Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Summary

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej do wytwarzania trójwymiarowych matryc fluorescencyjnych znaczników referencyjnych osadzonych w hydrożelach na bazie poli(glikolu etylenowego) do wykorzystania jako platformy mikroskopii siły pociągowej bez odniesień. Korzystając z tych instrukcji, pomiar odkształcenia materiału 3D i obliczanie trakcji komórkowych jest uproszczone, aby ułatwić pomiary siły pociągowej o wysokiej przepustowości.

Abstract

Kwantyfikacja deformacji materiału wywołanej przez komórkę dostarcza użytecznych informacji na temat tego, jak komórki wyczuwają i reagują na fizyczne właściwości swojego mikrośrodowiska. Chociaż istnieje wiele podejść do pomiaru naprężeń materiału wywołanych przez komórkę, tutaj przedstawiamy metodologię monitorowania odkształcenia z rozdzielczością submikronową w sposób bezreferencyjny. Korzystając z procesu modelowania fotolitograficznego aktywowanego dwoma fotonami, pokazujemy, jak generować mechanicznie i bioaktywnie przestrajalne podłoża syntetyczne zawierające wbudowane matryce fluorescencyjnych znaczników odniesienia w celu łatwego pomiaru trójwymiarowych (3D) profili deformacji materiału w odpowiedzi na przyczepność powierzchni. Korzystając z tych substratów, profile napięcia komórek mogą być mapowane przy użyciu pojedynczego stosu obrazów 3D interesującej komórki. Naszym celem przy tej metodologii jest uczynienie mikroskopii sił trakcyjnych bardziej dostępnym i łatwiejszym do wdrożenia narzędziem dla badaczy zajmujących się procesami mechanotransdukcji komórkowej, zwłaszcza nowicjuszy w tej dziedzinie.

Introduction

Mikroskopia siły trakcyjnej (TFM) to proces przybliżania trakcji komórkowych za pomocą interpolowanych pól przemieszczenia markerów odniesienia generowanych przez przylegającą i kurczliwą komórkę. Korzystając z TFM, można badać wpływ sygnałów mechanicznych w środowisku zewnątrzkomórkowym na ważne procesy komórkowe, takie jak proliferacja, różnicowanie i migracja^{1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12}. Niestety, wiele istniejących podejść może być trudnych do wdrożenia lub wymagać znajomości wysoce wyspecjalizowanych narzędzi analitycznych i obliczeniowych, co utrudnia korzystanie z TFM niedoświadczonym badaczom. Opisujemy metodologię generowania platformy TFM, która eliminuje niektóre trudności w analizie, a jednocześnie zapewnia pozyskiwanie danych o wysokiej przepustowości.

Spośród istniejących metod TFM, najczęściej używane do ilościowego określania naprężeń materiału polegają na włączeniu małych markerów fluorescencyjnych (zazwyczaj nano- lub mikrometrowych kulek fluorescencyjnych) do odkształcalnego hydrożelu, takiego jak poliakrylamid (PAA) lub poli(glikol etylenowy) diakrylan (PEGDA)^13,14,15. Te podejścia oparte na koralikach zapewniają możliwość gęstego grupowania znaczników odniesienia wokół komórki będącej przedmiotem zainteresowania, aby zmaksymalizować próbkowanie przemieszczenia. Niestety, rozmieszczenie kulek w całym hydrożelu nie może być bezpośrednio kontrolowane, więc organizacja przestrzenna jest losowa. To losowe rozmieszczenie prowadzi do problemów, takich jak koraliki, które są zbyt blisko siebie, aby można je było dokładnie rozwiązać, lub tak się rozprzestrzeniają, że plamy podłoża dostarczają danych o niskiej jakości. Niemożność przewidzenia, gdzie znajdują się markery referencyjne w przypadku braku komórek, stwarza również ograniczenie, zgodnie z którym dla każdego zebranego zestawu danych trakcyjnych komórek musi być również uchwycony dodatkowy obraz referencyjny leżących poniżej markerów w stanie swobodnym. Obraz referencyjny jest wymagany, aby przemieszczenie w obrazie naprężonym można było przybliżyć jako różnicę między obrazami naprężonymi i nieobciążonymi. Aby osiągnąć stan relaksu, mierzone komórki są albo chemicznie zrelaksowane, albo całkowicie usunięte. Proces ten często uniemożliwia uzyskanie dalszych pomiarów eksperymentalnych, hamuje długoterminowe badania komórek i ogranicza przepustowość. Obraz referencyjny wymaga również technik rejestracji obrazu, aby uwzględnić dryft, który mógł wystąpić podczas eksperymentów, często prowadząc do kłopotliwego ręcznego dopasowywania obrazów stanu naprężenia do obrazów referencyjnych.

Inne metody TFM uznane za wolne od odniesień, implementują pewną formę kontroli nad dystrybucją znaczników referencyjnych, czy to poprzez litografię w wysokiej rozdzielczości, druk mikrokontaktowy, czy mikroformowanie^{16,17,18,19,20}. TFM bez odniesień osiąga się przy założeniu, że stan zrelaksowany dla każdego markera odniesienia można przewidzieć na podstawie tego, jak pozycje markerów zostały określone podczas procesu wytwarzania. Metody te pozwalają na pełne uchwycenie stanu napięcia komórki w ramach pojedynczego przechwytywania obrazu, w którym zmierzone są przemieszczenia znaczników odniesienia w porównaniu z domniemanym odniesieniem, które można wywnioskować z geometrii znacznika odniesienia. Chociaż spójność w umieszczaniu znaczników jest zwykle osiągana przy użyciu tych platform, na ogół cierpią one na własne niedociągnięcia w stosunku do powszechnie stosowanych podejść opartych na koralikach, w tym: 1) zmniejszona rozdzielczość trakcji; 2) zmniejszona dokładność przemieszczeń poza płaszczyzną (w niektórych przypadkach całkowita niemożność pomiaru); oraz 3) zmniejszona możliwość dostosowania podłoży i materiałów platformy (np. prezentacja ligandów, właściwości mechaniczne).

Aby zaradzić tym niedociągnięciom, zaprojektowaliśmy nową platformę TFM bez referencji. Platforma wykorzystuje chemię aktywowaną wielofotonami do sieciowania niewielkiej objętości fluoroforu w określonych lokalizacjach 3D w hydrożelu, które służą jako markery referencyjne do pomiaru naprężenia materiału. W ten sposób zaprojektowaliśmy platformę, która działa podobnie do podejść opartych na koralikach, ale ze znaczącą korzyścią polegającą na tym, że znaczniki odniesienia są zorganizowane w siatkowe tablice, co pozwala na śledzenie odkształceń materiału bez odniesień. Ta nieruchomość bez referencji ma wiele zalet. Przede wszystkim pozwala na nieinwazyjne monitorowanie stanów trakcji komórkowej (tj. omija konieczność rozluźniania lub usuwania komórek w celu uzyskania pozycji odniesienia przemieszczonych markerów odniesienia). To był nasz główny cel przy projektowaniu tego systemu, ponieważ zamierzaliśmy włączyć inne metody analityczne w połączeniu z TFM, co może być trudne w przypadku destrukcyjnych podejść TFM do punktu końcowego. Po drugie, użycie domniemanego odniesienia opartego na tablicach siatkowych pozwala na niemal całkowitą automatyzację analizy przemieszczeń. Regularność tablic tworzy przewidywalny przepływ pracy, w którym występowanie wyjątkowych przypadków (tj. danych z komórek próbki zawierających nieprzewidziane artefakty, takie jak nieoptymalne odstępy między znacznikami lub niezgodności rejestracji) może być utrzymane na minimalnym poziomie. Po trzecie, rezygnacja z konieczności uzyskiwania obrazu referencyjnego zapewnia swobodę monitorowania wielu komórek na jednej próbce przez dłuższy czas. Kontrastuje to z tradycyjnymi podejściami opartymi na kulkach, w których, w zależności od wierności zautomatyzowanych ruchów stolika mikroskopu, błędy w pozycjonowaniu mogą się kumulować i zwiększać trudności w prawidłowym rejestrowaniu obrazów referencyjnych na obrazach napięcia komórek. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta ułatwia większą przepustowość w gromadzeniu danych o napięciu komórkowym.

Dzięki temu protokołowi mamy nadzieję zapoznać czytelników z techniką dwufotonowej, laserowej litografii skaningowej, którą zaimplementowaliśmy do wygenerowania tej niewymagającej odniesień platformy TFM do pomiaru składowych trakcyjnych w płaszczyźnie i poza płaszczyzną generowanych przez komórki rozsiane na powierzchni. W tym protokole nie uwzględniono syntezy niektórych składników monomerycznych. Ogólnie rzecz biorąc, reakcje te obejmują prawie identyczne schematy reakcji syntezy "jednogarnkowej" opisane wcześniej²¹, a alternatywy dla tych produktów można również kupić. Naszym celem jest również zapoznanie czytelników z narzędziami opartymi na oprogramowaniu, które stworzyliśmy, aby promować wykorzystanie dostępnych na rynku laserowych mikroskopów skaningowych jako narzędzi do druku 3D oraz ułatwić analizę przemieszczeń znaczników odniesienia.

Protocol

1. Fotopolimeryzacja hydrożelu na bazie PEGDA

1. Zbieranie odczynników
   1. Zebrać fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP), dikrylan poli(etylenu) glikolu o sile 3,4 kDa (PEGDA), n-winylopirolidon (NVP), AlexaFluor 488 oznaczony PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 znakowany PEGDA (PEG-633) i peptyd PEGylowany RGDS (PEG-RGDS) z odpowiednich zamrażarek i doprowadzić każdy z nich do temperatury pokojowej.
   2. W oddzielnych bursztynowych probówkach do mikrowirówek odmierz 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633 i 6 mg peptydu RGDS.
2. Przygotowanie roztworu prepolimerowego
   1. Rozpuścić LAP w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4). Użyć 200 μl rozpuszczonego roztworu LAP do rozpuszczenia PEGDA. Następnie użyj 200 μl roztworu PEGDA do rozpuszczenia PEG-RGDS.
      UWAGA: Jeśli pożądana jest kontrola kształtu komórki, należy pominąć rozpuszczanie PEG-RGDS w bazowym roztworze prepolimeru hydrożelowego, ponieważ zostanie on dodany za pomocą dwufotonowej, laserowej litografii skaningowej w dalszej części protokołu.
   2. Użyj 80 μL PBS do rozpuszczenia PEG-488. Dodać 2,5 μl tego roztworu do roztworu prepolimeru.
      UWAGA: PEG-488 da końcowemu hydrożelowi sygnał fluorescencyjny, który może być wykorzystany do nawigacji podczas modelowania, a stężenie może być modyfikowane w celu zmiany intensywności sygnału.
   3. Przefiltruj cały roztwór prepolimeru przez filtr z politetrafluoroetylenu (PTFE) o wielkości 0,2 μm, aby usunąć wszelkie cząstki, które mogą być obecne w roztworze. Jeśli reagenty są prawidłowo zsyntetyzowane, filtr nie powinien się zatkać.
3. Fotopolimeryzacja hydrożelu bazowego
   1. Umieścić 3 μl roztworu prepolimeru na cienkim płaskim arkuszu alkanów perfluoroalkoksylowych (PFA). Umieść płaskie paski polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 150 μm otaczając kroplę roztworu prepolimeru, ale nie stykając się z nią. Umieść akrylowo silanizowane szkiełko nakrywkowe^21,22,23,24 na PDMS — z kroplą prepolimeru wyśrodkowaną pod szkiełkiem nakrywkowym — aby spłaszczyć kroplę prepolimeru do grubości przekładek PDMS.
   2. Wystaw warstwowy roztwór prepolimeru na działanie światła UV, aż hydrożel zostanie całkowicie uformowany (około 1 min przy 14 mW/^cm2 światła 370-400 nm).
   3. Ostrożnie oddziel szkiełko nakrywkowe od przekładek PDMS i przymocuj do szalki Petriego z otwartym dnem za pomocą wysokowydajnego, dwustronnego kleju akrylowego. Wywieraj nacisk na powierzchnię styku kleju, aby uzyskać pełne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym, klejem i szalką Petriego - uważając, aby nie pęknąć szkła.
   4. Wypłucz hydrożel na szalce Petriego za pomocą sterylnie przefiltrowanego PBS, aby zminimalizować zanieczyszczenia biologiczne i cząstki stałe.
   5. W razie potrzeby powtórz kroki 1.3.1-1.3.4, aby uzyskać żądaną liczbę hydrożeli.
   6. Dodaj 8 μl NVP do pozostałych 800 μl roztworu LAP i trzymaj ten roztwór, jak również nierozpuszczony PEG-633, aż będzie gotowy do modelowania.
      UWAGA: Roztwór LAP z NVP jest bardzo wrażliwy na światło i polimeryzuje, jeśli nie jest przechowywany w ciemności. Owinięcie tuby folią aluminiową może pomóc w wydłużeniu jej okresu przydatności do spożycia.

2. Tworzenie instrukcji tworzenia wzorów

1. Projektowanie obrazu binarnego
   1. Aby stworzyć wirtualną maskę do przepisywania układów znaczników odniesienia, użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów lub rysowania, aby utworzyć obraz o proporcjach 100:1 (np. 2000 pikseli długości x 20 pikseli szerokości).
   2. Utwórz rząd 100 równomiernie rozmieszczonych białych pikseli na czarnym tle wyśrodkowanym wzdłuż długiej osi obrazu.
   3. Zapisz ten obraz jako *.tif filetype.
      UWAGA: Jeśli wymagana jest kontrola nad kształtem komórki^{21,25,26,27,28}, utwórz dodatkową maskę wirtualną. Użyj kwadratowego płótna obrazu i stwórz pozytywne białe elementy na czarnym tle. W celu przybliżenia odpowiedniego rozmiaru dla białych cech (które ostatecznie będą wspierać adhezję komórek), należy założyć, że całkowity rozmiar obrazu jest równoważny rozmiarowi pola widzenia mikroskopu używanego do laserowej litografii skaningowej.
2. Konwersja obrazu binarnego na maskę cyfrową
   1. Pobierz funkcje LSM-ROI-Generator dostępne bezpłatnie w repozytorium oprogramowania²⁹.
   2. Otwórz Matlab i znajdź katalog z pobranymi plikami funkcji. Po wejściu do katalogu otwórz skrypt run_script.m Matlab i uruchom skrypt.
   3. Wybierz binarny plik *.tif do konwersji. Następnie wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki regionów.
   4. Wprowadź żądany ostateczny rozmiar wybranego obrazu, w mikronach. Obraz wejściowy zostanie przeskalowany i zwymiarowany tak, aby odpowiadał tym parametrom. Aby cały obraz zmieścił się w polu widzenia mikroskopu, całkowity rozmiar obrazu musi być mniejszy lub równy rozmiarowi pola widzenia mikroskopu.
   5. Jeśli tworzysz tablicę pojedynczych pikseli, w opcjach generatora ROI upewnij się, że odznaczyłeś pole wyboru Usuń w obszarze Małe obszary/Pojedyncze piksele, aby zaznaczyć pole wyboru Kwadraty i odznaczyć opcję Użyj w obszarze Poziome linie podziału. Następnie kliknij przycisk OK.
      UWAGA: W przypadku tworzenia pliku regionów w celu utworzenia wzorców pojedynczych komórek odpowiednie są opcje domyślne.
   6. Znajdź wynikowy plik *.ovl w wcześniej określonym folderze. Plik ten należy przyłożyć do mikroskopu, aby załadować żądane obszary sterujące migawką laserową podczas dwufotonowej litografii skaningowej laserowej.

3. Wytwarzanie tablic znaczników odniesienia

1. Moczenie hydrożelu bazowego
   1. W warunkach słabego oświetlenia dodaj 200 μl roztworu LAP/NVP do AF633 (oba przygotowane w kroku 1). Dokładnie wymieszaj, chroniąc przed światłem.
   2. Usunąć cały roztwór PBS z szalki Petriego zawierającej hydrożel PEGDA z kroku 1.
   3. Dodaj rozpuszczony PEG-633 do hydrożelu, aby utworzyć kroplę, która całkowicie obejmuje podstawowy hydrożel.
      UWAGA: Jeśli otwór w szalce Petriego jest tylko nieznacznie większy niż hydrożel, może służyć jako studnia do przechowywania roztworu do modelowania. W przeciwnym razie upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest całkowicie suche przed dodaniem roztworu do modelowania, w przeciwnym razie może spłynąć z hydrożelu, powodując odwodnienie hydrożelu podczas modelowania.
   4. Załadować szalkę Petriego na uchwyt próbki na stoliku mikroskopu i nałożyć pokrywkę na szalkę Petriego. Pozwól, aby roztwór do wzoru wsiąkł w hydrożel przez co najmniej 30 minut w ciemności.
      UWAGA: W tym czasie namaczania mikroskop można włączyć i skonfigurować. Użycie lasera 488 nm do obrazowania hydrożelu podczas namaczania jest w porządku.
2. Konfiguracja mikroskopu
   1. Za pomocą linii laserowej o długości fali 488 nm i filtrów odpowiednich do obrazowania AlexaFluor 488 zlokalizuj hydrożel za pomocą sygnału PEG-488. Zablokuj zbieranie dłuższych fal emisyjnych z detektora, ponieważ będą one nasycone sygnałem z PEG-633.
   2. Znajdź środek hydrożelu w płaszczyźnie XY za pomocą pionowych i poziomych skanów płytek i wyzeruj tutaj pozycję sceny.
   3. Znajdź powierzchnię hydrożelu za pomocą skanów liniowych i funkcji z-stack. Wyzeruj tutaj pozycję ostrości. Wypoziomuj hydrożel, powtarzając te skany liniowe z dala od środka XY, aby określić położenie powierzchni i wyregulować dociskowe do stolika mikroskopu.
   4. W obszarze roboczym oprogramowania mikroskopu utwórz osobny plik eksperymentu do tworzenia fotowzorów. Ustaw moc wielu fotonów na 1,8% (15,5 mW przy 740 nm mierzona na tylnej aperturze obiektywu), a prędkość skanowania na 6 (0,1 μm/μs). Dostosuj rozmiar ramki obrazu w pikselach, aby uzyskać rozmiar piksela 0,1 μm na piksel i współczynnik proporcji 100:1.
   5. Załaduj plik regionów (*.ovl) utworzony w kroku 2.2 na kartę regionów. Użyj makra, aby ustawić wszystkie regiony do pobrania.
   6. Włącz funkcję z-stack i ustaw odstępy na 3,5 μm, aby uzyskać całkowitą głębokość 28 μm i całkowitą liczbę z-slices 9.
   7. Użyj funkcji pozycji, aby ustawić określone miejsca na hydrożelu, w których zostaną wykonane matryce znaczników odniesienia.
      UWAGA: Położenie z tych pozycji będzie dyktować środkową pozycję każdego stosu z; Podczas umieszczania pozycji upewnij się, że każda pozycja zagwarantuje, że wzorzysta objętość będzie nakładać się na hydrożel we wszystkich miejscach na powierzchni.
   8. Użyj funkcji kafelka, aby określić dodatkowe wiersze i kolumny w każdej pozycji. Uważaj, aby uniknąć nakładania się na siebie regionów we wzorze. Najlepiej upewnić się, że wzorzyste obszary są wystarczająco blisko, aby usunąć puste i bezużyteczne lokalizacje między pozycjami.
3. Fotomodelowanie układów znaczników odniesienia
   1. Gdy czas namaczania zbliża się do znaku 30 minut, co 5 minut wykonuj kolejne skany linii z-stack powierzchni hydrożelu, aby sprawdzić, czy nie ma pęcznienia na podstawie zmian położenia powierzchni względem wyzerowanej pozycji ostrości.
   2. Jeśli w ciągu 5 minut nie nastąpi żadna zmiana położenia powierzchni, załaduj i uruchom ustawienia szyku utworzone w kroku 3.2.4
   3. Po zakończeniu eksperymentu z wzorem użyj lasera 488 nm, aby sprawdzić, czy powierzchnia hydrożelu nie porusza się podczas modelowania.
      UWAGA: Jeśli powierzchnia hydrożelu nie znajduje się w tej samej pozycji, co przed modelowaniem, istnieje kilka scenariuszy. Hydrożel nie osiągnął równowagi pęcznienia przed modelowaniem, hydrożel zaczął wysychać podczas modelowania lub mikroskop doświadczył dryfu z. Źródło tej translacji powierzchni powinno zostać zidentyfikowane i skorygowane w kolejnych przebiegach tworzenia wzoru.
   4. Usunąć hydrożel z mikroskopu i odessać roztwór PEG-633 z szalki Petriego.
      UWAGA: Hydrożel jest nadal niezwykle wrażliwy na światło. Utrzymywanie hydrożelu w ciemności jest bardzo ważne, dopóki całe płukanie nie zostanie zakończone.
   5. Wypłucz hydrożel 3 razy sterylnie przefiltrowanym PBS, upewniając się, że całkowicie usunąłeś płukanie między każdym kolejnym płukaniem. Powtarzaj to potrójne płukanie co 15 minut przez 1 godzinę.
   6. Pozostaw hydrożel do spłukania w PBS przez noc.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
   7. Trzykrotnie spłucz hydrożel PBS. Następnie szybko trzykrotnie spłucz hydrożel 200-procentowym roztworem etanolu, a następnie ponownie trzykrotnie spłucz PBS. Nie pozwól, aby hydrożel znajdował się w 200-procentowym etanolu przez dłuższy czas.
      UWAGA: Niektóre składniki roztworu do modelowania mogą wypaść z roztworu i osadzić się na powierzchni hydrożelu i pojawić się jako stała warstwa fluorescencji (o grubości ~1-5 mikronów) przy oświetleniu 633 nm. Płukanie 200-procentowym etanolem powinno usunąć te niechciane składniki.
4. Wykorzystanie kolejnych fotowzorców do generowania wzorców pojedynczych komórek (opcjonalnie)
   UWAGA: Jeśli pożądana jest kontrola nad obszarem i kształtem rozlewu komórek, można wykonać wiele rund tworzenia wzoru. Żel bazowy musi mieć PEG-RGDS pominięty w swoim pierwotnym składzie. Zaleca się, aby wzór tablic markerów odniesienia był wykonywany na końcu, aby uniknąć wybielania fluorescencyjnych markerów odniesienia.
   1. Rozpuścić 20 mg PEG-RGDS w roztworze LAP/NVP przygotowanym w kroku 1.
   2. Powtórz kroki 3.1 – 3.3 używając roztworu PEG-RGDS zamiast roztworu PEG-633. Użyj odpowiedniego pliku regionów, który definiuje wzorce pojedynczych komórek (instrukcje znajdują się w kroku 2).
      UWAGA: Aby zobrazować tablice wzorców PEG-RGDS, istnieje kilka opcji. Można użyć fluorescencyjnego wariantu PEG-RGDS^21,30 lub PEG-RGDS może być domieszkowany fluorescencyjnym PEG. Zalecane: Alternatywnie, linia laserowa 488 nm może być uruchomiona w połączeniu z wielofotonowym laserem modelującym w celu wybielenia sygnału PEG-488 w hydrożelu bazowym, tworząc obszary niefluorescencyjne, które zbiegają się z włączeniem RGDS.

4. Wizualizacja tablic znaczników odniesienia

1. Uzyskiwanie obrazu z-stack sfabrykowanej tablicy
   1. Zastąp PBS na szalce Petriego pożywką komórkową używaną do hodowli komórek.
      UWAGA: Pożywka wolna od czerwieni fenolowej jest zalecana do stosowania podczas akwizycji obrazu, aby zapobiec fototoksyczności.
   2. Po 1 godzinie czasu namaczania należy użyć szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w moduł oświetlenia strukturalnego i soczewkę obiektywową zanurzoną w wodzie o dużym powiększeniu, aby uwidocznić hydrożele za pomocą zestawu filtrów odpowiedniego dla fluorescencyjnych markerów odniesienia.
   3. Zbierz stos obrazów o wysokiej rozdzielczości (w odstępach 0,4 μm w Z) obejmujący co najmniej 20 μm głębokości od powierzchni hydrożelu do hydrożelu w obszarze wzorzystym, upewniając się, że górna granica stosu z obejmuje co najmniej 1-2 obrazy fizycznie nad wzorzystym obszarem (tj. tam, gdzie fluorescencyjne znaczniki odniesienia nie są już widoczne i występuje tylko szum).
      UWAGA: Akwizycja tego stosu obrazów jest konieczna, aby sprawdzić, czy wszystkie parametry wzorca są poprawne i mogą być analizowane wraz z danymi komórek w kroku 5.3.

5. Wykonywanie TFM za pomocą hydrożeli fotowzorzystych

1. Komórki wysiewu
   UWAGA: Aby zachować sterylność, należy przestrzegać wszystkich standardowych praktyk hodowli tkankowych.
   1. Przed wysiewem komórek należy postępować zgodnie ze standardowymi protokołami dla odpowiedniej linii komórkowej w celu hodowli i utrzymania komórek.
   2. (Opcjonalnie) Jeśli istnieje obawa co do sterylności hydrożelu, należy inkubować hydrożel przez 24 godziny w pożywce zawierającej antybiotyki, a następnie przepłukać normalną pożywką.
   3. Aby wysadzić komórki, najpierw ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w końcowej objętości pożywki, która ma być użyta na hydrożelowej szalce Petriego.
   4. Usuń cały roztwór z naczynia hydrożelowego i zastąp go pożywką wypełnioną komórkami.
   5. Pozostaw hydrożel w spokoju w pożywce wypełnionej komórkami przez 10 minut.
   6. Ostrożnie przenieś szalkę Petriego do inkubatora. Utrzymuj komórki w inkubatorze przez 4 godziny lub do momentu, gdy komórki będą widocznie przylegające.
   7. Zastąp pożywkę obciążoną komórkami pożywką bezkomórkową, aby usunąć nieprzylegające komórki.
2. Pozyskiwanie obrazów komórek i markerów odniesienia
   1. Ustawić temperaturę w komorze inkubacyjnej pod mikroskopem na 37 °C i CO₂ do 5% i pozwolić komorze osiągnąć nastawy.
   2. Umieść szalkę Petriego na uchwycie próbki i zlokalizuj wzorzyste obszary.
   3. Zlokalizuj komórkę zainteresowania (COI) i uzyskaj przesłany lub fluorescencyjny obraz COI.
      UWAGA: Ten obraz będzie używany do segmentacji granicy komórki podczas analizy, więc obraz powinien wyraźnie wizualizować granice komórek.
   4. Uzyskaj stos z tablicy z wzorem poniżej COI, jak w kroku 4.1.4.
   5. Uzyskaj drugi zestaw przesyłanych lub fluorescencyjnych obrazów komórki.
      UWAGA: Porównaj drugi zestaw obrazów z pierwszym, aby określić, czy obserwuje się uszkodzenie komórek spowodowane fototoksycznością i czy należy dostosować ustawienia akwizycji obrazu. Komórki, które kurczą się po ekspozycji, prawdopodobnie doznały znacznych efektów fototoksycznych, które mogą wpływać na wyniki.
   6. Powtórzyć kroki 5.2.3–5.2.5 dla każdego COI.

6. Analiza obrazów

1. Przygotowanie plików graficznych do analizy
   1. Korzystając z danych zebranych w kroku 5.2, przygotuj przycięty stos obrazów obszaru wokół COI w taki sposób, aby dolny obraz (pierwszy obraz) stosu reprezentował pierwszą klatkę, w której: (1) >80% kolumn znaczników z wzorem jest widocznych, (2) najwyższy obraz (ostatni obraz) w stosie nie zawiera już żadnych widocznych znaczników odniesienia (tj. powyżej powierzchni hydrożelu) oraz (3) znajduje się co najmniej 20 μm nienaprężonych markerów fiducial otaczających COI.
      UWAGA: Kadrowanie obrazów znacznie skraca czas obliczeń podczas analizy. Kod analizy w późniejszych krokach można uruchomić bez przycinania obrazów, ale nie jest to zalecane.
   2. Utwórz przycięty obraz przesyłanego i/lub fluorescencyjnego, aby dopasować go do kadrowania XY stosu w poprzednim kroku.
   3. Użyj przyciętego obrazu transmitowanego lub fluorescencyjnego — w zależności od tego, który z nich jest bardziej reprezentatywny dla kształtu komórki — aby podzielić obraz na segmenty ręcznie (obrysować granicę komórki) lub za pomocą narzędzi do przetwarzania obrazu.
   4. Przekształć ten obraz w obraz binarny, w którym wnętrze komórki jest czarne (tj. intensywność = 0), a obszar otaczający komórkę jest biały (tj. intensywność ≠ 0). Zapisz ten obraz jako Mask.tif binarny.
   5. Dla każdego COI zbierz plik stosu obrazów, przesłany plik obrazu i binarny plik maski w jednym folderze.
2. Uruchamianie skryptów analitycznych na obrazach
   1. Sklonuj lub pobierz funkcje analizy TFM dostępne bezpłatnie w repozytorium oprogramowania²⁹. Należy pobrać całe repozytorium, ponieważ w podfolderach znajduje się znaczna liczba zależności.
   2. Otwórz Matlab i dodaj katalog i wszystkie podfoldery lokalnego klonu repozytorium kodu do ścieżki.
   3. Ustaw katalog w przestrzeni roboczej Matlaba na lokalizację folderu, w której były przechowywane obrazy przygotowane w kroku 6.1.
   4. Otwórz i uruchom skrypt tracking.m. Po wyświetleniu monitu postępuj zgodnie z instrukcjami, aby załadować odpowiednie obrazy, wykonać początkowe kroki przetwarzania wstępnego i sprawdzić błędy algorytmu śledzenia obiektów.
   5. Po zakończeniu skryptu otwórz i uruchom funkcję dispShear.m. Ten skrypt nie powinien wymagać danych wejściowych od użytkownika.
   6. Po zakończeniu skryptu dispShear.m otwórz i uruchom disp3D.m. Jeśli pojawi się monit o otwarcie obrazów, postępuj zgodnie z instrukcjami.
      UWAGA: W czasie wykonywania skrypt może poprosić użytkownika o narysowanie linii na obrazie tablicy z wzorcem. Linia ta powinna reprezentować główną oś ruchu lasera skanującego podczas tworzenia wzoru i powinna pokrywać się z rzędem wzorzystych znaczników odniesienia. Ten proces instruuje kod, w którym kierunku (tj. wiersze lub kolumny znaczników odniesienia) prawdopodobnie daje najbardziej wyrównane rzędy znaczników odniesienia.
   7. Po zakończeniu tworzenia kodu dispShear.m uruchom kod dispSurface.m, a następnie kod interpFinal3D_2.m. Te skrypty nie powinny wymagać danych wejściowych od użytkownika.
      UWAGA: Skrypt interpFinal3D_2.m konwertuje dane o przemieszczeniu na trakcje powierzchniowe za pomocą oprogramowania uzyskanego zewnętrznie, które zostało wcześniej opisane³¹. Aby zastosować te funkcje zewnętrzne, interpFinal3D_2.m interpoluje dane o przemieszczeniu w jednolite siatki, które służą jako dane wejściowe dla funkcji konwersji. W przypadku korzystania z innej metody konwersji lub jeśli trakcje nie są potrzebne, ten krok można pominąć.
   8. Po uruchomieniu wszystkich skryptów upewnij się, że wszystkie dane i dane wyjściowe można znaleźć w katalogu początkowym.
   9. Powtórz kroki 6.2.3 – 6.2.8 dla każdego COI.
      UWAGA: W repozytorium kodu znajduje się folder zawierający skrypty, które umożliwiają automatyczne uruchamianie wsadowe każdego ze skryptów na liście katalogów. Zapoznaj się z samymi skryptami automatyzacji (tj. komentarzami w kodzie), aby uzyskać instrukcje, jak z nich korzystać.

Results

W całym protokole istnieje wiele punktów kontrolnych, które dostarczają informacji zwrotnych do oceny jakości procedury tworzenia wzorów. Aby zapewnić wgląd w to, jak oceniać postępy w każdym z tych punktów kontrolnych, przedstawiamy reprezentatywne wyniki rzeczywistego eksperymentu. Wyniki wskazują na zastosowanie tego protokołu na fotowzorzystym hydrożelu przygotowanym do analizy TFM ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Wyniki obejmują surowe dane obrazu, a także przetworzone dane wyjściowe na każdym k...

Discussion

Celem tego protokołu jest zapewnienie przepływu pracy, który łagodzi wiele trudności związanych z generowaniem i analizą danych TFM. Po przygotowaniu, hydrożele z fotowzorem są proste w użyciu, wymagają jedynie znajomości standardowych praktyk hodowli tkankowych i mikroskopii fluorescencyjnej. Aspekt bez referencji umożliwia bezproblemową nawigację po hydrożelach wypełnionych komórkami i eliminuje kłopotliwe etapy przetwarzania obrazu, takie jak rejestracja obrazu między obrazami referencyjnymi a zdeformowanymi. Uzyskana...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtr strzykawkowy Acrodisc, 0,2 μ m Membrana Supor, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Pozwala na filtrowanie roztworów makromerów przed syntezą żelu bazowego i kolejnymi etapami litografii.
Akrylany funkcjonalizowane silanem #1.5 Szkiełka nakrywkowe	in-house	in-house	Acrylany umożliwiają wiązanie hydrożelu bazowego z powierzchnią szkła w celu unieruchomienia hydrożeli. Zobacz odniesienie: 21-24
Axio-Observer Z1 z mikroskopem Apotome	Zeiss		Widefield z modułem oświetlenia strukturalnego służącym do wykonywania obrazów dla TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Wyposażony w laserowy mikroskop skaningowy używany do litografii wielofotonowej.
Podwójnie powlekana taśma, 9500 sztuk, 6,0 mil	3M		Wiąże akrylowo-silanowe szkiełka nakrywkowe z szalkami Petriego.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Umożliwia wyłożenie taśmą podwójnie powlekaną, umożliwiając podawanie taśmy do plotera.
LSM-880	Zeiss		używany do litografii wielofotonowej.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Uruchamia niestandardowe skrypty do generowania instrukcji litograficznych dla mikroskopu i do analizy danych TFM.
Model SC Ploter	USCutter	SC631E	Tnie podwójnie powlekaną taśmę w pierścienie do wiązania szkiełek nakrywkowych na szalkach Petriego.
Obiektyw C-Apochromat 40x/1,20 W Corr M27	Zeiss		Wyposażony zarówno w mikroskop szerokokątny, jak i laserowy mikroskop skaningowy, do użytku zarówno w litografii, jak i TFM.
PEG-AF633	in-house	in-houseWariant	PEG z akrylanem znakowanym fluoroforem do tworzenia markerów referencyjnych. Zobacz indeks: 21
PEG-DA	em>in-house<	em>in-house	Materiał bazowy do hydrożeli. Zobacz odniesienie: 21
PEG-RGDS	em>in-house<	em>in-house	RGDS monoakrylowy wariant PEG znakowany peptydem w celu promowania adhezji komórek. Zobacz odniesienie: 21
szalek Petriego	CELLTREAT	229638	Otwory o średnicy 8 mm są wycinane w środku każdej szalki za pomocą wiertła rdzeniowego, aby pasowały do hydrożeli bazowych.
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning	3097358-1004	Do tworzenia przekładek do kontroli grubości hydrożelu bazowego (aka PDMS).
Strzykawka, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Pozwala na filtrowanie roztworów makromerów przed syntezą żelu bazowego i kolejnymi etapami litografii.
Lampa UV	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polimeryzuje hydrożel bazowy.
1-winylo-2-pirolidynon (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Akcelerator rodników i komonomer. Poprawia wprowadzanie pegylowanego fluoroforu podczas litografii.