Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60398

⸱

6 listopada 2019

 ,  ,  ,  , 
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&B).

Streszczenie

Pomimo znaczenia i wszechobecności oligomeryzacji receptorów, niewiele metod ma zastosowanie do wykrywania zdarzeń grupowania i mierzenia stopnia grupowania. W tym miejscu opisujemy podejście obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerycznego homokompleksów receptorowych znakowanych mEGFP w błonie żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&B). N&B jest metodą podobną do spektroskopii fluorescencyjno-korelacyjnej (FCS) i histogramu zliczania fotonów (PCH), które opierają się na analizie statystycznej fluktuacji intensywności fluoroforów dyfundujących do i z objętości oświetlenia w czasie obserwacji. W szczególności N&B stanowi uproszczenie PCH w celu uzyskania informacji na temat średniej liczby białek w mieszaninach oligomerycznych. Amplitudy fluktuacji intensywności są opisywane przez jasność molekularną fluoroforu i średnią liczbę fluoroforów w objętości oświetlenia. Tak więc N&B bierze pod uwagę tylko pierwszy i drugi moment rozkładu amplitudy, a mianowicie średnią intensywność i wariancję. Jest to jednocześnie mocna i słaba strona tej metody. Ponieważ brane są pod uwagę tylko dwa momenty, N&B nie może określić frakcji molowej nieznanych oligomerów w mieszaninie, a jedynie szacuje średni stan oligomeryzacji mieszaniny. Niemniej jednak można go zastosować do stosunkowo małych szeregów czasowych (w porównaniu z innymi metodami momentów) obrazów żywych komórek na podstawie piksel po pikselu, po prostu monitorując fluktuacje czasowe intensywności fluorescencji. Skraca efektywny czas na piksel do kilku mikrosekund, umożliwiając akwizycję w zakresie czasu od sekund do milisekund, co jest niezbędne do szybkiej kinetyki oligomeryzacji. Wreszcie, można zbadać duże obszary komórek, a także przedziały subkomórkowe.

Wprowadzenie

Opisujemy metodę obrazowania z wykorzystaniem całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji oraz analizy liczby i jasności (TIRF-N&B) w celu określenia średniego stanu oligomerycznego cząsteczek receptorowych w błonie plazmatycznej żywych komórek, dążąc do powiązania dynamiki składania się receptorów z funkcją biologiczną białek (Rysunek 1).

Po związaniu ligandu zewnątrzkomórkowego receptory inicjują wewnątrzkomórkową transdukcję sygnału w zależności od ich konformacji, oligomeryzacji, potencjalnych koreceptorów oraz składu błony. Pomimo znaczenia i powszechności oligomeryzacji receptorów, uznawanej za kluczowe zdarzenie w sygnalizacji komórkowej1,2,3,4,5,6,7, niewiele metod pozwala na wykrywanie zdarzeń klasteryzacji i eksperymentalny pomiar stopnia klasteryzacji8,9. Objętość konfokalna (x,y ≈ 30 nm, z ≈ 90 nm) nie zapewnia wystarczającej rozdzielczości do udowodnienia oddziaływań molekularnych i stechiometrii, nawet po optymalizacji za pomocą algorytmów rekonstrukcji obrazu10. Skład podjednostek oligomerów białkowych nie może być rozstrzygnięty wyłącznie na podstawie danych przestrzennych, nawet przy użyciu metod super-rozdzielczych o rozdzielczości x,y rzędu 20-70 nm, takich jak PALM1, STORM12 i STED13. Ponadto ich rozdzielczość czasowa (rzędu minut na obraz) nie pozwala na śledzenie kinetyki w skali sekund. Metoda stopniowego wygaszania pojedynczych cząsteczek (single molecule step-bleaching) pozwala określić stechiometrię oligomerów białkowych tylko wtedy, gdy są one nieruchome14.

Jedną z najbardziej wszechstronnych metod pomiaru gęstości i oligomeryzacji białek znakowanych fluorescencyjnie na pojedynczych obrazach jest analiza przestrzennego rozkładu intensywności (SpIDA), która opiera się na próbkowaniu przestrzennym. Metoda ta ma zastosowanie zarówno do komórek utrwalonych chemicznie, jak i żywych, oraz pozwala na jednoczesną analizę kilku obszarów zainteresowania komórki przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej15. Alternatywnie, metody momentów, takie jak spektroskopia korelacyjna fluorescencji (FCS)16, histogram zliczania fotonów (PCH)17 oraz metoda liczby i jasności (N&B)18,19, nadają się do ilościowych pomiarów oligomerów. Metody te analizują fluktuacje intensywności fluorescencji, które można obserwować w czasie, gdy fluorofory dyfundują do wnętrza i na zewnątrz objętości oświetlenia. Amplitudy fluktuacji intensywności mogą być jednoznacznie opisane przez jasność molekularną fluoroforu (ε) oraz średnią liczbę fluoroforów (n) w obrębie objętości oświetlenia17 (Rysunek 2). Zazwyczaj za pomocą FCS można wyznaczyć współczynnik dyfuzji fluoroforów oraz średnią liczbę cząsteczek (odwrotnie proporcjonalną do wartości G(0)) w objętości oświetlenia20. Jednakże, ponieważ czas dyfuzji skaluje się jedynie z pierwiastkiem trzecim z masy, FCS nie jest wystarczająco czuła, aby wykryć zmiany masy cząsteczkowej21. W praktyce jednobarwna metoda FCS nie pozwala na wykrycie dimeryzacji receptorów błonowych. PCH dokładnie rozdziela mieszaniny różnych oligomerów. Wykorzystując więcej niż dwa momenty rozkładu amplitudy, metoda ta wykrywa cząsteczki o różnej jasności zajmujące tę samą objętość oświetlenia. Skanująca metoda FCS2 oraz nowe opracowania, takie jak interesujące podejście oparte na korelacji par jasności molekularnej (pCOMB)23, wprowadzone w celu rozszerzenia zakresu stosowalności metod korelacji fluorescencji w systemach biologicznych24, pozostają metodami punktowymi, którym brakuje możliwości szybkich pomiarów na dużym obszarze komórki, co wymaga wielu następujących po sobie obserwacji w każdym pikselu i akwizycji danych trwającej sekundy.

N&B jest uproszczoną wersją PCH, która uwzględnia jedynie pierwszy i drugi moment amplitudy rozkładu fluorescencji, a mianowicie średnią intensywność, , oraz wariancję, σ2 (Rycina 2)18,19. Z tego powodu metoda ta nie pozwala na wyznaczenie ułamka molowego nieznanych oligomerów w mieszaninie, a jedynie szacuje średni stan oligomeryzacji mieszaniny. Niemniej jednak, N&B ma tę zaletę, że w analizie piksel po pikselu pracuje na relatywnie krótszych szeregach czasowych obrazów żywych komórek, polegając po prostu na monitorowaniu fluktuacji intensywności fluorescencji w czasie. Ponieważ N&B skraca czas analizy pojedynczego piksela do kilku mikrosekund, pozwala to na śledzenie szybkiej kinetyki oligomeryzacji na dużych obszarach komórkowych, umożliwiając akwizycję obrazów w skali sekundowej w mikroskopii skanującej (np. konfokalnej, dwufotonowej) oraz w skali milisekundowej w mikroskopii opartej na kamerach (np. TIRFM).

W kilku raportach wykazano zdolność metody N&B do ilościowego określania liczby podjednostek w klastrach białkowych poprzez obrazowanie rozległych obszarów komórek. Klastry paksylliny-EGFP wykryto w miejscach adhezji w komórkach CHO-K125, a wewnątrzkomórkową agregację patogennego peptydu Httex1p opisano w komórkach COS-726. Metodę N&B zastosowano do śledzenia indukowanej ligandem oligomeryzacji receptora ErbB27 oraz efektu działania ligandu FGF21 na Klothob (KLB) i FGFR1c w komórkach HeLa28. Połączenie obrazowania TIRF i analizy N&B wykorzystano do wykazania, że dynamina-2 występuje głównie w formie tetramerycznej w całej błonie komórkowej29. Zastosowaliśmy N&B zarówno do obrazów z rastrowego skanowania, jak i TIRF, aby udowodnić indukowaną ligandem dimeryzację receptorów błony komórkowej uPAR i FGFR130,31.

Metody korelacji fluorescencji, takie jak N&B, FCS oraz PCH opierają się na założeniu, że w otwartej objętości liczba cząsteczek podlega rozkładowi Poissona. Ponieważ wykrywalne są jedynie fotony emitowane przez fluorofory, średnia wartość mierzonej intensywności fluorescencji w funkcji czasu w jednym pikselu obrazu, Równanie stanu równowagi statycznej ΣFx=0, schemat ilustrujący bilans sił i sumowanie wektorowe.jest iloczynem średniej liczby fluoroforów w objętości oświetlenia, n, oraz ich jasności molekularnej, ε17:

Równanie stanu równowagi statycznej, ΣFx=0, schemat; pojęcia z zakresu analizy mechanicznej, obliczanie równowagi sił.

gdzie ε jest wyrażone jako liczba fotonów emitowanych w jednostce czasu (konwencjonalnie na sekundę) na cząsteczkę, gdy cząsteczka znajduje się w centrum objętości oświetlenia.

Jasność jest właściwością każdego fluoroforu w danym układzie akwizycji, podczas gdy intensywność jest sumą wszystkich wkładów od wszystkich fluoroforów. W kontekstach biologicznych jasność wzrośnie wraz ze wzrostem liczby fluoroforów fluktuujących wspólnie, dostarczając informacji o stanie oligomeryzacji białka znakowanego fluorescencyjnie. Amplitudy fluktuacji w danym pikselu mierzy się na podstawie wariancji sygnału fluorescencji, σ2:

Wzór na wariancję statystyczną, σ² = ⟨I²⟩ - ⟨I⟩², równanie matematyczne.

Gdzie średnia kwadratu natężenia, Wzór na równowagę statyczną ⟨I²⟩; symbol matematyczny; zastosowanie edukacyjne i badawcze, zwięzły opis.or kwadrat średniej intensywności, Równanie stanu równowagi statycznej ΣFx=0; schemat koncepcyjny inżynieryjny; analiza bilansu sił.oblicza się z poszczególnych wartości intensywności każdego piksela w każdej klatce:

Równania matematyczne, równowaga statyczna, wzory ΣI/K do analizy statystycznej.

gdzie K to całkowita liczba klatek w serii czasowej. Doświadczalnie konieczne jest obliczenie dla całej serii obrazów wariancji opisującej rozproszenie poszczególnych wartości intensywności w każdym pikselu pojedynczego obrazu względem średniej wartości intensywności. Wariancja ta obejmuje wszystkie fluktuacje różnego pochodzenia. W pierwszym przybliżeniu wariancję wynikającą z dyfuzji cząsteczek w objętości oświetlenia, σ20, można oddzielić od wariancji wynikającej z szumu śrutowego detektora, σ2d. Obie wariancje są niezależne, zatem całkowita wariancja jest sumą tych dwóch wartości:

Równanie wariancji σ²=σ₀²+σₐ², przydatne w analizie statystycznej; wzór matematyczny.

Wariancja, wynikająca z fluktuacji molekularnych wewnątrz i na zewnątrz objętości detekcji, jest liniowo zależna od jasności i intensywności cząsteczek:

Równanie rozkładu naprężeń, σ²=ε(I), kluczowy wzór dla analizy naprężeń materiałowych.

Przekształcając równanie 6 zgodnie z równaniem 1:

Równanie równowagi statycznej σ₀²=ε²n, wzór badawczy dla celów edukacyjnych.

Zgodnie z typową koncepcją w spektroskopii korelacyjnej fluorescencji, równanie 7 stwierdza, że wariancja wynikająca z liczby fluktuacji zależy od kwadratu jasności cząsteczki.

Wówczas wariancja wynikająca z fluktuacji detektora jest funkcją liniową wykrytej intensywności, przy założeniu, że detektor pracuje poniżej progu nasycenia19:

Równanie równowagi statycznej σ²_d = a(I) + c; analiza wzoru matematycznego.

W przypadku detektorów liczących fotony a=1 i c=0, zatem wariancja detektora jest równa średniej intensywności:

Równanie statycznej równowagi σd²=⟨I⟩, reprezentacja wzoru w badaniach edukacyjnych.

Aby zastosować te koncepcje do rzeczywistych pomiarów w żywych komórkach, Gratton i współpracownicy18 zdefiniowali pozorną jasność, B, dla każdego piksela jako stosunek wariancji do średniej intensywności:

Równanie równowagi statycznej, Σ(σ²/l) = (σ₀²/l) + (σd²/l), wzór matematyczny, kontekst badawczy.

B jest parametrem mierzonym eksperymentalnie. W niniejszej pracy obrazy z serii czasowej receptorów FGFR1 w błonie plazmatycznej komórek HeLa są rejestrowane za pomocą mikroskopii TIRF, a średnia jasność pozorna, B, jest wyznaczana poprzez analizę N&B. Następnie, po dodaniu FGF2, rejestrowane są kolejne serie czasowe, aby śledzić zmiany w samoorganizacji cząsteczek receptora na powierzchni błony po stymulacji receptora kanonicznym ligandem.

Ponieważ jednak detektorem mikroskopu TIRF jest kamera EMCCD, wyrażenie na jasność pozorną należy zmodyfikować w następujący sposób19:

Równanie równowagi statycznej, człony σ, przesunięcie Δσ²/⟨I⟩ w kontekście analizy naukowej.

gdzie offset to przesunięcie intensywności elektroniki detekcyjnej, które jest charakterystyczne dla ustawień detektora. Wariancja i średnia intensywność dla detektora analogowego są odpowiednio określone przez:

Równania stanu równowagi statycznej, ΣFx=0, schemat bilansu sił, badania, analiza edukacyjna.

gdzie G to wzmocnienie analogowe w poziomach cyfrowych (DL/fotony), a S, czyli liczba poziomów cyfrowych na foton19, jest wyznaczana na podstawie nachylenia wykresu zależności intensywności od wariancji dla źródła światła o stałej intensywności (bez fluktuacji czasowych). Współczynnik γ jest powiązany z kształtem objętości detekcji piksela. Według Hasslera i wsp.32, współczynnik γ wynosi 0,3 dla obrazowania TIRF przy maksymalnym wzmocnieniu kamery detekcyjnej19. Parametry offsetu, S oraz G są charakterystykami kamery i mikroskopu. Pozorną jasność, B, otrzymuje się poprzez przekształcenie równania 1 zgodnie z równaniami 12 i 13:

Równanie równowagi statycznej, B/S=G/S*γε+1, ilustracja wzoru matematycznego.

W warunkach eksperymentalnych ε jest złożoną funkcją intensywności lasera oraz wydajności detekcji systemu. Niemniej jednak, ponieważ stosunek B/S zależy liniowo od ε, istotne jest jedynie wyznaczenie względnej wartości ε dla danego trybu detekcji:

Równanie 15, B/S = B' = ε' + 1; wyrażenie matematyczne dla analizy równowagi statycznej.

gdzie ε' jest proporcjonalny do ε. Niemniej jednak, kalibrację przeprowadza się z wykorzystaniem referencji wewnętrznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

  1. Dzień 1. Wysiać komórki HeLa w medium kompletnym w stężeniu 10 0-20 0 komórek/mL w naczyniach z szklanym dnem. Wysiać 6-8 naczynia powtórzeniowe.
    UWAGA: W tym przykładzie medium jest uzupełnione o 10% inaktywowane termicznie płodowe serum bydlęce (FBS), 1 mM pirogronianu sodu oraz 100 U/10 µg penicyliny/streptomycyny. Przygotowano kilka naczyń powtórzeniowych.
  2. Dzień 2-3. Gdy komórki osiągną subkonfluencję, połowę naczyń transfekować plazmidem białkowym, a drugą połowę plazmidami referencyjnymi (monomerem i dimerem), w medium bezzsierkowym.
    UWAGA: Transfekcję wykonuje się w medium bez serum, uzupełnionym o antybiotyki, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 25 mM bufor HEPES, bez czerwieni fenolowej.
  3. Dzień 3-4. Sprawdzić, czy transfekowane komórki przylegają do dna naczyń i czy błona komórkowa wykazuje fluorescencję. Odrzucić naczynia z przerośniętymi komórkami lub z bardzo niską fluorescencją.
    UWAGA: Nie dopuścić do przerośnięcia komórek. Komórki muszą być dobrze rozmieszczone i przylegać do szklanego obszaru naczynia (Rysunek 1A). W celu poprawy adhezji komórek można zastosować naczynia z szklanym dnem pokryte wcześniej odpowiednią warstwą. Przed każdym eksperymentem hodowlę komórkową testuje się pod kątem zakażenia mykoplazmami. W tym przykładzie komórki są transfekowane plazmidem (A207K)mEGFP-FGFR1, a komórki referencyjne są transfekowane plazmidami GPI-(A207K)mEGFP oraz GPI-(A207K)mEGFP-(A207K)mEGFP zgodnie ze standardowymi protokołami. Do mikroskopii żywych komórek zaleca się stosowanie medium bez wskaźnika pH; w celu zapobiegania zmianom pH podczas obrazowania dodaje się 25 mM bufor HEPES.

2. Obrazowanie TIRF — dopasowanie linii laserowej i optymalizacja oświetlenia TIRF

  1. Na cztery godziny przed eksperymentem uruchom inkubator temperaturowy mikroskopu i ustaw temperaturę na 37 °C.
  2. Włącz mikroskop, komputery i kamery, a następnie poczekaj, aż kamery osiągną odpowiednią temperaturę roboczą.
    UWAGA: Temperatura robocza kamery użytej w niniejszym badaniu wynosi -75 °C.
  3. Nanieś małą kroplę olejku na obiektyw. Umieść w odpowiednim miejscu naczynie z próbką. Zamknij drzwiczki inkubatora i poczekaj, aż temperatura naczynia się ustabilizuje (~10 min).
  4. Włącz lampę epifluorescencyjną oraz laser 48 nm.
  5. Wybierz tryb kontrastu epifluorescencyjnego, aby zbadać próbkę i za pomocą okularu znaleźć komórkę do ustawienia ostrości.
    UWAGA: Użycie lampy fluorescencyjnej do wyszukiwania komórek przez okular nie jest obowiązkowe. Zamiast niej można użyć odpowiedniej linii laserowej.
  6. Wybierz odpowiedni filtr do zbierania zielonej emisji przez kamerę mikroskopu (Band Pass Ex 490/20 (50) Band Pass Em 525/50 lub podobny).
  7. Przełącz widok z okularu na port kamery (kamera #1 na Rysunku 1) w trybie epifluorescencji, doprecyzuj ostrość, a następnie przełącz na tryb TIRF. Tryby epifluorescencji i TIRF mogą mieć inną nomenklaturę w zależności od marki mikroskopu.
    UWAGA: W przypadku braku markerów fluorescencyjnych na styku z szkiełkiem cover-slip mogą wystąpić problemy z ustawieniem ostrości lub wyrównaniem lasera. Aby prawidłowo wyrównać laser (co jest niezbędne dla dobrego sygnału TIRF), ustaw ostrość na szkiełku cover-slip. Często bardzo trudno jest określić, czy szkiełko jest w ostrości. Jako sugestię zaleca się ustawienie ostrości na krawędziach komórek.
  8. Uruchom automatyczne wyrównanie zgodnie z instrukcją mikroskopu TIRF.
    UWAGA: W skrócie: w krokach od 2.4 do 2.8 najpierw znajdź komórki przez okular i ustaw na nich ostrość, następnie skieruj emisję na port kamery mikroskopu TIRF, ponownie ustaw ostrość na komórkach na ekranie komputera mikroskopu i uruchom procedurę wyrównania lasera. Wyrównanie polega na znalezieniu kąta krytycznego, przy którym oświetlenie staje się ewanescencyjne (Rysunek 3). Mikroskopy komercyjne mogą mieć nieco inne protokoły wyrównywania lub być w pełni zautomatyzowane; inne mogą posiadać małą kamerę ułatwiającą wizualizację warunków kąta krytycznego.
  9. Wybierz odpowiednią głębokość oświetlenia i zoptymalizuj kierunek pola ewanescencyjnego (Rysunek 3).
    UWAGA: Głębokość penetracji pozostaje stała dla wszystkich kontroli i próbek.

3. Obrazowanie TIRF: Rejestracja serii czasowej

  1. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) o rozmiarach co najmniej 256 x 256 pikseli.
    UWAGA: W tej konfiguracji obraz jest rejestrowany za pomocą kamery nr 2 przy użyciu oprogramowania, które steruje bezpośrednio wyłącznie kamerą (patrz Rysunek 1 legenda).
  2. Ustaw czas ekspozycji na 1 ms, a wzmocnienie EM na 100 (jest to czynnik G w równaniach 12 i 13). Przy takiej szybkości może być konieczne dostosowanie lub zwiększenie mocy lasera. W tym przypadku moc lasera wynosi 0,5 mW.
    UWAGA: W zależności od rodzaju kamery oraz ograniczeń wynikających z współczynnika dyfuzji białka, intensywności fluorescencji i tła, ogólne kryteria ustawiania mocy lasera polegają na unikaniu nasycenia detektora, minimalizacji fotoblaknięcia oraz jak najszybszym obrazowaniu przy zachowaniu odpowiedniego stosunku sygnału do szumu (S/N). Wzmocnienie EM jest zawsze ustawiane na maksymalną wartość kamery (patrz. Wprowadzenie).
  3. Przeprowadź pierwszą sekwencję próbną w warunkach początkowych i dokonaj szacunkowego pomiaru wartości S/N. Warunki uznaje się za dopuszczalne, gdy wartość S/N wynosi 2-3 lub więcej, pomiar wykonany w pierwszej klatce pierwszej serii czasowej.
  4. Użyj suwaka systemu podziału emisji łączącego kamerę nr 2 z mikroskopem, aby zamaskować jedną stronę obrazu (Rysunek 1B, Rycina 4A-B)
    UWAGA: W tej konfiguracji do kamery nr 2 zainstalowano konektor do obrazowania wielokanałowego, aby umożliwić jednoczesną akwizycję dwóch przestrzennie identycznych obrazów. System jest wyposażony w suwaki do montażu różnych filtrów emisyjnych. Jeden z suwaków umożliwia montaż czarnej maski zakrywającej fragment obrazu. Zamaskowany obszar służy do wewnętrznej kalibracji każdej serii czasowej w celu wyznaczenia parametrów kamery (równ. 12 i równ. 13). Dzięki temu nie ma potrzeby przeprowadzania niezależnego etapu kalibracji, a co ważne, kalibracja odbywa się równolegle do rejestracji każdej serii czasowej. W przypadku braku tego systemu kamerę można skalibrować, stosując opublikowane protokoły.33.
  5. Wybierz kamerę automatyczne zapisywanie plików opcja
  6. Rozpocząć akwizycję serii obrazów. Należy zebrać minimum 70 klatek przy stosunku sygnału do szumu (S/N) wynoszącym co najmniej 2.
    UWAGA: Liczba klatek niezbędnych do analizy zależy od stabilności próbki na fotoblaknięcie oraz od rozproszenia danych. W związku z tym jakość każdej serii czasowej jest oceniana podczas N&Analiza B.
  7. Bez wyjmowania naczynia z mikroskopu dodaj ligand.
  8. Wybierz komórkę z jasną fluorescencją błony i szybko rozpocznij pierwszą serię czasową pomiaru kinetycznego.
    UWAGA: Jeśli dodanie ligandu zostanie wykonane szybko, to pierwsze przechwycenie wyznacza punkt czasowy t = 0 dla kinetyki ligandu. Oprogramowanie rejestruje dokładny moment przechwycenia.
  9. Zlokalizuj drugą komórkę i zarejestruj drugi punkt czasowy kinetyki.
    UWAGA: W niektórych mikroskopach wyposażonych w zmotoryzowane stoliki w osiach x, y, z dostępne są procedury odwiedzania punktów. Pozwalają one na zapamiętanie wielu pozycji na szalce z hodowlą komórek, co może pomóc w zachowaniu bardziej stałych odstępów czasowych między seriami obrazów różnych komórek.
  10. Należy zarejestrować obraz nowej komórki dla każdego punktu czasowego serii kinetycznej.
    UWAGA: Po utrwaleniu komórka ulega częściowemu fotoblaknięciu, co uniemożliwia jej ponowne obrazowanie. Z tego powodu kinetykę uzyskuje się poprzez łączenie serii czasowych z wielu komórek, z których każda została utrwalona w innym punkcie czasowym.
  11. Dla każdej nowej płytki powtórz protokół od kroku 2.3 do 3.9.
    UWAGA: W przypadku naczyń referencyjnych należy dodać objętość nośnika (PBS z dodatkiem 0,01% albuminy surowicy bydlęcej) równą objętości zastosowanej dla liganda.

4. Liczba i jasność (N&B): kontrola jakości serii czasowych

  1. Konwertuj i zapisz w formacie .TIFF pliki pozyskane za pomocą oprogramowania kamery (w tym przykładzie pliki .sif).
  2. Zaimportuj pliki .TIFF do rutyny oprogramowania analitycznego poprzez uruchomienie graficznego interfejsu użytkownika (GUI) MATLAB dla N&B.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano dostosowany plik wykonywalny rutyny N&B w programie Matlab (analiza N&B dostępna pod adresem https://www.cnic.es/en/investigacion/2/187/tecnologia). Po otwarciu zaimportowanego pliku .TIFF rutyna generuje obraz średniej intensywności oraz średni profil intensywności i umożliwia przeglądanie serii klatka po klatce (Rycina uzupełniająca 1). Do analizy N&B dostępne jest inne oprogramowanie (np. oprogramowanie SimFCS).
  3. Odrzuć serie, w których średni profil intensywności wykazuje fotoblaknięcie przekraczające 10%, oraz serie, w których podczas akwizycji nastąpiło wyraźne przesunięcie lub zniekształcenie błony komórkowej.
  4. Przytnij klatki, które są ewidentnie poza ogniskowaniem.
    UWAGA: W rutynie zaimplementowano narzędzie do przycinania, które służy do odrzucania pojedynczych lub wielu klatek w obrębie serii obrazów. Operacja ta jest dopuszczalna, ponieważ czas między klatkami nie jest krytyczny, podczas gdy czas przebywania piksela (czas ekspozycji) już tak (patrz sekcja Dyskusja).
  5. Do analizy zachowaj wyłącznie serie zawierające co najmniej 50 klatek czasowych.

5. Liczba i Jasność (N&B): Wyznaczanie parametrów kamery (Offset, σ oraz S)

  1. Uruchom procedurę Calibrate Camera.
  2. Wybierz obszar o rozmiarach co najmniej 20 x 50 pikseli w regionie szumu detektora (Ryc. 4).
    UWAGA: Procedura generuje histogram wartości (definiowanych również jako poziom cyfrowy, DL) i zwraca wykres logarytmiczny częstotliwości w funkcji poziomów cyfrowych.
  3. Na wykresie logarytmicznym częstotliwości w funkcji poziomu cyfrowego przesuń liniowy czerwony kursor, aby oddzielić część gaussowską od części liniowej krzywej.
    UWAGA: Czerwony kursor dzieli krzywą na dwie sekcje i uruchamia procedurę zwracającą offset, który jest centrum funkcji gaussowskiej odpowiedzi kamery, wartość σ dopasowania gaussowskiego oraz współczynnik S, będący nachyleniem części liniowej odpowiedzi kamery (Ryc. 4C-D).

6. Liczba i jasność (N&B): Obliczanie wartości B w wybranym obszarze zainteresowania (ROI)

  1. Aktywuj B klucz
    UWAGA: Ta operacja generuje obraz średniej intensywności (Rysunek 5, pierwsza kolumna) oraz obraz B, w którym każda pojedyncza wartość B jest przypisana do odpowiadającego jej piksela w obrazie (Rycina dodatkowa 1).
  2. Zastosuj minimalne grupowanie (binning) (2 2), aby zmniejszyć rozproszenie danych i wygenerować histogram B-I (Rycina 5, druga kolumna).
    UWAGA: Histogram B-I przedstawia rozkład wartości B wszystkich pikseli obrazu w stosunku do intensywności pikseli. Y = B/S; X = (Równanie równowagi statycznej ΣFx=0 na schemacie, ilustrujące bilans sił i sumowanie wektorowe. - przesunięcie)/S (Rycina uzupełniająca 1 oraz równania 1 i 15).
  3. Przeanalizuj histogram B-I za pomocą interaktywnego kwadratowego kursora.
  4. Wybierz kwadratowy obszar zainteresowania (ROI) do analizy (Rysunek 5, trzecia kolumna).
    UWAGA: Kursor synchronizuje ruchomą maskę na obrazie średniej intensywności, wyróżniając piksele wybrane w obrębie kwadratowego obszaru kursora (Rycina uzupełniająca 1). Dzięki tej inspekcji możliwe jest wykluczenie z analizy tła oraz obszarów o bardzo niskiej intensywności.
  5. Wygeneruj mapę B dla wybranego obszaru zainteresowania (ROI) (Rysunek 5, czwarta kolumna).
  6. Zapisz plik ASCII z wartościami B przypisanymi do zaznaczenia.
  7. Zaimportuj plik ASCII do oprogramowania graficznego, aby obliczyć rozkład częstości danych i wyznaczyć średnią wartość B ± błąd standardowy (S.E.)Rycina 5, piąta kolumna).
    UWAGA: Jeśli dane są jednorodne, rozkład częstości wartości B przybliża rozkład Gaussa.
  8. Zastosuj równanie 15, aby wyznaczyć średnią jasność Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, ΣFy=0, przedstawiający siły działające na belkę; układ analizy mechanicznej. = Równowaga statyczna, diagram ΣFx=0, analiza sił w równowadze, materiał edukacyjny z fizyki. - 1 [(liczba zliczeń/cząsteczka) na czas przebywania] dla każdej komórki w każdym punkcie czasowym pomiaru kinetycznego. Znormalizuj dane zgodnie z:
    Równanie ilustrujące koncepcję równowagi statycznej; wzór: ε'_t/ε'_0 = (B'_t-1)/(B'_0-1).
    gdzie Równanie równowagi statycznej ΣFx=0; schemat sił; rozkład wektorów w analizie fizycznej. jest to średnia wartość B zmierzona w czasie „t” po dodaniu ligandu, a Pole magnetyczne, \(\langle B'_{0} \rangle\), na schemacie spektroskopii NMR z dopasowaniem widma. jest średnią wartością B zmierzoną w czasie t=0 (10–20 s po dodaniu ligandu).
    UWAGA: Normalizacja wyników umożliwia bezpośrednie porównanie eksperymentów przeprowadzonych w różne dni. Pozwala ona skompensować różnice w pomierzonej jasności wynikające z mocy lasera oraz wahań technicznych.
  9. Nanieś znormalizowaną średnią jasność w funkcji czasu akwizycji, aby zbudować przebieg kinetyczny (Rysunek 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki dla dwóch reprezentatywnych komórek HeLa-mEGFP-FGFR1 wysianych w jednej płytce hodowlanej przedstawiono w Rycina 5 i Tabela uzupełniająca 1Obie komórki zostały uchwycone w czasie 0 min (Rysunek 5A, góra) oraz 7 min (Rycina 5A, dół) po dodaniu ligandu FGF2.

Rysune...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

N&B wymaga kilku środków ostrożności przy wyborze modelu komórki i strategii etykietowania. Można go zastosować tylko do żywych komórek, które pozostają stabilnie przylegające w czasie przechwytywania obrazu. Dodatkowe fluktuacje spowodowane sztywnym przemieszczeniem całej komórki można rozwiązać za pomocą odpowiednich metod przywracania obrazu38. Jednak na ogół, gdy komórka się porusza, błona komórkowa również się deformuje, a deformacja struktury, powodując dużą dodatkową wariancję, wprowadza po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

CNIC jest wspierany przez Ministerstwo Ciencia, Innovación y Universidades i Fundację Pro CNIC, i jest Centrum Doskonałości Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Jesteśmy również wspierani przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (FEDER) "Una manera de hacer Europa". UC dziękuje za wsparcie ze strony Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, Stowarzyszenia Międzynarodowych Badań nad Rakiem (obecnie znanego jako Worldwide Cancer Research) oraz włoskiego Ministerstwa Zdrowia. A.T. dziękuje "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" za częściowe wsparcie jego pracy w ramach stypendium PV "Progetto Professionalità Ivano Becchi" w latach 2011-2012.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-kolorowy, szybki mikroskop odwrócony TIRF TIRF MC Leica AM TIRF MC, z automatycznym ustawianiem TIRF w trybie smi. Mikroskop wyposażony jest w laser diodowy o długości fali 488 nm, obiektyw TIRF o wymiarach 100x 1,46 oleju, filtry pasmowo-przepustowe Ex/Em przy 490/20 i 525/50, inkubator temperatury/CO2 oraz kamerę Andor DU 8285 VP EMCCD. Mikroskop jest obsługiwany przez oprogramowanie Leica LIF.Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy
Albumina z surowicy bydlęcej 98% minimalnaSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAA7906-100G
DMEM bez czerwieni fenolowej z 25 mM HEPESGIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA21063029Używana surowica wolna od mikroskopii
DMEM o wysokiej glukozie GlutaMAX IGIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10566-016Używany do kompletnego podłoża
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Biowest, Nuaillé, FranceX0515-500
System rozdzielania emisji Fotometria DV2TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, BrazyliaGIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA1027010610% inaktywowany suplement dla kompletnego podłoża
Szklane dno 35 mm sterylne 1,5 naczyniaMatTek, Ashland, MA, USAP35G-0.170-14-Cniepowlekane, grubość szkła 0,17 mikrona
GraphPad PrismGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Ludzki rak szyjki macicy (HeLa), komórki składnika zwierzęcego (AC) bez surowicyMillipore-Sigma ECACC, Darmstadt, NiemcyCB_08011102
Kamera iXonEM+ 897 EMCCD (podświetlana od tyłu) ANDOR sterowana przez oprogramowanie ANDOR SolisOxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, Wielka BrytaniaTa kamera, zainstalowana w dodatkowym porcie mikroskopu, służy do pozyskiwania N& B szeregi czasowe
Matlab Executable N& B rutynowaJednostka Mikroskopii i Obrazowania Dynamicznego, CNIC, Madryt, Hiszpaniapobierz pod adresem https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018bThe MathWorks, Inc. Natick, MA, USAa href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicylina:Streptomycyna do hodowli tkankowej 100xBiowhittaker Inc. Walkersville, MD, USALONZA 17-602Esuplement do podłoża w penicylinie/streptomycynie 100 U / 100 i mikro g.
Wektor ekspresji pN1-mEGFP-FGFR1Zakład Badań nad Onkologią Ginekologiczną, Europejski Instytut Onkologii IRCCS, Mediolan, WłochyZamai i wsp., 2019
wektor ekspresji pN1-N-Gly-mEGFP-GPIZakład Mikroskopii i Obrazowania Dynamicznego, CNIC, Madryt, HiszpaniaHellriegel i wsp., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI wektor ekspresyjnyZakład Mikroskopii i Obrazowania Dynamicznego, CNIC, Madryt, HiszpaniaHellriegel i wsp., 2011
Rekombinowany FGF2PeproTech EC, Ltd., Londyn, Wielka BrytaniaRoztwór liganda: 20 ng/ml FGF2 w PBS uzupełniony 0,01% BSA.
Pirogronian sodu GIBCOThermoFisher Scientific113600701 mM suplement do podłoża
TransIt-LT1 Odczynnik do transfekcjiMirusBio LLC, Madison, WI, USAMIR 2300
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA25200056
Typ F Płyn zanurzeniowy 10 mlLeica Microsystems, Wetzlar, Niemcy11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)ThermoFisher ScientificAM26180,1% suplement do podłoża bez czerwieni fenolowej stosowany do transfekcji
<

Bibliografia

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047(2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994(2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007(2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oligomeryzacja receptor wmetody fluktuacji fluorescencjiobrazowanie ywych kom rekmikroskopia TIRFFGFR1 mEGFPfluktuacje intensywno ci fluorescencjiwyznaczanie stanu oligomerycznego
Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.