikami pro-owymi i są dobrze zatrzymywane w znakowanych komórkach. Wewnątrzkomórkowa esterazy w żywych komórkach rozszczepiają grupy octanowe, które aktywują zielone lub czerwone cząsteczki fluorescencyjne, które są teraz nieprzepuszczalne dla błony.

3. Tworzenie prostasfery w systemie hodowli błony podstawnej 3D

  1. Hodowla prostasfery w systemie matrycy błony podstawnej 3D
    1. Matrycę błony podstawnej rozmrozić w temperaturze 4 °C przez noc i przechowywać na lodzie przed użyciem.
    2. Delikatnie dodaj 1 ml lodowatej matrycy błony podstawnej do równej objętości lodowatej pożywki hodowlanej. Powoli mieszać, pipetując w górę i w dół, unikając pęcherzyków.
      UWAGA: Dno 12-dołkowych płytek hodowlanych należy wstępnie pokryć 100 μl tego roztworu. Zminimalizuje to liczbę komórek, które wpadają przez matrycę i rosną jako monowarstwa.
    3. Zawiesić 5 x 104 komórek HPrEC w lodowatej (1:1) mieszance matrycy błony podstawnej i pożywki hodowlanej w całkowitej objętości 500 μl.
    4. Odpipetować 500 μl tego roztworu komórkowego wokół dolnej krawędzi każdego dołka.
    5. Zakręć płytą, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę wokół krawędzi studni. Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy.
    6. Gdy matryca zastygnie, przykryj 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej na dołek. Nie naruszaj pierścienia matrycy błony podstawnej. Ostrożnie wyceluj końcówką pipety i dozuj pożywkę hodowlaną do środka studzienki.
      UWAGA: Pożywkę hodowlaną należy ogrzać do 37 °C po dodaniu do zestalonej matrycy błony podstawnej. Matryca membrany podstawnej straci swoją integralność i rozpuści się pod wpływem zimnych/chłodnych mediów.
    7. Uzupełniaj podłoże co 2 dni. Ostrożnie odessać ~500 μL zużytej pożywki i dodać 500 μL świeżej, ciepłej pożywki hodowlanej.
    8. Monitoruj tworzenie i wzrost prostasfery przez 5–7 dni za pomocą odwróconego mikroskopu.
  2. Pasażowanie prostasfer
    1. Zbierz prostasfery z matrycy, ostrożnie odsysając jak najwięcej pożywki. Unikaj przeszkadzania lub podnoszenia pływających kawałków zestalonej matrycy.
    2. Dodać 1 ml roztworu dypazy (matryca błony podstawnej: dyspaza w stosunku 1:2). Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
    3. Inkubować płytki hodowlane w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    4. Zrób zdjęcia prostasfer, które znajdują się na dnie naczynia hodowlanego, aby zliczyć liczbę kul i zmierzyć rozmiar.
    5. Zebrać mieszaninę kulek do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia kulek. Odessać i wyrzucić supernatant.
    6. Rozproszyć kulki na pojedyncze komórki, trawiąc 500 μl ciepłej 0,05% trypsyny/EDTA i przenosząc zawiesinę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    7. Inkubować probówkę do mikrowirówek w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    8. Zatrzymaj działanie trypsyny za pomocą 500 μl ciepłego PBS zawierającego 10% FBS. Przepuścić strawioną zawiesinę kulek przez strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 26 G 5x, aby zdysocjować kulki na pojedyncze komórki.
    9. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 5 minut, aby komórki zostały osadzone w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i wyrzucić.
    10. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej i przefiltrować przez nylonowe sitko komórkowe o wielkości porów 40 μm.
    11. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut, aby komórki zostały osadzone w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić supernatant.
    12. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatej (1:1) macierzy błony podstawnej/pożywki hodowlanej i subkulturę w matrycy błony podstawnej 3D do drugiego przejścia prostasfery.

4. Identyfikacja komórek macierzystych gruczołu krokowego zachowujących BrdU za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Wyrastają z przyczepionych prostasfer, a następnie następuje barwienie immunofluorescencyjne (IF) w celu obrazowania 2D komórek macierzystych prostaty.
    1. Zebrać prostasfery przez trawienie dypazowe, jak opisano w krokach 3.2.1–3.2.3. Odwirować kulki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    2. Zawiesić kulki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej.
    3. Inkubować ~ 50 prostasfer na studzienkę w 8 szkiełkach dołetkowych w 200 μl pożywki hodowlanej w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić przyłączenie i wyrastanie kulek.
    4. W dniu 2 odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną. Przerastające kulki myć 200 μl PBS przez 5 minut.
    5. Umieścić kulki w 200 μl/studzienkę lodowatego metanolu w temperaturze -20 °C na 20 minut.
    6. Myć kulki 200 μl/dołek PBS przez 5 minut. Powtórzyć 2x.
    7. Kulki do przemywania kwasem z 200 μL/studzienkę 2N HCl przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    8. Myć kulki 200 μl/dołek PBS przez 5 minut. Powtórzyć 3x.
    9. Dodać 100 μl roztworu blokującego zawierającego 5% normalnej surowicy koziej w PBST (PBS z 0,25% Triton X-100) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Odessać roztwór blokujący i dodać 100 μl PBST zawierającego 2% normalnej surowicy koziej i pierwotnego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego BrdU (1:200) do każdej studzienki i inkubować w wilgotnym pudełku w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Mysie przeciwciało IgG jest używane jako kontrola ujemna.
    11. Odessać i usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Myj kulki 200 μl PBS przez 5 min. Powtórz 2x.
    12. Dodać 100 μl PBST zawierającego 2% normalnej koziej surowicy i wtórne kozie przeciwciało anty-mysie Alexa Fluor 488 (1: 500) do każdej studzienki i inkubować w RT w ciemności przez 2 godziny.
    13. Odessać i usunąć wtórny roztwór przeciwciała. Myj kulki 200 μl PBS przez 5 min. Powtórz 3x.
    14. Zamontuj szkiełka z ~25-40 μL wodnego medium montażowego zawierającego DAPI.
    15. Uzyskaj obrazy zabarwionych kulek/komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i kolorowej kamery cyfrowej.
  2. Barwienie IF prostasfer w całości do obrazowania 3D komórek macierzystych prostaty
    UWAGA: W przypadku barwienia IF całego mocowania, prostasfery są obsługiwane za pomocą probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    1. Zbierz prostasfery przez trawienie dypazowe, jak opisano w krokach 3.2.1–3.2.3. Odwirować kulki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przy 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić.
    2. Ponownie zawiesić i utrwalić kulki za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Odwirować kulki przy 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić.
    3. Umyć kulki, ponownie zawieszając osad w 1 ml PBS. Odwirować kulki o masie 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz 1x.
    4. Przemyć kulki kwasem, ponownie zawieszając osad w 1 ml 2N HCl na 30 minut.
    5. Przemywać kulki 1 ml PBS przez 5 minut i wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz 3 razy.
    6. Zawiesić ~15–30 kulek w 100 μl roztworu blokującego zawierającego 5% normalnej surowicy koziej w PBST (PBS z 0,25% Triton X-100) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Aby usunąć roztwór blokujący, odwirować kulki o stężeniu 500 x g przez 5 minut. Odessać i wyrzucić supernatant.
    8. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl PBST zawierającego 2% normalnej surowicy koziej i pierwotne mysie przeciwciało anty-ludzkie BrdU (1:200) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    9. Umyć kulki, ponownie zawieszając osad w 1 ml PBS. Odwirować kulki o masie 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz 1x.
    10. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl PBST zawierającym 2% normalnej surowicy koziej i wtórne przeciwciało anty-mysie Alexa Fluor 488 (1:1,000) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    11. Umyć kulki, ponownie zawieszając osad w 1 ml PBS. Odwirować kulki o masie 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz 1x.
    12. Zawiesić kulki w 30–50 μl wodnego podłoża montażowego zawierającego DAPI. Aby zapobiec spłaszczeniu kulek, należy je wlać do studzienki utworzonej z niepowlekanego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem nakrywkowym. Następnie dodaj szkiełko nakrywkowe do naczynia hodowlanego, przykrywając studzienkę.
    13. Rejestruj obrazy całego stosu sfery Z za pomocą odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego w świetle przechodzącym. Konwertuj te obrazy Z-stack na obrazy 3D za pomocą oprogramowania do obrazowania z możliwością rysowania w dowolnym kształcie.
      UWAGA: Mysie przeciwciało IgG jest używane jako kontrola ujemna.
  3. Analiza sparowanych komórek (protokół 4-dniowy)
    1. Kultura sfer oznaczonych BrdU do dnia 5.
    2. Dzień 1: Zbierz kulki z macierzy błony podstawnej z 1 ml trawienia dyspazy. Rozproszyć w pojedynczych komórkach w 500 μl ciepłej 0,05% trypsyny/EDTA w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, jak opisano w krokach 3.2.1–3.2.11.
    3. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej.
    4. Umieść rozproszone pojedyncze komórki (~ 300-500 na studzienkę) w szkiełkach 8-dołkowych i hoduj w 200 μl / dołku pożywce hodowlanej przez noc, aby umożliwić przyłączenie.
    5. Dzień 2: Zmienić pożywkę hodowlaną z 200 μl 2 μM cytochalazyny D w pożywce hodowlanej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, aby umożliwić podział jednej komórki, który zatrzymuje się w późnej metafazie do anafazy.
    6. Dzień 3–4: Odessać i wyrzucić pożywkę. Utrwalić komórki w 200 μl/studzienkę lodowatego metanolu w temperaturze -20 °C przez 20 minut. Postępuj zgodnie z protokołem barwienia immunologicznego dla BrdU, jak opisano w krokach 4.1.5–4.1.14.
    7. Rób zdjęcia sparowanych komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Upewnij się, że odległość między dwoma jądrami jest mniejsza niż 30 μm. Na podstawie retencji BrdU zidentyfikuj sparowane komórki macierzyste jako podlegające symetrycznemu lub asymetrycznemu podziałowi komórkowemu.
      UWAGA: Komórki macierzyste gruczołu krokowego zachowujące etykietę BrdU przechodzą symetryczny podział, aby dać początek dwóm potomnym komórkom macierzystym zachowującym równą ilość BrdU, podczas gdy komórki macierzyste poddawane asymetrycznemu podziałowi powodują powstanie jednej potomnej komórki macierzystej, która zachowuje całą BrdU, a druga potomna komórka progenitorowa, która utraciła etykietę BrdU.

5. Izolacja komórek macierzystych prostaty zachowujących etykietę CFSE za pomocą sortowania FACS

  1. Dzień 5: Zbierz prostasfery dnia 5 oznaczone CFSE rosnące na 6-dołkowych płytkach hodowlanych w kulturze 3D, zastępując pożywkę 2 ml dyspazy (matryca błony podstawnej: dyspaza w stosunku 1:2). Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać.
  2. Inkubować płytki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu roztrawienia matrycy.
  3. Zebrać mieszaninę kulek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować kulki o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i wyrzucić.
  4. Zawiesić granulkę kuli w 500 μl ciepłej 0,05% trypsyny/EDTA i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  5. Inkubować kulki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 500 μl ciepłego PBS zawierającego 10% FBS.
  6. Przełóż kulki przez strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 26 G 5x, aby całkowicie rozdzielić kulki na pojedyncze komórki.
  7. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.
  8. Zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej zawierającej 1 μg/ml jodku propydyny (PI) w celu wybarwienia martwych komórek. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  9. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.
  10. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.
  11. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl ciepłej pożywki hodowlanej i zebrać komórki w probówkach z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu, filtrując je przez zatrzaski z sitkiem o wielkości porów 35 μm.
  12. Wykonaj analizę komórek prostasfery znakowanych trypsyną znakowanych CFSE za pomocą jednokanałowego analizatora FACS.
  13. Bramka subpopulacji frakcjonowanych komórek CFSEHi, CFSEMed i CFSELo. Użyj kontroli ujemnej i dodatniej do bramkowania.
    UWAGA: Obecność komórek macierzystych prostaty z posortowanymi przez FACS zachowującymi znaczniki CFSE (patrz Hu et al.13) można potwierdzić za pomocą mikroskopii zielonej fluorescencji i ich większego rozmiaru komórek w porównaniu z komórkami niezatrzymującymi. Ten większy rozmiar komórek jest właściwością komórek macierzystych prostaty w stosunku do populacji komórek progenitorowych. Może to być inne w przypadku innych typów tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne normalne ludzkie komórki nabłonkowe prostaty są umieszczane w szalkach hodowlanych pokrytych fibronectyną, a wzrost komórek jest utrzymywany w hodowli dwuwymiarowej (Rycina 1a). Po przeniesieniu do hodowli trójwymiarowej z matrycą błony podstawnej, komórki nabłonkowe ulegają stopniowemu obumieraniu. Tylko komórki macierzyste prostaty są w stanie przeżyć w hodowli bez zakotwiczenia i tworzyć sferydy w ciągu 5 dni (Rycina 1b

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Cytometria przepływowa z wykorzystaniem wielu markerów powierzchniowych komórek macierzystych jest powszechnie stosowanym podejściem do badań nad komórkami macierzystymi, pomimo braku zarówno swoistości, jak i selektywności 1,5,6. Podczas gdy tworzenie sferoidów w systemie hodowli 3D jest kolejną użyteczną metodą wzbogacania rzadkiej populacji komórek macierzystych z pierwotnych komórek nabłonkowych, w tym HPrEC, powstałe sferoi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają powiązań finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Dziękujemy Instytutowi Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Illinois w Chicago za pomoc w sortowaniu komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsin-EDTAGibco25300-054
1 ml strzykawki tuberkulinoweBectin DickinsonBD 309625
1,5 ml mikrowirówki, sterylne
szalki hodowlane 100 mmCorning/Falcon353003
12-dołkowa płytka hodowlanaCorning/Falcon353043
15 ml rurki Corning/Falcon352097
szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm, sqCorning284522Do naczynia hodowlanego MatTek 35 mm
Szkiełka nakrywkowe 24 x 50 mmCorning2975245
Igła podskórna 26G x 1,5 calaMonoject1188826112
2N HCl
35 mm z dnem ze szklaną pokrywąMatTek CorpP35G-0-10-CDno szklane nr 0, niepowlekane, figure-materials-1 napromieniowane
40 &mikro; Sitko z nylonu o dużych porachCorning352340
Inkubator do hodowli CO2 5%, 37 &; ProbówkiForma
50 mlCorning/Falcon352098
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z zatrzaskiem sitkowymCorning35223535 µ
m Nylon Mesh 6-dołkowe płytki hodowlaneCorning353046
8-dołkowe szkiełka komoroweMillipore SigmaPEZGS0816
Wodne medium montażowe zawierające DAPIVector LaboratoriesH-1200A Barwnik fluorescencyjny jądrowy
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, certyfikat
BrdU (5-bromo-2'-deoksyurydyna)Sigma-AldrichB50021 mM roztwór podstawowy w DMSO
Wirówka do probówek mikrowirówek 1,5 mlEppendorf
Wirówka do probówek 15 mlBeckman CoulterAllegra 6
CFSE (ester karboksyfluoresceiny sukcynimidylowej)Thermo Fisher ScientificC34554mM roztwór podstawowy w
cytochalazynieD Thermo Fisher Scientific
Dispase 1U/mLStemCell Technologies07923
FACS CellSorter MoFlo XDPBeckman Coulters
Far-Red pro-dyeThermo FisherC345645 mM roztwór podstawowy w DMSO
Płodowa surowica bydlęca (FBS)
FibronektynaSigma-AldrichF0895Do powlekania naczyń hodowlanych 100 mm
Mikroskop fluorescencyjny z kolorowym aparatem cyfrowymCarl ZeissAxioskop 20 mikroskop fluorescencyjny; kolorowa cyfrowa Axiocamera
Goat anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488Thermo FisherA-11029
HPrEC (Pierwotne normalne ludzkie komórki nabłonka prostaty)Lifeline Cell TechnologyFC-0038Pobrano od 3 młodych (19-21 lat) dawców narządów wolnych od choroby; 1 x 105 komórek/ml; przechowywany w wiadrze z lodem ciekłego azotu
i lodzie
Odwrócony mikrosopa z aparatem
Matrigel, niski czynnik wzrostu, wolny od czerwieni fenolowejCorning356239
MetanolCorningA452-4
Mysie przeciwciało anty-BrdUSygnalizacja komórkowa5292S
Mysie przeciwciało IgG ( kontrola negatywna)Santa Cruz Biotechnologysc-2025
Normalna surowica koziaVector LaboratoriesS-1000
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Sigma-AldrichP5368-10PAK
Pipettory i końcówki, różne rozmiary
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)Lifeline Cell TechnologyLL-0041
Jodek propidyny (PI)R & D Systems5135/1010 μ g/ml PI w PBS przechowywanym w temperaturze 4 & deg; C w ciemności
Pipety serologiczne, różne rozmiary
Oprogramowanie do liczenia kul i pomiaru
Oprogramowanie: obrazy 3D za pomocą Imaris oprogramowanie do obrazowania z możliwością
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Łaźnia wodna, 37 & deg; Obrazy
C z-stack przy użyciu odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu
wirówkowe C poziomu 2 5 DMSO PHZ1063cyfrowymwielkościrysowania o dowolnym kształcie konfokalnego w świetle przechodzącym

Bibliografia

  1. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
  2. Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
  3. Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
  4. Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
  5. Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).
  6. Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).
  7. Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758(2014).
  8. Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
  9. Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
  10. Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
  11. Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
  12. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
  13. Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
  14. Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
  15. Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012(2014).
  16. Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
  17. Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja komórek macierzystychtest retencji znacznikahodowla sferoidówanaliza FACSznakowanie CFSEkomórki nabłonkowe prostatytrójwymiarowa błona podstawnamacierzyste komórki nowotworowesekwencjonowanie RNA pojedynczych komórektworzenie organoidów
Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.