Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60378

⸱

16 listopada 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Technology, UiT The Arctic University of Norway, 2Vascular Biology Research Group, Department of Medical Biology, UiT The Arctic University of Norway

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Streszczenie

Całkowita fluorescencja wewnętrznego odbicia (TIRF) jest powszechnie stosowana w mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji pojedynczych cząsteczek, ponieważ zapewnia zwiększony kontrast dzięki sekcji optycznej. Konwencjonalne podejście polega na wykorzystaniu obiektywów TIRF mikroskopu o dużej aperturze numerycznej zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania, co poważnie ogranicza pole widzenia i przepustowość. Przedstawiamy nowatorskie podejście do generowania wzbudzenia TIRF do obrazowania za pomocą falowodów optycznych, zwane nanoskopią opartą na chipie. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób obrazowanie oparte na chipie jest wykonywane w już zbudowanej konfiguracji. Główną zaletą nanoskopii opartej na chipach jest to, że szlaki wzbudzenia i pobierania są rozłączone. Obrazowanie można wtedy wykonać za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, co skutkuje obrazami TIRF o dużym polu widzenia, za cenę niewielkiego zmniejszenia rozdzielczości. Sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby (LSEC) zobrazowano za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM), wykazując rozdzielczość porównywalną z tradycyjnymi mikroskopami superrozdzielczymi. Ponadto demonstrujemy możliwości wysokiej przepustowości, obrazując obszar 500 μm x 500 μm za pomocą soczewki o małym powiększeniu, zapewniającej rozdzielczość 76 nm. Dzięki kompaktowemu charakterowi, obrazowanie oparte na chipie może być montowane w większości popularnych mikroskopów i może być łączone z innymi technikami optycznymi na chipie, takimi jak wykrywanie na chipie, spektroskopia, pułapki optyczne itp. Technika ta idealnie nadaje się zatem do wysokoprzepustowego obrazowania 2D w superrozdzielczości, ale oferuje również ogromne możliwości w zakresie analizy multimodalnej.

Wprowadzenie

Od czasu początkowej demonstracji mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek, opracowano wiele wariantów rozwiązania różnych problemów1,2,3. Jednym z wyzwań, które pozostało, jest obrazowanie dSTORM o dużym polu widzenia. Wiele konfiguracji dSTORM wykorzystuje tę samą soczewkę obiektywową zarówno do wzbudzenia próbki, jak i do jej zobrazowania. Aby zwiększyć pole widzenia, potrzebny jest obiektyw o małym powiększeniu. Soczewki obiektywowe o małym powiększeniu i niskiej aperturze numerycznej (NA) mają zazwyczaj dużą głębię ostrości, co skutkuje zwiększonym sygnałem poza płaszczyzną, co zmniejsza precyzję lokalizacji. Obiektywy TIRF są powszechnie stosowane w celu zwiększenia kontrastu obrazu poprzez zmniejszenie fluorescencji poza płaszczyzną. Dzięki TIRF wzbudzenie jest ograniczone do grubości optycznej około 150 nm od powierzchni za pomocą pola ulotnego4. Soczewki obiektywowe TIRF wymagają dużej NA, co skutkuje małym polem widzenia (FOV) (np. 50 x 50 μm2), co znacznie ogranicza przepustowość. Istnieją jednak alternatywne sposoby generowania pola ulotnego.

Falowód optyczny to struktura, która będzie ograniczać i kierować światło, jeśli zostanie sprzężona ze strukturą. Najczęściej falowody są stosowane w telekomunikacji opartej na światłowodach. Dołożono wszelkich starań, aby opracować zintegrowane falowody 2D jako główny element fotonicznych układów scalonych. Technologia rozwinęła się do tego stopnia, że wytwarzanie nanostrukturalnych falowodów optycznych o niskiej stratności może być rutynowo wykonywane5. Obecnie kilka odlewni na całym świecie może być wykorzystywanych do opracowywania fotonicznych układów scalonych. Falowody kierują światło przez całkowity wewnętrzny współczynnik odbicia, wykazując również ulotne pole na powierzchni. Dzięki starannemu zaprojektowaniu struktury falowodu można osiągnąć wysoką intensywność w polu ulotnym. Próbka umieszczona bezpośrednio na powierzchni falowodu może być zatem również oświetlona przez pole ulotne do zastosowań obrazowych. Pole ulotne zostanie wygenerowane na całej długości i szerokości falowodu, a zatem może być dowolnie duże6.

Prezentujemy nowatorskie podejście do TIRF dSTORM, które oferuje dowolnie duże pole widzenia. Zamiast używać soczewki TIRF zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania, wzbudzamy za pomocą pola ulotnego z falowodów optycznych. Powoduje to rozprzęgnięcie ścieżki światła wzbudzającego i zbierającego, co pozwala na całkowitą swobodę wzdłuż ścieżki światła zbierającego bez uszczerbku dla przekroju optycznego dla danej długości fali zapewnianej przez oświetlenie chipa falowodu. Obiektywy o małym powiększeniu mogą być zatem używane do obrazowania bardzo dużych obszarów w trybie TIRF, chociaż mniejsza NA zmniejszy rozdzielczość boczną. Co więcej, obrazowanie wielokolorowe jest również znacznie uproszczone za pomocą falowodów7, ponieważ kilka długości fal może być prowadzonych i wykrywanych bez konieczności ponownego dostosowywania systemu. Jest to korzystne dla dSTORM, ponieważ niskie długości fal mogą być używane do poprawy mrugania fluoroforu i do obrazowania wielokolorowego. Warto zauważyć, że głębokość penetracji pola ulotnego będzie się zmieniać w funkcji długości fali, choć nie ma to wpływu na sposób wykonywania procedury obrazowania. Chip jest kompatybilny z obrazowaniem żywych komórek8 i jest idealny do zastosowań takich jak integracja mikrofluidyki. Każdy układ scalony może zawierać dziesiątki falowodów, które mogą pozwolić użytkownikowi na obrazowanie w różnych warunkach lub zastosowanie pułapki optycznej9 i spektroskopii Ramana10.

System oparty na chipie działa równie dobrze zarówno dla obrazowania o ograniczonej dyfrakcji, jak i super-rozdzielczości. Podobne podejście zostało wprowadzone w 2005 roku przy użyciu pryzmatu do generowania wzbudzenia pola ulotnego4. Chip fotoniczny również wzbudza się poprzez ulotne pole, ale dzięki nowoczesnym technikom wytwarzania falowodów można generować egzotyczne wzory świetlne za pomocą falowodów. Obecna implementacja nanoskopii opartej na chipach jest ograniczona tylko do obrazowania 2D, ponieważ pole wzbudzenia jest zamknięte wewnątrz powierzchni falowodu. Przyszły rozwój będzie miał na celu zastosowanie technologii 3D. Ponadto opracowywane są inne techniki superrozdzielcze, takie jak mikroskopia oświetlenia strukturalnego, przy użyciu tego samego mikroskopu opartego na chipie11.

Protokół

1. Przygotowanie warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS)

  1. Przygotuj mieszaninę monomeru Sylgard 184 i utwardzacza w proporcji 10:1.
  2. Umieść mieszaninę w komorze próżniowej, aż znikną pęcherzyki powietrza.
  3. Wlej 1,7 g mieszaniny PDMS na środek szalki Petriego o średnicy 3,5 cala.
  4. Umieść szalkę Petriego na uchwycie próżniowym wirówki.
  5. Wiruj szalkę Petriego przez 20 s z prędkością 900 obr./min, z przyspieszeniem 75 obr./min.
  6. Danie utwardzać na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C przez co najmniej 2 godziny.

2. Przygotowanie próbki

  1. Czyszczenie falowodu
    1. Przygotować 100 ml koncentratu detergentu czyszczącego o rozcieńczeniu 1% (tabela materiałów) w wodzie dejonizowanej (DI).
    2. Umieść chip na szklanej szalce Petriego za pomocą pęsety waflowej i całkowicie przykryj roztworem detergentu.
    3. Umieścić szalkę Petriego na płycie grzewczej w temperaturze 70 °C na 10 minut.
    4. Będąc jeszcze na gorącej płycie, przetrzyj powierzchnię wacikiem do tkanek do pomieszczeń czystych.
    5. Usuń wiór z szalki Petriego. Spłucz co najmniej 100 ml wody DI.
    6. Spłukać co najmniej 100 ml izopropanolu, uważając, aby rozpuszczalnik nie wyschł na powierzchni, aby zapobiec powstawaniu plam z parowania.
    7. Spłucz co najmniej 100 ml wody DI. Wydmuchaj wiór do sucha za pomocą pistoletu do azotu.
  2. Przygotowanie komory
    1. Przygotować warstwę 150 μm polidimetylosiloksanu (PDMS) na szalce Petriego (sekcja 1).
    2. Za pomocą skalpela wytnij ramkę o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm z warstwy PDMS.
    3. Podnieś ramkę z szalki Petriego za pomocą pęsety. Umieść go płasko na czystym i wypolerowanym chipie. Próbka jest teraz gotowa do wysiewu komórek.
  3. Etykietowanie fluorescencyjne
    1. Przygotować następujące substancje chemiczne: buforowany fosforanami roztwór soli fizjologicznej, roztwór (roztwory) barwnika, d Bufor do obrazowania STORM.
    2. Po wysianiu komórek usuń chip z podłoża.
    3. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar płynu spoza komory PDMS.
    4. Usunąć bieżący płyn z wnętrza komory PDMS za pomocą pipety, dodając jednocześnie około 60 μl czystego PBS.
      UWAGA: Ilość dodana do komory będzie musiała zostać zmieniona w zależności od wielkości komory. Uważaj, aby nie usunąć wszystkich nośników z powierzchni komórki.
    5. Zastąp PBS 60 μl czystym PBS i pozwól mu inkubować przez 1 minutę.
    6. Powtórz poprzedni krok, tym razem pozwalając mu inkubować przez 5 minut.
    7. Usunąć PBS i zastąpić go 60 μl roztworu barwnika. Pozostawić próbkę do inkubacji na około 15 minut, osłaniając ją przed światłem.
      UWAGA: Ten krok może wymagać znacznych zmian, w zależności od użytego barwnika fluorescencyjnego. Używamy CellMask Deep Red do oznaczania błony komórkowej w tym eksperymencie
    8. Przemyć próbkę PBS jak w krokach 2.3.3-2.3.5.
    9. W tym samym czasie należy usunąć PBS i zastąpić go 40 μl bufora do obrazowania.
      UWAGA: Istnieje kilka różnych obrazowania dla różnych barwników fluorescencyjnych.
    10. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków powietrza pod spodem. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania, aby usunąć nadmiar nośnika.
    11. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar podłoża poza szkiełko nakrywkowe. Oczyść obszar na zewnątrz szkiełka nakrywkowego wilgotnym wacikiem, aby uniknąć kryształów utworzonych przez wysuszone pozostałości mediów zanurzeniowych.

3. Procedura obrazowania

  1. Konfiguracja komponentu
    UWAGA: Ta wersja zestawu składa się z trzech głównych elementów: mikroskopu, stopnia sprzęgającego i stolika na próbkę. Zobacz tabelę materiałów.
    1. Użyj mikroskopu z uchwytem filtra, źródłem światła białego, aparatem fotograficznym i rewolwerem obiektywowym.
    2. Użyj 3-osiowego stopnia sprzęgającego piezoelektrycznego z laserem sprzężonym z światłowodem i soczewką sprzęgającą.
    3. Użyj jednoosiowego ręcznego stolika na próbki z końcówką i pochyleniem oraz uchwytem próżniowym.
    4. Zamontuj zarówno sprzęgło, jak i stolik na próbkę na 2-osiowym stoliku z napędem w celu translacji próbki.
  2. Sprzężenie falowodowe
    1. Umieść wiór na uchwycie podciśnieniowym tak, aby faseta złącza była skierowana w stronę obiektywu sprzęgła. Upewnij się, że chip znajduje się w odległości około jednej ogniskowej od obiektywu sprzęgającego.
    2. Włącz pompę próżniową.
    3. Włącz laser na 1 mW. Z grubsza dostosuj wysokość wióra tak, aby belka uderzała w jego krawędź. Wyłącz laser.
    4. Włącz źródło białego światła. Wybierz obiektyw o małym powiększeniu (np. 10x). Ustaw ostrość mikroskopu na falowodzie.
    5. Przesuń mikroskop wzdłuż falowodu, aby sprawdzić, czy jest dobrze wyrównany ze ścieżką optyczną. Przysunąć mikroskop do krawędzi sprzęgającej.
    6. Włącz laser o mocy 1 mW lub mniejszej. Przesuń mikroskop wzdłuż krawędzi sprzęgającej, aby znaleźć światło lasera. Skoncentruj wiązkę na krawędzi wióra.
    7. Wyreguluj stopień sprzężenia wzdłuż ścieżki optycznej w kierunku, który zmniejsza rozmiar plamki wiązki laserowej, aż zniknie. Belka znajduje się teraz nad lub pod powierzchnią wióra.
    8. Dostosuj wysokość stopnia sprzęgania, aż punkt wiązki pojawi się ponownie i zostanie zmaksymalizowany.
    9. Powtarzaj dwa poprzednie kroki, aż laser utworzy skupiony punkt.
    10. Przesuń zogniskowany punkt na interesujący Cię falowód.
    11. Przesuń mikroskop na niewielką odległość od krawędzi, tak aby skupiona plamka wiązki nie była już widoczna. Wyłącz białe światło.
    12. Dostosuj kontrast. Jeśli falowód jest prowadzony, światło rozproszone wzdłuż falowodu powinno być wyraźnie widoczne.
    13. Dostosuj osie stopnia sprzęgającego, aby zmaksymalizować intensywność rozproszonego światła. Wyłącz laser.
    14. Włącz białe światło. W razie potrzeby dostosuj kontrast.
    15. Przejdź do regionu obrazowania.
  3. Obrazowanie z ograniczeniem dyfrakcji
    1. Ustaw ostrość za pomocą żądanego obiektywu obrazowania. Wyłącz białe światło.
    2. Włóż filtr fluorescencyjny i ustaw moc lasera na 1 mW.
    3. Ustaw czas ekspozycji aparatu na około 100 ms. Dostosuj kontrast zgodnie z potrzebami. Upewnij się, że sprzęgło jest nadal zoptymalizowane.
    4. Zlokalizuj obszar zainteresowania do obrazowania. Włącz zapętlenie piezoelektryczne stage, aby uśrednić tryby.
      UWAGA: Zakres skanowania 20 μm z krokiem 50 nm jest odpowiedni dla większości struktur falowodowych.
    5. Zrób co najmniej 300 zdjęć.
    6. Załaduj przechwycony stos obrazów na Fidżi za pomocą wirtualnego stosu. Z menu obrazu na Fidżi wybierz Stosy i z-project.
    7. Oblicz obraz TIRF, wybierając typ projekcji średnia intensywność.
  4. dObrazowanie STORM
    1. Włącz laser na 1 mW i ustaw czas ekspozycji aparatu na 30 ms.
    2. Dostosuj kontrast i ostrość.
    3. Zwiększaj moc lasera, aż do momentu zaobserwowania mrugania.
      UWAGA: Może to chwilę potrwać, w zależności od intensywności pola ulotnego.
    4. Powiększ mały obszar próbki.
    5. Dostosuj kontrast.
    6. Zrób kilka zdjęć, aby sprawdzić, czy mrugnięcia są dobrze oddzielone.
    7. Dostosuj czas ekspozycji aparatu, aby uzyskać optymalne.
      UWAGA: Optymalizacja mrugania jest złożonym zadaniem, ale dostępnych jest wiele odpowiednich materiałów12.
    8. Włącz piezoelektryczny stage zapętlenie.
    9. Nagraj stos obrazów składający się z co najmniej 30 000 klatek, w zależności od gęstości.
  5. dRekonstrukcja obrazu STORM
    1. Otwórz Fidżi i załaduj stos dSTORM jako obrazy wirtualne.
    2. W razie potrzeby dostosuj kontrast.
    3. Użyj narzędzia prostokąt, aby zaznaczyć obszar do zrekonstruowania.
    4. Otwórz analizę uruchamiania we wtyczce Thunderstorm13 na Fidżi.
    5. Ustaw podstawowe ustawienia kamery w Thunderstorm odpowiadające urządzeniu. Pozostałe parametry domyślne są zazwyczaj zadowalające.
    6. Rozpocznij rekonstrukcję.
      UWAGA: Aby uzyskać pełne pole widzenia, może być konieczne podzielenie danych na podstosy ze względu na duży rozmiar pliku.
    7. Przefiltruj listę lokalizacji dostarczoną przez oprogramowanie do rekonstrukcji, aby usunąć nieokreślone lokalizacje. W razie potrzeby Apple wprowadza dodatkową korektę dryfu.

Wyniki

Mikroskopia TIRF jest popularną techniką, ponieważ eliminuje fluorescencję poza płaszczyzną obrazu, zwiększa kontrast, a tym samym poprawia jakość obrazu, i jest mniej fototoksyczna w porównaniu do innych technik mikroskopii fluorescencyjnej. W porównaniu do tradycyjnego podejścia opartego na obiektywie, mikroskopia oparta na chipie oferuje wzbudzenie TIRF bez ograniczonej przepustowości, która zazwyczaj towarzyszy soczewkom TIRF. Przegląd przedstawionego układu znajduje się na Rysunku 1A. Przedstawiamy obrazy ograniczone dyfrakcyjnie oraz obrazy dSTORM komórek śródbłonka zatokowych wątroby (LSEC) pobranych od myszy. Przedstawiono również obraz LSEC z oznakowaną mikrotubuliną o szerokim polu widzenia, co demonstruje możliwości obrazowania o wysokiej przepustowości. Konwencjonalny układ dSTORM z użyciem soczewki TIRF z imersją olejową (o powiększeniu 60x lub 100x) zazwyczaj obrazuje obszar 50 µm x 50 µm, co jest 100 razy mniejszą powierzchnią niż obraz oparty na chipie na Rysunku 2, wykonany przy użyciu obiektywu 25x, 0,8 NA.

W tej metodzie do wzbudzenia wykorzystujemy wielomodowe falowody z Si3N4. Stosowane chipy składają się z wytrawionej warstwy prowadzącej z 150 nm Si3N4 osadzonej na 2 µm warstwie tlenkowej chipa krzemowego. Schemat chipa znajduje się na Rysunku 1B. Szerokość falowodów może wynosić od 200 do 1000 µm. Szczegóły dotyczące wykonania można znaleźć w innym opracowaniu8. W wyniku interferencji między propagującymi się modami światło wzbudzenia nie będzie miało jednorodnego rozkładu intensywności, lecz przyjmie postać wzoru zmieniającego się przestrzennie. Rysunek 2A przedstawia obraz z wyraźnie widocznymi wzorami modów. Ten wzór interferencyjny zmienia się wraz z pozycją wiązki laserowej na krawędzi falowodu. Aby uzyskać jednorodne wzbudzenie w końcowych obrazach, używamy stolika piezoelektrycznego do oscylacji wzdłuż czoła sprzęgającego. W trakcie procedury obrazowania występuje wystarczająca zmienność wzorów interferencyjnych, aby można było je uśrednić, co eliminuje fluktuacje intensywności na obrazie. Stos obrazów będzie składał się z kilku zdjęć, podobnych do tych na Rysunku 2A, choć z różnymi wzorami, ale po uśrednieniu stos ten pozwoli uzyskać obraz z jednorodnym wzbudzeniem, taki jak na Rysunku 2B. Alternatywnym podejściem jest zastosowanie adiabatycznego zwężania (tapering), aby uzyskać szerokie falowody jednomodowe8,14, co eliminuje konieczność uśredniania modów. Jednak aby utrzymać warunek jednomodowości przy szerokości falowodu 100 µm, konieczna jest długość zwężenia wynosząca kilka milimetrów. Falowody wielomodowe pozwalają uniknąć konieczności stosowania zwężeń i nie nakładają ograniczeń na szerokość struktury. Poza wzorem oświetlenia, wysoki efektywny współczynnik załamania modów stwarza bezprecedensowe możliwości w zakresie mikroskopii strukturalnego oświetlenia11 oraz metod mikroskopii fluktuacyjnej7.

Pierwszym krokiem w obrazowaniu jest zgromadzenie obrazu ograniczonego dyfrakcyjnie. Eksperyment pozwala na uzyskanie stosu około 300 obrazów, a obraz końcowy powstaje poprzez wyciągnięcie średniej z tego stosu. Na Rysunku 2 przedstawiamy obrazowanie ograniczone dyfrakcyjnie oraz obrazowanie dSTORM komórek LSEC znakowanych CellMask Deep Red przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego 60x, 1.2 NA. Rysunek 2A pokazuje niejednorodne oświetlenie spowodowane niewystarczającym uśrednianiem modów. Prawidłowe uśrednianie modów przedstawiono na Rysunku 2B. Rysunek 2C to obraz dSTORM tego samego obszaru, z zaznaczonym fragmentem pokazanym na Rysunku 2D. Komórki śródbłonka naczyniń sinusoidalnych wątroby posiadają pory o rozmiarach nanometrycznych w błonie plazmatycznej15, które są tutaj widoczne. Analiza korelacji pierścieniowej Fouriera (Fourier Ring Correlation) wykazała rozdzielczość 46 nm.

Rysunek 3 przedstawia obraz dSTORM obszaru o wymiarach 500 µm x 500 µm, demonstrując wysoką przepustowość tej techniki. Powiększony obraz z Rysunku 3A, odpowiadający typowemu polu widzenia dSTORM, przedstawiono wraz z obrazem ograniczonym dyfrakcyjnie na Rysunku 3B. W celu oszacowania rozdzielczości przeprowadzono korelację pierścieni Fouriera, która dała wartość 76 nm.

Układ optyczny do obrazowania i spektroskopii, laser, obiektywy i schemat falowodu.
Rycina 1: System obrazowania i falowód. (A) Fotografia systemu obrazowania. Próbka jest umieszczona na uchwycie próżniowym na stole próbkowym, przy czym czoło sprzęgające falowodu jest skierowane w stronę obiektywu sprzęgającego. Laser sprzężony z włóknem oraz obiektyw sprzęgający są umieszczone na piezo-stole 3D. Turret soczewkowy z soczewkami obrazującymi rejestruje obraz z góry i przekazuje go do kamery. (B) Schemat falowodu z soczewkami sprzęgającymi i obrazującymi. Soczewka sprzęgająca wprowadza światło do falowodu. Próbki (pomarańczowe kuleczki) znajdują się wewnątrz szczelnej komory PDMS. Pole ewanescencyjne wzdłuż falowodu wzbudza próbkę, a obiektyw obrazujący rejestruje emitowaną fluorescencję. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek wykazujące rozkład białek; mikroskopia, analiza komórkowa.
Rysunek 2: Obrazy ograniczone dyfrakcją oraz dSTORM. (A) Obraz śródbłonkowe komórek zatok wątrobowych przy niewystarczającym uśrednianiu modów, co skutkuje wyraźnie widocznym wzorem wzbudzenia. (B) Ten sam obszar co w (A), ale z wystarczającym uśrednianiem modów, co prowadzi do homogenicznego wzbudzenia. (C) Obraz ograniczony dyfrakcją dla wstawki w (B); (D) obraz dSTORM tego samego obszaru. (E) Wstawka z obrazu (D), wyraźnie pokazująca fenestracje w błonie plazmatycznej komórki. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe przedstawiają struktury komórkowe. Powiększone wstawki szczegółowo pokazują wewnątrzkomórkowe sieci filamentów.
Rycina 3: Obraz dSTORM szczurzych LSEC. (A) Obraz dSTORM tubuliny barwionej Alexa 647 w szczurzych LSEC z dużym polem widzenia. Pasek skali = 50 µm. (B) Większy zaznaczony obszar z (A) porównujący obraz ograniczony dyfrakcją (lewy dół) oraz obraz dSTORM (prawy góra). (C) Mniejszy zaznaczony obszar z (A). Pasek skali = 1 µm. Obraz ma rozdzielczość 76 nm. Adaptowano za zgodą Helle et al. 20196. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Obrazowanie oparte na chipie jest podobne do konwencjonalnego obrazowania dSTORM. Jakość obrazu można zatem ocenić przy użyciu tych samych metod, co w przypadku tradycyjnego obrazowania dSTORM. Główna różnica dla użytkownika polega na tym, że przezroczyste szkiełko jest wymieniane na nieprzezroczystą płytkę Si. Chociaż wydają się one bardzo różne, obchodzenie się z próbką jest praktycznie analogiczne do szkiełka podstawowego. Frytki są dość wytrzymałe i można je łatwo obsługiwać za pomocą pęsety waflowej. Procedura obrazowania i rekonstrukcji obrazu jest taka sama, jak w zwykłym eksperymencie dSTORM. Konfiguracja funkcjonalnego mikroskopu opartego na chipie nie wymaga żadnych specjalnych komponentów, z wyjątkiem chipów fotonicznych. Więcej szczegółów na temat konfiguracji można znaleźć w poprzedniej pracy 6,7. Chipy użyte w tej pracy zostały wytworzone przy użyciu standardowej fotolitografii8.

Przygotowanie próbki obejmuje przygotowanie komory na próbki. Podczas mocowania ramy PDMS do chipa ważne jest, aby unikać małych fałd lub rozdarć, do których może dostać się powietrze. Jeśli PDMS złoży się podczas zakładania, po prostu wyjmij go ostrożnie za pomocą pęsety i ponownie zamocuj. Gdy próbka jest gotowa w komorze PDMS, należy docisnąć do niej szkło nakrywkowe, uszczelniając obszar. Ważne jest, aby unikać pęcherzyków powietrza, które mogą powstać podczas zakładania szkła nakrywkowego. Jeśli utworzy się pęcherzyk powietrza, delikatnie wyjmij szkło nakrywkowe i dodaj PBS do komory próbki, aby upewnić się, że próbka jest pokryta. Przygotowanie i zamocowanie szkiełka nakrywkowego można następnie po prostu przerobić.

Sprzężenie światła z falowodem jest uproszczone przy użyciu protokołu zaproponowanego w tym artykule. Istnieje jednak kilka typowych wyzwań, które mogą ograniczać sprzężenie. Po pierwsze, jeśli chip nie został odpowiednio wyczyszczony, a wszelkie resztki PBS całkowicie usunięte, na falowodzie może znajdować się brud lub skrystalizowany PBS. Może to spowodować duże straty, skutkujące bardzo małą mocą w obszarze obrazowania. Użycie wilgotnego wacika do oczyszczenia obszaru na zewnątrz szkła nakrywkowego może znacznie poprawić moc. Po drugie, jeśli aspekt sprzężenia falowodu zostanie uszkodzony (np. przez niewłaściwą obsługę), straty sprzężenia mogą drastycznie wzrosnąć. Oględziny optyczne krawędzi zwykle łatwo ujawniają wszelkie uszkodzenia. Cały aspekt sprzężenia chipa może być starannie wypolerowany, podobnie jak światłowód, i zapewni gładką fasetę sprzężenia, co następnie zwiększa moc sprzężoną.

Po sprzężeniu światła procedura obrazowania jest taka sama, jak w każdej konwencjonalnej konfiguracji dSTORM. Jeśli obraz ma niejednorodne wzbudzenie, jak pokazano na rysunku 2A, najprawdopodobniej uśrednianie modów nie działało dobrze. Dwa najczęstsze powody takiego stanu rzeczy to: 1) zbyt mała liczba przechwyconych obrazów w celu utworzenia średniego stosu oraz 2) zbyt krótka odległość oscylacji/zbyt duży rozmiar kroku. Zebranie zbyt małej liczby obrazów może pominąć pewne wzorce wzbudzenia, a zatem średnia będzie niejednorodna. Można to łatwo rozwiązać, zwiększając liczbę obrazów w średnim stosie. Zbyt krótka odległość oscylacji może również skutkować niejednorodnym obrazem, ponieważ nie jest wzbudzana wystarczająca liczba wzorców modów. Można to również łatwo rozwiązać, zwiększając odległość oscylacji i/lub zmniejszając rozmiar kroku. W tej pracy użyliśmy stolika piezoelektrycznego do zeskanowania wejściowej wiązki laserowej o grubości ponad 20 μm i uzyskania co najmniej 300 obrazów. Innym podejściem może być użycie szybkich luster galwowych do skanowania światła w poprzek fasety falowodu wejściowego w ciągu jednego czasu akwizycji, takiego jak 10-30 ms. Ta opcja jest odpowiednia do obrazowania TIRF na żywych komórkach, gdzie organelle subkomórkowe są w ciągłym ruchu.

Oparty na chipie dSTORM oferuje niespotykane wzbudzenie TIRF o dużej powierzchni, co sprawia, że idealnie nadaje się do obrazowania o wysokiej przepustowości. Kompaktowy charakter pozwala na doposażenie w systemy komercyjne, w których chip można umieścić do góry nogami w celu odwróconych konfiguracji lub można opracować przezroczyste podłoża. Chipy są produkowane masowo i mogą być modyfikowane w celu zaspokojenia wielu potrzeb. Obecnie głównym ograniczeniem jest to, że jest ograniczony do 2D. Pole ulotne jest dostępne tylko w odległości około 200 nm od powierzchni falowodu, więc tylko fluorofory w tym obszarze będą wzbudzane. Ogólnie rzecz biorąc, dziedzina zintegrowanej optyki oferuje wiele możliwości dla mikroskopii opartej na chipach w najbliższej przyszłości, rozwiązując nowe problemy związane z obrazowaniem, a także zapewniając nowe możliwości już istniejącym.

Oświadczenia

Firma B.S. Ahluwalia złożyła wniosek patentowy GB1606268.9 na nanoskopię optyczną opartą na chipach. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Europejskiej Radzie ds. Badań Naukowych (grant nr 336716 dla B.S.A.). Autorzy pragną również podziękować Irati Lagfragua za jej nieocenioną pomoc w nagraniu i montażu filmu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-osiowy stolik na próbkiStanda7T173-20
2-osiowy stolik do translacji próbekMad City LabsNa zamówienie
3-osiowy stolik NanoMaxKorpus mikroskopu ThorlabsMAX311D
BXFMOlympusOLY-LSM-037018
CellMask Deep Red, Life technologiesThermoFisherC10046
Waciki klasy czystejTechnologia MRCMFS-758
Laserświatłowodowy CoboltFlamenco
Uchwyt filtraDomowe
Hellmanex III, Hellma GmbhSigma-AldrichZ805939Koncentrat detergentu czyszczącego
IsopropanolSigma-Aldrich563935-1L
KL 1600 LEDOlympusOLY-LSM-E0433314
Olympus Soczewka sprzęgającaOlympusLMPLFLN 50x/0.5
Orca Flash 4.0 V2Hamamatsu
PBS tabletkiSigma-AldrichP4417-50TABWymieszaj wg opisów
SYLGARD 184 Elastomer silikonowy 1,1 kg zestawDow1673921
Stolik uchylno-uchylnyThorlabsAPR001
Uchwyt próżniowyThorlabsHWV001
Pęseta waflowa Typ 2WAgar naukowyAGT5051

Bibliografia

  1. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
  2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  3. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  4. Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
  5. Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).
  6. Helle, ØI., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
  7. Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).
  8. Tinguely, J. C., Helle, ØI., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
  9. Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
  10. Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
  11. Helle, ØI., Dullo, F. T., Lahrberg, M., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV. , https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019).
  12. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  13. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  14. Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
  15. Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1(2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia TIRFobrazowanie dSTORMwzbudzanie falowodoweobrazowanie wysokoprzepustowemikroskopia superrozdzielczahepatoidalne kom rki r db onka sinusoidalnegofalow d optycznyfale zanikaj cenanoskopia na chipie
Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.