Method Article

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

DOI:

10.3791/60399

⸱

November 7th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Graduate School, Chung-Ang University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowa hodowla komórek sferoidalnych może przynieść bardziej użyteczne wyniki w eksperymentach komórkowych, ponieważ może lepiej symulować mikrośrodowiska komórkowe żywego ciała niż dwuwymiarowa hodowla komórkowa. W tym badaniu wyprodukowaliśmy napędzaną silnikiem elektrycznym platformę lab-on-a-CD (compact disc), zwaną odśrodkowym systemem hodowli sferoidalnej opartej na mikroprzepływach (CMS), aby stworzyć trójwymiarowe (3D) sferoidy komórkowe wykorzystujące dużą siłę odśrodkową. To urządzenie może zmieniać prędkości obrotowe, aby wygenerować warunki grawitacyjne od 1 x g do 521 x g. System CMS ma średnicę 6 cm, posiada sto mikrostu mikrostudzienek o wielkości 400 μm i jest wytwarzany przez formowanie z polidimetylosiloksanu w formie poliwęglanowej wstępnie wykonanej przez komputerową maszynę sterowaną numerycznie. Ściana barierowa przy wejściu do kanału systemu CMS wykorzystuje siłę odśrodkową do równomiernego rozprowadzenia komórek wewnątrz chipa. Na końcu kanału znajduje się obszar szkiełka, który umożliwia komórkom wejście do mikrostudzienek. W ramach demonstracji, sferoidy zostały wygenerowane przez monokulturę i kokulturę ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej i ludzkich fibroblastów płuc w warunkach wysokiej grawitacji przy użyciu systemu. System CMS wykorzystywał prosty schemat działania do produkcji sferoid kokultury o różnych strukturach koncentrycznych, janusowych i kanapkowych. System CMS będzie przydatny w badaniach biologii komórki i inżynierii tkankowej, które wymagają hodowli sferoidów i organoidów jednego lub wielu typów komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łatwiej jest symulować biologiczne mikrośrodowiska in vivo za pomocą trójwymiarowej (3D) hodowli komórek sferoidalnych niż za pomocą dwuwymiarowej (2D) hodowli komórek (np. konwencjonalnej hodowli komórek na szalce Petriego), aby uzyskać bardziej realistyczne wyniki eksperymentów1. Obecnie dostępne metody tworzenia sferoidów obejmują technikę wiszącej kropli2, technikę nakładania cieczy3, technikę karboksymetylocelulozy4, technikę mikroprzepływową opartą na sile magnetycznej5, oraz wykorzystanie bioreaktorów6. Chociaż każda me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja chipów do hodowli sferoidów na bazie mikroprzepływów (CMS)

  1. Wykonaj formy PC dla górnej i dolnej warstwy chipa kultury CMS za pomocą obróbki CNC. Szczegółowe wymiary chipa podane są w Rysunek 1.
  2. Mieszać bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku 10:1 (w/w) przez 5 minut i umieścić w eksykatorze na 1 godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
  3. Po przelaniu mieszaniny PDMS do form chipa hodowlanego CMS należy usunąć pęcherzyki powietrza jeszcze przez 1 godzinę i utwardzić w komorze grzewczej w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.
  4. Umieść je w odkurzanej myjce plazmowej powierzchniami, któr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chip kulturowy CMS o średnicy 6 cm (Rysunek 2) został pomyślnie wykonany zgodnie z powyższym protokołem. Najpierw chip został wykonany oddzielnie od warstwy górnej i dolnej, a następnie połączony ze sobą za pomocą wiązania plazmowego. Powstałe sferoidy można łatwo zebrać, odłączając chip. Kanał chipa hodowlanego CMS składa się z portu wlotowego oraz obszarów centralnych, ślizgowych i mikrodołkowych ( Rysunek 3). Roztwory komórki, pożywki i pluronu są wstrzykiwane przez otwór wlotow.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CMS to zamknięty system, w którym wszystkie wstrzyknięte komórki dostają się do mikrostudzienki bez odpadów, co czyni go bardziej wydajnym i ekonomicznym niż konwencjonalne metody generowania sferoid oparte na mikrostudzienkach. W systemie CMS nośnik jest wymieniany co 12–24 godziny przez otwór ssący przeznaczony do wyjmowania nośnika z chipa (rysunek 3A). Podczas procesu zasysania mediów prawie żadne media nie wydostają się z wnętrza mikrostudzienki ze względu na napięcie powierzchniowe mię.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez Program Badań Naukowych Podstawowych (2016R1D1A1B03934418) oraz Program Rozwoju Technologii Biologicznych i Medycznych (2018M3A9H1023141) NRF, a finansowane przez rząd koreański, MSIT.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Drukarka 3DCubicon3DP-210F
Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (hASC)ATCC PCS-500-011
Antybiotyko-AntybiotykGibco15240-062Zawierał 1% kompletnego podłoża i buforu
CellTracker Green CMFDAThermo Fisher ScientificC292510 mM
CellTracker Czerwony CMTPXThermo Fisher ScientificC3455210 mM
Grawer obrotowy sterowany numerycznie (CNC)Roland DGAEGX-350
Silnik prądu stałegoNurielectricity Inc.MB-4385E
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2650
Zmodyfikowana pożywka eaggle'a Dulbecco (DMEM)ATCC30-2002
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS)ATCC30-2200
Płodowa surowica bydlęcaATCC30-2020Zawierała 10% ukończonych pożywki
ludzkich fibroblastów płucnych (MRC-5)ATCCCCL-171
Inventor 2019Autodesk3D program do projektowania wspomaganego komputerowo
szalka Petriego Φ 150 mmJetBiofillCAD010150do obróbki powierzchniowej
Harrick PlasmaPDC-32G
Pluronic F-127Sigma Aldrich11/6/9003Rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanem do 4% (m/v) roztworu
Poliwęglan (PC)AkrylmallAC15PC200 x 200 x 15 mm
Polidimetylosiloksan (PDMS)DowcorningSylgard 184
TrypsynaGibco12604021
Czyszczarka plazmowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing usi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lab on a CD PlatformCentrifugal Microfluidic System3D Cell SpheroidsHuman Adipose Stem CellsHuman Lung FibroblastsPDMS MoldingCNC MachiningPlasma BondingCentrifugal Force DepositionMicrowell Array Culture

Related Articles