Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Summary

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Abstract

Trójwymiarowa hodowla komórek sferoidalnych może przynieść bardziej użyteczne wyniki w eksperymentach komórkowych, ponieważ może lepiej symulować mikrośrodowiska komórkowe żywego ciała niż dwuwymiarowa hodowla komórkowa. W tym badaniu wyprodukowaliśmy napędzaną silnikiem elektrycznym platformę lab-on-a-CD (compact disc), zwaną odśrodkowym systemem hodowli sferoidalnej opartej na mikroprzepływach (CMS), aby stworzyć trójwymiarowe (3D) sferoidy komórkowe wykorzystujące dużą siłę odśrodkową. To urządzenie może zmieniać prędkości obrotowe, aby wygenerować warunki grawitacyjne od 1 x g do 521 x g. System CMS ma średnicę 6 cm, posiada sto mikrostu mikrostudzienek o wielkości 400 μm i jest wytwarzany przez formowanie z polidimetylosiloksanu w formie poliwęglanowej wstępnie wykonanej przez komputerową maszynę sterowaną numerycznie. Ściana barierowa przy wejściu do kanału systemu CMS wykorzystuje siłę odśrodkową do równomiernego rozprowadzenia komórek wewnątrz chipa. Na końcu kanału znajduje się obszar szkiełka, który umożliwia komórkom wejście do mikrostudzienek. W ramach demonstracji, sferoidy zostały wygenerowane przez monokulturę i kokulturę ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej i ludzkich fibroblastów płuc w warunkach wysokiej grawitacji przy użyciu systemu. System CMS wykorzystywał prosty schemat działania do produkcji sferoid kokultury o różnych strukturach koncentrycznych, janusowych i kanapkowych. System CMS będzie przydatny w badaniach biologii komórki i inżynierii tkankowej, które wymagają hodowli sferoidów i organoidów jednego lub wielu typów komórek.

Introduction

Łatwiej jest symulować biologiczne mikrośrodowiska in vivo za pomocą trójwymiarowej (3D) hodowli komórek sferoidalnych niż za pomocą dwuwymiarowej (2D) hodowli komórek (np. konwencjonalnej hodowli komórek na szalce Petriego), aby uzyskać bardziej realistyczne wyniki eksperymentów¹. Obecnie dostępne metody tworzenia sferoidów obejmują technikę wiszącej kropli², technikę nakładania cieczy³, technikę karboksymetylocelulozy⁴, technikę mikroprzepływową opartą na sile magnetycznej⁵, oraz wykorzystanie bioreaktorów⁶. Chociaż każda metoda ma swoje zalety, konieczna jest dalsza poprawa odtwarzalności, produktywności i generowania sferoid kokultury. Na przykład, podczas gdy technika mikroprzepływowa oparta na sile magnetycznej⁵ jest stosunkowo niedroga, wpływ silnych pól magnetycznych na żywe komórki musi być dokładnie rozważony. Korzyści płynące z hodowli sferoidów, szczególnie w badaniu różnicowania i proliferacji mezenchymalnych komórek macierzystych, zostały zgłoszone w kilku badaniach^7,8,9.

Odśrodkowy system mikroprzepływowy, znany również jako lab-on-a-CD (compact disc), jest przydatny do łatwego kontrolowania płynu wewnątrz i wykorzystywania rotacji substratu, a zatem jest wykorzystywany w zastosowaniach biomedycznych, takich jak testy immunologiczne¹⁰, testy kolorymetryczne do wykrywania markerów biochemicznych¹¹, testy amplifikacji kwasów nukleinowych (PCR), zautomatyzowane systemy analizy krwi¹²oraz odśrodkowe urządzenia mikroprzepływowe typu "wszystko w jednym13. Siłą napędową kontrolującą płyn jest siła dośrodkowa wytwarzana przez obrót. Dodatkowo, wiele funkcji mieszania, zaworów i dzielenia próbek można wykonać w prosty sposób na tej jednej platformie CD. Jednak w porównaniu z wyżej wymienionymi metodami analizy biochemicznej, przeprowadzono mniej badań z zastosowaniem platform CD do komórek hodowlanych, zwłaszcza sferoidów¹⁴.

W tym badaniu pokazujemy wydajność systemu sferoidowego opartego na mikroprzepływach (CMS) poprzez monokulturę lub kokulturę ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hASC) i ludzkich fibroblastów płuc (MRC-5). Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię badawczą naszej grupy¹⁵. W ten sposób można łatwo odtworzyć platformę lab-on-a-CD do hodowli sferoidów. Przedstawiono system generujący CMS składający się z chipa hodowli CMS, uchwytu chipa, silnika prądu stałego, mocowania silnika i platformy obrotowej. Mocowanie silnika jest drukowane w 3D z akrylonitryl-butadien-styrenem (ABS). Uchwyt wiórów i platforma obrotowa są obrabiane CNC (komputerowe sterowanie numeryczne) za pomocą komputera PC (poliwęglan). Prędkość obrotowa silnika jest regulowana w zakresie od 200 do 4 500 obr./min poprzez kodowanie algorytmu PID (proporcjonalno-całkująco-pochodnej) opartego na modulacji szerokości impulsu. Jego wymiary to 100 mm x 100 mm x 150 mm i waży 860 g, dzięki czemu jest łatwy w obsłudze. Korzystając z systemu CMS, sferoidy mogą być generowane w różnych warunkach grawitacji od 1 x g do 521 x g, dzięki czemu badanie promowania różnicowania komórek w warunkach wysokiej grawitacji można rozszerzyć z 2D cells^16,17 do sferoidy 3D. Kokultura różnych typów komórek jest również kluczową technologią skutecznego naśladowania środowiska in vivo¹⁸. System CMS może z łatwością generować sferoidy monokulturowe, a także sferoidy kokulturowe o różnych typach budowy (np. koncentryczne, janusowe, kanapkowe). System CMS może być wykorzystywany nie tylko w prostych badaniach sferoidalnych, ale także w badaniach organoidów 3D, w celu uwzględnienia struktur narządów ludzkich.

Protocol

1. Produkcja chipów do hodowli sferoidów na bazie mikroprzepływów (CMS)

1. Wykonaj formy PC dla górnej i dolnej warstwy chipa kultury CMS za pomocą obróbki CNC. Szczegółowe wymiary chipa podane są w Rysunek 1.
2. Mieszać bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku 10:1 (w/w) przez 5 minut i umieścić w eksykatorze na 1 godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
3. Po przelaniu mieszaniny PDMS do form chipa hodowlanego CMS należy usunąć pęcherzyki powietrza jeszcze przez 1 godzinę i utwardzić w komorze grzewczej w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.
4. Umieść je w odkurzanej myjce plazmowej powierzchniami, które mają być klejone, i wystawiaj je na działanie plazmy wspomaganej powietrzem o mocy 18 W przez 30 s.
5. Sklej dwie warstwy chipa hodowlanego CMS i umieść go w komorze grzewczej w temperaturze 80 °C na 30 minut, aby zwiększyć siłę przyczepności.
6. Wysterylizuj chip hodowlany CMS w sterylizatorze autoklawu w temperaturze 121 °C i 15 psi.

2. Przygotowanie komórek

1. Rozmrozić 1 ml fiolki zawierającej 5 × 10⁵–1 × 10⁶ komórek hASC lub MRC-5s w łaźni wodnej w temperaturze 36,5 °C przez 2 minuty.
2. Dodaj 1 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do fiolki i delikatnie wymieszaj z pipetą o pojemności 1 000 μl.
3. Umieścić 15 ml DMEM podgrzanego do temperatury 36,5 °C na szalce Petriego o średnicy 150 mm za pomocą pipety i dodać komórki z fiolki.
4. Po 1 dniu odessać DMEM i zastąpić go 15 ml świeżego DMEM. Następnie zmieniaj nośnik co 2 lub 3 dni.
5. Aby oderwać komórki od szalki Petriego, dodaj 4 ml trypsyny do szalek Petriego i umieść je w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C i 5% CO₂ na 4 minuty.

3. Monokulturowe formowanie sferoidów

1. Umieść 2,5 ml 4% (w/v) roztworu pluronicznego F-127 w otworze wlotowym chipa hodowlanego CMS (Rysunek 2A), obracając chip z prędkością 500–1 000 obr./min, a następnie obracaj chip z prędkością 4 000 obr./min przez 3 minuty za pomocą systemu CMS ( Rysunek 2B).
   UWAGA: Powłoka pluronowa zapobiega przyczepianiu się ogniw do portu wlotowego podczas obracania się chipa. Upewnij się, że powietrze nie jest uwięzione w mikrostudzienkach.
2. Inkubować chip kulturowy CMS wypełniony roztworem pluronicznym przez noc w temperaturze 36,5 °C w 5% CO₂ .
3. Usuń roztwór pluroniczny, wypłucz pozostały roztwór pluroniczny DMEM i susz wiór przez 12 godzin na czystej ławce.
4. Dodaj 2,5 ml DMEM do chipa hodowlanego CMS i obracaj chip z prędkością ~ 4,000 obr./min przez 3 minuty w celu wstępnego zwilżenia wnętrza chipa.
5. Zatrzymaj rotację i wyciągnij 100 μl DMEM, aby zrobić miejsce na wstrzyknięcie zawiesiny komórek.
6. Dodać 100 μl zawiesin komórkowych zawierających 5 × 10⁵ hASC lub 8× 10⁵ MRC-5 przez pipetowanie Równomiernie rozprowadzić komórki, pipetując 3–5 razy w celu ponownego wymieszania.
7. Obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty, aby uwięzić komórki w każdej mikrostudzience za pomocą siły odśrodkowej.
   UWAGA: Nadmierna prędkość obrotowa może spowodować ucieczkę komórek przez otwory wyrzutowe roztworu.
8. Hoduj komórki przez 3 dni w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5% CO_{2 ,} obracając się z prędkością 1 000–2 000 obr./min. Zmieniaj pożywkę hodowlaną każdego dnia.

4. Formacja sferoidów kokultury

1. Powstawanie koncentrycznych sferoid
   1. Dodaj pierwsze ogniwa, 2,5 × 10⁵ hASC i obróć chip z prędkością 3,000 obr./min. Po 3 minutach dodaj drugie ogniwa, 4 × 10⁵ MRC-5 i obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty. Wstrzyknąć łącznie 100 μl zawiesin komórkowych metodą pipetowania. Po wstrzyknięciu ogniw należy zmienić prędkość obrotową na 500-1,000 obr./min.
   2. Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%_CO2, obracając się z prędkością 1 000–2 000 obr./min. Koncentryczne sferoidy powstają w ciągu 24 godzin. W przypadku hodowli długoterminowej należy codziennie zmieniać podłoże hodowlane.
2. Formacja sferoidalna Janusa
   1. Dodać 100 μl zawiesin komórek zawierających pierwsze komórki, 2,5 × 10⁵ hASC, pipetując, podczas gdy chip obraca się z prędkością 500–1000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.
   2. Inkubuj chip w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%_CO2, obracając z prędkością 1,000–2,000 obr./min przez 3 godziny.
   3. Dodać 100 μl zawiesin komórek zawierających drugi zestaw komórek, 4 × 10⁵ MRC-5, pipetując, podczas gdy chip obraca się z prędkością 500–1 000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.
   4. Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%_CO2, obracając się z prędkością 1,000–2,000 obr./min. Sferoidy Janusa powstają w ciągu 24 godzin. W przypadku hodowli długoterminowej należy codziennie zmieniać podłoże hodowlane.
3. Formacja sferoidy kanapkowej
   1. Dodać 100 μl zawiesin komórkowych zawierających pierwsze komórki, 1,5 × 10⁵ hASC, pipetując, gdy chip obraca się z prędkością 500–1 000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.
   2. Inkubuj chip w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%_CO2, obracając z prędkością 1,000–2,000 obr./min przez 3 godziny.
   3. Dodać 100 μl zawiesin komórek zawierających drugie komórki, 3 × 10⁵ MRC-5, pipetując, gdy chip obraca się z prędkością 500–1000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.
   4. Inkubuj chip w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%_CO2, obracając z prędkością 1,000–2,000 obr./min przez 3 godziny.
   5. Dodać 100 μl zawiesin komórek zawierających trzecie komórki, 1,5 × 10⁵ hASC, pipetując, gdy chip obraca się z prędkością 500–1000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.
   6. Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%_CO2, obracając się z prędkością 1 000–2 000 obr./min. Sferoidy warstwowe powstają w ciągu 12 godzin. W przypadku hodowli długoterminowej należy codziennie zmieniać podłoże hodowlane.

5. Barwienie komórek

1. Podgrzej barwnik fluorescencyjny komórki do temperatury pokojowej (20 °C).
2. Dodać 20 μl bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO) na fiolkę, aby uzyskać 1 mM roztwór.
3. Rozcieńczyć fluorescencję do końcowego stężenia roboczego 1 μM za pomocą DMEM.
4. Dodać fluorescencję do zawiesiny komórek i delikatnie zawiesić za pomocą pipety.
5. Inkubować 20 minut w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5% CO_{2 .}

Results

Chip kulturowy CMS o średnicy 6 cm (Rysunek 2) został pomyślnie wykonany zgodnie z powyższym protokołem. Najpierw chip został wykonany oddzielnie od warstwy górnej i dolnej, a następnie połączony ze sobą za pomocą wiązania plazmowego. Powstałe sferoidy można łatwo zebrać, odłączając chip. Kanał chipa hodowlanego CMS składa się z portu wlotowego oraz obszarów centralnych, ślizgowych i mikrodołkowych ( Rysunek 3). Roztwory komórki, pożywki i pluronu są wstrzykiwane przez otwór wlotow...

Discussion

CMS to zamknięty system, w którym wszystkie wstrzyknięte komórki dostają się do mikrostudzienki bez odpadów, co czyni go bardziej wydajnym i ekonomicznym niż konwencjonalne metody generowania sferoid oparte na mikrostudzienkach. W systemie CMS nośnik jest wymieniany co 12–24 godziny przez otwór ssący przeznaczony do wyjmowania nośnika z chipa (rysunek 3A). Podczas procesu zasysania mediów prawie żadne media nie wydostają się z wnętrza mikrostudzienki ze względu na napięcie powierzchniowe mię...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drukarka 3D	Cubicon	3DP-210F
Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (hASC)		ATCC PCS-500-011
Antybiotyko-Antybiotyk	Gibco	15240-062	Zawierał 1% kompletnego podłoża i buforu
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Czerwony CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Grawer obrotowy sterowany numerycznie (CNC)	Roland DGA	EGX-350
Silnik prądu stałego	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Zmodyfikowana pożywka eaggle'a Dulbecco (DMEM)	ATCC	30-2002
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS)	ATCC	30-2200
Płodowa surowica bydlęca	ATCC	30-2020	Zawierała 10% ukończonych pożywki
ludzkich fibroblastów płucnych (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D program do projektowania wspomaganego komputerowo
szalka Petriego Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	do obróbki powierzchniowej
	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanem do 4% (m/v) roztworu
Poliwęglan (PC)	Akrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polidimetylosiloksan (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsyna	Gibco	12604021