Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60409

⸱

15 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Department of Ophthalmology, Second Xiangya Hospital of Central South University, 4Department of Ophthalmology, Veterans Affairs Palo Alto Health Care

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół indukowania nadciśnienia ocznego i neurodegeneracji jaskry w oczach myszy poprzez dokomorowe wstrzyknięcie oleju silikonowego oraz procedurę usuwania oleju silikonowego z przedniej komory w celu przywrócenia podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego do normy.

Streszczenie

Podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) jest dobrze udokumentowanym czynnikiem ryzyka jaskry. Tutaj opisujemy nowatorską, skuteczną metodę konsekwentnego wywoływania stabilnego wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego u myszy, która naśladuje pooperacyjne powikłanie stosowania oleju silikonowego (SO) jako środka tamponadowego w chirurgii witreoretinalnej u ludzi. W tym protokole SO jest wstrzykiwany do przedniej komory oka myszy w celu zablokowania źrenicy i zapobieżenia napływowi cieczy wodnistej. Tylna komora gromadzi ciecz wodnistą, a to z kolei zwiększa ciśnienie wewnątrzgałkowe tylnego segmentu. Pojedyncze wstrzyknięcie SO powoduje niezawodne, wystarczające i stabilne podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego, co wywołuje znaczne zwyrodnienie neurodegeneracji jaskry. Ten model jest wiernym odwzorowaniem jaskry wtórnej w klinice okulistycznej. Aby jeszcze bardziej naśladować warunki kliniczne, SO można usunąć z komory przedniej, aby ponownie otworzyć drogę drenażową i umożliwić dopływ cieczy wodnistej, która jest odprowadzana przez siatkę beleczkową (TM) pod kątem komory przedniej. Ponieważ ciśnienie wewnątrzgałkowe szybko wraca do normy, model można wykorzystać do zbadania wpływu obniżenia ciśnienia wewnątrzgałkowego na komórki zwojowe siatkówki jaskrowej. Metoda ta jest prosta, nie wymaga specjalnego sprzętu ani powtarzania procedur, ściśle symuluje sytuacje kliniczne i może mieć zastosowanie do różnych gatunków zwierząt. Mogą być jednak wymagane drobne modyfikacje.

Wprowadzenie

Postępująca utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC) i ich aksonów jest cechą charakterystyczną jaskry, powszechnej choroby neurodegeneracyjnej w siatkówce1. Do 2040 roku dotknie ponad 100 milionów osób w wieku 40-80 lat2. IOP pozostaje jedynym modyfikowalnym czynnikiem ryzyka w rozwoju i progresji jaskry. Aby zbadać patogenezę, progresję i potencjalne metody leczenia jaskry, konieczny jest wiarygodny, powtarzalny i indukowalny eksperymentalny model nadciśnienia ocznego/jaskry, który replikuje kluczowe cechy pacjentów.

IOP zależy od dopływu cieczy wodnistej do przedniej komory z ciała rzęskowego w komorze tylnej i odpływu przez siatkę beleczkową (TM) pod kątem przedniej komory. Po osiągnięciu stanu ustalonego ciśnienie wewnątrzgałkowe jest utrzymywane. Gdy dopływ przekracza odpływ lub jest od niego mniejszy, IOP odpowiednio wzrasta lub spada. Zmniejszając odpływ wody wodnistej poprzez zamknięcie kąta komory przedniej lub uszkodzenie TM, ustalono kilka modeli jaskry3,4,5,6,7,8,9,10. Modele te są zwykle związane z nieodwracalnym uszkodzeniem tkanki oka, a wysokie ciśnienie wewnątrzgałkowe w komorze przedniej powoduje również niepożądane powikłania, takie jak obrzęk rogówki i zapalenie wewnątrzgałkowe, co utrudnia wykonywanie i interpretację obrazowania siatkówki i oznaczania funkcji wzrokowych.

Aby opracować model, który przezwycięży te niedociągnięcia, skupiliśmy się na dobrze udokumentowanej wtórnej jaskrze spowodowanej przez olej silikonowy (SO), która występuje jako pooperacyjne powikłanie ludzkiej chirurgii witreoretinalnej11,12. SO jest stosowany jako tamponada w operacjach siatkówki ze względu na wysokie napięcie powierzchniowe. Jednak SO może fizycznie zasłaniać źrenicę, ponieważ jest lżejszy niż płyny wodne i szkliste, co zapobiega przepływowi wody wodnistej do komory przedniej. Niedrożność powoduje podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego w komorze tylnej z powodu nagromadzenia cieczy wodnistej. To zmotywowało nas do opracowania i scharakteryzowania nowego mysiego modelu nadciśnienia ocznego opartego na dokomorowym wstrzyknięciu SO i bloku źrenic13, z kluczowymi cechami jaskry wtórnej: efektywną blokadą źrenic, znacznym wzrostem ciśnienia wewnątrzgałkowego, które może powrócić do normy po usunięciu SO, oraz neurodegeneracją jaskrową.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół leczenia nadciśnienia ocznego wywołanego SO w oku myszy, w tym wstrzykiwanie i usuwanie SO oraz pomiar IOP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanforda.

1. Indukcja nadciśnienia ocznego przez dokomorowe wstrzyknięcie SO

  1. Przygotować szklaną mikropipetę do dokomorowego wstrzyknięcia SO, pociągając szklaną kapilarnę za pomocą ściągacza do pipet w celu wytworzenia mikropipety. Wytnij otwór na końcówce mikropipety i dalej naostrz końcówkę za pomocą mikroszlifierki do ukosowania, aby uzyskać fazę 35°−40°.
  2. Wypoleruj krawędzie skosu i usuń wszelkie zanieczyszczenia, myjąc wodą. Autoklaw mikropipety przed użyciem.
  3. Przygotuj igłę paracentezy do wejścia do rogówki. W tym celu należy przymocować igłę 32 G do strzykawki o pojemności 5 ml na zamku Luer i dodatkowo zabezpieczyć ją taśmą. Zegnij końcówkę igły skośną do góry pod kątem 30°.
  4. Przygotować wstrzykiwacz SO, najpierw mocując i zabezpieczając końcówkę igły 18 G na strzykawce o pojemności 10 ml. Następnie przymocuj plastikową rurkę z igłą 18 G na jednym końcu i napełnij SO w razie potrzeby przez drugi koniec.
  5. Przymocuj wysterylizowaną mikropipetę do plastikowej rurki i naciśnij tłok strzykawki, aby napełnić całą mikropipetę SO.

2. Wstrzyknięcie SO dokomorowe na jedno oko

  1. Umieść 9-10-tygodniowego samca myszy C57B6/J w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem zmieszanym z tlenem w tempie 2 l/min przez 3 minuty.
  2. Wstrzyknąć dootrzewnowo 2,2,2-tribromoetanol w stężeniu 0,3 mg/g masy ciała.
    UWAGA: W przeciwieństwie do ketaminy/ksylazyny, 2,2,2-tribromoetanol nie powoduje widocznego rozszerzenia źrenicy.
  3. Sprawdź, czy nie ma reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i brak ruchu wąsów lub ogona, aby określić siłę znieczulającą.
  4. Umieść mysz w pozycji bocznej na platformie chirurgicznej. Aby zmniejszyć jej wrażliwość podczas zabiegu, przed wstrzyknięciem należy nanieść na rogówkę jedną kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy.
  5. Wykonaj nacięcie wejściowe igłą paracentezy 32 G w kwadrancie nadskroniowym, około 0,5 mm od rąbka.
  6. Tunel przez warstwy rogówki na około 0,3 mm przed przebiciem do komory przedniej. Uważaj, aby nie dotknąć obiektywu ani przysłony.
  7. Powoli wyjmować igłę, aby uwolnić trochę cieczy wodnistej (około 1-2 μl) z przedniej komory przez tunel (paracenteza).
  8. Odczekaj ~8 min, aby jeszcze bardziej zmniejszyć IOP. Można to określić, mierząc przeciwległe, kontrolne oko.
  9. Wprowadzić szklaną mikropipetę z fabrycznie załadowanym SO przez tunel rogówki do komory przedniej, skosem skierowanym w dół do powierzchni tęczówki.
  10. Powoli naciskać tłok strzykawki, aby wstrzyknąć SO do przedniej komory, aż kropla SO pokryje większość powierzchni tęczówki o średnicy ~2,3−2,4 mm.
  11. Pozostaw mikropipetę w komorze przedniej na kolejne 10 sekund, a następnie powoli ją wyjmij.
  12. Delikatnie popchnij górną powiekę, aby zamknąć nacięcie rogówki, aby zminimalizować wyciek SO.
  13. Nałóż maść z antybiotykiem (bacytracyna-neomycyna-polimyksyna) na powierzchnię oka.
  14. W trakcie zabiegu należy często zwilżać rogówkę sztucznymi łzami.
  15. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.

3. Usunięcie SO

  1. Przygotuj system nawadniania.
    1. Przygotuj roztwór do nawadniania zgodnie z instrukcjami producenta i umieść go w butelce do irygacji. Podnieś butelkę z roztworem do irygacji na wysokość 110−120 cm (81−88 mmHg) nad platformą chirurgiczną.
    2. Podłączyć zestaw do podawania dożylnego do butelki z roztworem do irygacji. Usuń pęcherzyki powietrza z rurki dożylnej. Podłącz igłę 33 G wygiętą pod kątem 20° do rurki dożylnej.
  2. Aby przygotować system drenażowy, należy wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 1 ml. Podłączyć igłę 33 G do strzykawki i zgiąć igłę pod kątem 20°.
  3. Usunąć SO z komory przedniej.
    1. Wstrzyknąć dootrzewnowo 2,2,2-tribromoetanol (0,3 mg/g masy ciała). Sprawdź, czy nie ma reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić siłę znieczulenia i brak ruchu wąsów lub ogona.
    2. Umieść mysz na platformie chirurgicznej i zabezpiecz ją w pozycji bocznej taśmą. Nałóż jedną kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy na rogówkę, aby zmniejszyć jej wrażliwość.
    3. Wykonaj dwa nacięcia w kwadrancie skroniowym rogówki między godziną ~2 a 5 na krawędzi kropli SO za pomocą wstępnie przygotowanej igły do paracentezy 32 G.
    4. Wprowadzić igłę irygacyjną o sile 33 G podłączoną do roztworu irygacyjnego przez jedno nacięcie rogówki, z maksymalną prędkością.
    5. Wprowadzić kolejną igłę drenażową 33 G dołączoną do strzykawki bez tłoka przez drugie nacięcie rogówki, aby umożliwić kropli SO opuszczenie komory przedniej podczas irygacji roztworem irygacyjnym.
    6. Wyjmij igłę drenażową, a następnie igłę do irygacji.
    7. Wstrzyknij pęcherzyk powietrza do przedniej komory, aby utrzymać jego normalną głębokość i naciśnij, aby zamknąć nacięcie rogówki.
    8. Nałóż maść z antybiotykiem na oba oczy.
    9. Trzymaj mysz na podkładce regenerującej ogrzewanie, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.

4. Pomiar IOP raz w tygodniu

  1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej wypełnionej 3% izofluranem zmieszanym z tlenem w ilości 2 l/min na 3 minuty.
  2. Wstrzykiwać dootrzewnowo ksylazynę i ketaminę (0,01 mg ksylazyny/g, 0,08 mg ketaminy/g).
  3. Utrzymuj rogówkę wilgotną, stosując sztuczne łzy przez cały czas trwania zabiegu.
  4. Odczekaj około 15 minut, aby źrenica mogła się w pełni rozszerzyć.
  5. Zmierz ciśnienie wewnątrzgałkowe obu oczu za pomocą tonometru zgodnie z instrukcją produktu. Zbliż tonometr do oka myszy. Zachowaj odległość od końcówki sondy do rogówki myszy na poziomie około 3−4 mm. Naciśnij przycisk pomiaru 6x, aby wygenerować jeden odczyt. Z każdego oka uzyskuje się trzy odczyty generowane maszynowo w celu uzyskania średniego ciśnienia wewnątrzgałkowego.
  6. Uśmierc zwierzęta po 8 tygodniach od wstrzyknięcia SO i przeprowadź immunohistochemię całej siatkówki, liczenie RGC, półcienkie odcinki nerwu wzrokowego (ON) i kwantyfikację aksonów, które przeżyły, co zostało opisane wcześniej13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wkrótce po wstrzyknięciu można łatwo zidentyfikować myszy, u których nie rozwija się stabilne nadciśnienie wewnątrzgałkowe z powodu zbyt małego rozmiaru kropel SO (≤1,5 mm)13. Zwierzęta te są wykluczane z dalszych eksperymentów. Po wykonaniu procedur wstrzykiwania, u ponad 80% myszy z podaną substancją SO powstają krople o rozmiarze większym niż 1,6 mm. Mierzyliśmy IOP tych oczu raz w tygodniu przez 8 tygodni po pojedynczym wstrzyknięciu SO. IOP oka z podaną substancją SO pozostawało wysokie, zazw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy prostą, ale skuteczną procedurę indukowania trwałego wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego w oku myszy poprzez dokomorowe wstrzyknięcie SO. Tej procedury może się szybko nauczyć każdy, kto ma doświadczenie w mikrodysekcji pod mikroskopem. Podstawowym potencjalnym ryzykiem niepowodzenia jest wyciek SO z nacięcia rogówki. Jednak jedną z zalet stosowania SO jest to, że ponieważ kropla oleju jest widoczna i mierzalna, możemy łatwo zidentyfikować myszy, które otrzymały kropelki zbyt małe, aby wywołać stabilne n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty NIH EY024932, EY023295 i EY028106 dla YH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% chlorowodorek proparakainyAkorn, Somerset
10 ml strzykawkaBDLuer-Lok Tip
18G igłaBDze zwykłym skosem, długość igły: 25,4 mm
2,2,2-tribromoetanol (Avertin)Fisher ScientificCAS# 75-80-950g
32G nanoBD320122BD Nano Ultra cienka igła do długopisu-32G 4mm
Igła okulistyczna 33GTSK/ VWRTSK3313/ 10147-200
5mL strzykawkaBDLuer-Lok Tip
AnaSed Injection (ksylazyna)Butler Schein100 mg/ml, 50 ml
sztuczne łzyAlcon Laboratories300651431414Systane Ultra Lubricant Krople do oczu
BSS PLUS Roztwór nawadniającyAlcon Laboratories
65080050 Dwustopniowy szklany ściągacz do mikropipetNARISHIGEPC-10
EZ-7000 Klasyczny systemEZ System
IzofluranVetOne502017izofluran, USP, 250 ml / butelkę
IV Zestawy do podawaniaEXELint/ Fisher29081
CHLOROWODOREK KETAMINY DO WSTRZYKIWAŃVEDCO50989-996-06KETAVED 100mg/ml * 10ml
maszyna do fazowania microgrindNARISHIGEEG-401
Miniaturowe rurki EVAMcMaster-Carr1883T40,05 "ID, 0,09" OD, 10 stóp długości
oleju silikonowego (SILIKON)Alcon Laboratories80656011851,000 mPa.s
Standardowe kapilary szklaneWPI/ Fisher1B150-44 cale. (100 mm) OD 1,5 mm ID 0,84 mm
TonoLab TonoLabColonial Medical Supply, Finlandia
weterynaryjna maść antybiotykowaDechra Veterinary1223RXBNP maść okulistyczna, Vetropolycin

Bibliografia

  1. Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
  4. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
  5. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
  7. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  8. Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
  9. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  10. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  11. Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
  12. Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
  13. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
  14. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  15. Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
  16. Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wtryskiwanie oleju silikonowegopodwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowegooperacja oka myszyprocedura w komorze przedniejneurodegeneracja jaskrowatechnika pomiaru IOPusuwanie oleju silikonowegostosowanie tonometruanaliza komórek zwojowych siatkówki
Odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.