Długość włókien neuronalnych w trójwymiarowej strukturze obszaru mózgu jest wiarygodnym parametrem do ilościowego określenia specyficznej integralności strukturalnej neuronów lub zwyrodnienia. W tym artykule opisano na przykład stereologiczną metodę kwantyfikacji do pomiaru długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Stereologiczne oszacowanie długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta mózgu myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Długość aksonów cholinergicznych lub innych neuronów w różnych obszarach mózgu jest często skorelowana z konkretną funkcją regionu. Stereologia jest przydatną metodą ilościowego określania profili neuronalnych różnych struktur mózgu. W tym miejscu przedstawiamy oparty na oprogramowaniu protokół stereologiczny do oszacowania całkowitej długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta (NBM) podstawy przodomózgowia. Metoda wykorzystuje sondę z kosmiczną kulą do oszacowania długości. Włókna cholinergiczne są wizualizowane za pomocą barwienia immunologicznego acetylotransferazy choliny (ChAT) za pomocą systemu wykrywania peroksydazy chrzanowej i diaminobenzydyny (HRP-DAB). Protokół barwienia jest również ważny do szacowania liczby włókien i komórek w różnych obszarach mózgu za pomocą oprogramowania stereologicznego. Protokół stereologiczny może być stosowany do szacowania dowolnych profili liniowych, takich jak włókna cholinoceptywne, włókna dopaminergiczne/katecholaminergiczne, włókna serotoninergiczne, procesy astrocytów, a nawet profile naczyniowe.
Wprowadzenie
Ilościowe szacunki długości i/lub gęstości włókien nerwowych w mózgu są ważnymi parametrami badań neuropatologicznych. Długość aksonów cholinergicznych, dopaminergicznych i serotoninergicznych w różnych regionach mózgu jest często skorelowana z określonymi funkcjami tego regionu. Ponieważ rozmieszczenie tych aksonów jest na ogół niejednorodne, stosuje się stereologię opartą na projekcie, aby uniknąć błędu systematycznego podczas pobierania próbek. Sonda kosmiczna typu space ball została zaprojektowana, aby zapewnić wydajne i wiarygodne pomiary struktur przypominających linie, takich jak włókna neuronalne w obszarze zainteresowania1. Sonda tworz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące korzystania z tych zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Kansas City Veterans Affairs Medical Center. Do eksperymentów wykorzystano osiemnastomiesięczne myszy z nadekspresją szwedzkiego zmutowanego białka prekursorowego beta-amyloidu (APPswe) i ich rodzeństwo z miotu C57/BL6 WT. Szczegóły dotyczące hodowli i genotypowania znajdują się w He et al.8.
1. Perfuzja i przetwarzanie tkanek
- Znieczulenie myszy za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego z ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). Ściśnij palce u stóp, aby potwier....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Tabeli 1 oraz na Rysunku 5. Grupa C, zidentyfikowana jako grupa APPswe (APP), wykazała znacznie mniejszą długość włókien (Rysunek 5B) oraz mniejszą gęstość długości włókien (Rysunek 5C) w porównaniu do rówieśników typu dzikiego (WILD). Wyniki wykazały, że nie istniała istotna różnica w objętości NBM pomiędzy dwiema analizowanymi grupami (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj demonstrujemy metodę szacowania gęstości włókien cholinergicznych w NBM za pomocą sondy z kosmiczną kulą (kulą). Ta sonda szacuje całkowitą długość światłowodu w obszarze zainteresowania. Całkowitą długość można podzielić przez objętość regionu, aby uzyskać gęstość włókien. Do oszacowania objętości regionu wykorzystano metodę zliczania punktów Cavalieriego. Metoda zliczania punktów Cavalieriego jest bezstronnym i wydajnym estymatorem objętości referencyjnej 3D dla dowolnego regionu. Metoda oblicza oszacowanie powie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty dla W.Z.S. z Służby Badań i Rozwoju Medycznego, Departamentu Spraw Weteranów (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Stowarzyszenia Alzheimera (NPSPAD-11-202149) oraz zasobów z Midwest Biomedical Research Foundation.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw ABC | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Przeciwciało anty-ChAT | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bydlęca surowica anty-koziowa IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Surowica bydlęca, dorosła | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Kriostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Glikol etylenowy | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Nadtlenek wodoru | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Zestaw Immpact-DAB | Vector Laboratories | SK4105 | Ulepszony roztwór substratu peroksydazy DAB |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Mikroskop | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Wyposażony w zmotoryzowany stolik i kolorową kamerę cyfrową IMI-tech |
| Optymalna temperatura skrawania (O.C.T.) medium do zatapiania | Mikroskopia elektronowa Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Podłoże montażowe Permount | Mikroskopia elektronowa Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Oprogramowanie stereologiczne | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | zainstalowany na komputerze stacjonarnym firmy Dell. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany | Zjednoczone T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base Tris |
| , chlorowodorek Trizma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris chlorowodorek |
| Ksylazyna | Bayer, Leverkusen, Niemcy | Ksyleny Rompun | |
| stopień histologiczny | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
Bibliografia
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer dise....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
