Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60410

⸱

9 stycznia 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology and Genetics, Ben-Gurion University of the Negev, 2Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Human Oncology & Pathogenesis Program (HOPP), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Institute of Pathology, Barzilai University Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Rozwój modeli mysich z specyficznymi genami zmutowanymi u pacjentów z rakiem głowy i szyi jest niezbędny do zrozumienia nowotworów. W tym miejscu przedstawiamy protokół transformacji in vitro pierwotnych komórek języka myszy przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem do generowania mysich linii komórkowych HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi.

Streszczenie

Użycie pierwotnych normalnych komórek nabłonkowych umożliwia powtarzalne wywoływanie zmian genomowych wymaganych do transformacji komórkowej poprzez wprowadzanie specyficznych mutacji w onkogenach i genach supresorowych, przy użyciu technologii edycji genomu opartej na CRISPR (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats) u myszy. Technologia ta pozwala nam dokładnie naśladować zmiany genetyczne zachodzące w nowotworach u ludzi za pomocą myszy. Poprzez genetyczną transformację mysich komórek pierwotnych możemy lepiej badać rozwój, progresję, leczenie i diagnozę raka. W tym badaniu wykorzystaliśmy indukowane przez Cre-indukowane komórki nabłonka języka myszy Cas9, aby umożliwić edycję genomu za pomocą wirusa związanego z adenowirusem (AAV) in vitro. W szczególności, zmieniając KRAS, p53 i APC w normalnych komórkach nabłonka języka, wygenerowaliśmy mysią linię komórkową raka głowy i szyi (HNC) in vitro, która jest rakotwórcza u myszy syngenicznych. Przedstawiona tutaj metoda szczegółowo opisuje, w jaki sposób generować linie komórkowe HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi i wyjaśnia ich przydatność do przewidywania progresji guza u myszy syngenicznych. Przewidujemy, że ta obiecująca metoda będzie pouczająca i przydatna do badania biologii nowotworów i terapii HNC.

Wprowadzenie

HNC jest powszechnym nowotworem złośliwym na całym świecie1. Modelowanie genezy neoplazji HNC znajduje się obecnie w naukowym punkcie zwrotnym2. Chociaż wiele mutacji genetycznych zostało zidentyfikowanych w HNC2,3,4 (np. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 i RAS), konkretne kombinacje zmian genomowych wymaganych do wywołania HNC pozostają niejasne.

Obecne wykorzystanie ludzkich linii komórkowych HNC znacząco pomogło wyjaśnić mechanizmy związane z patogenezą i leczeniem3. Jednak badanie ludzkich linii komórkowych w mysich systemach z obniżoną odpornością ma swoje ograniczenia, ponieważ systemy te nie zajmują się procesem nowotworowym in vivo, rolą określonych mutacji genowych i odpowiedziami na leczenie w mikrośrodowisku immunologicznym. W związku z tym opracowanie i ustanowienie mysich linii komórkowych ze specyficznymi zmianami genetycznymi ma zasadnicze znaczenie dla zbadania, w jaki sposób różne geny przyczyniają się do procesu transformacji i przetestowania nowych terapii opartych na cząsteczkach na myszach immunokompetentnych.

Badania funkcji genów w badaniach biomedycznych zostały znacząco dotknięte przez postęp w technologiach edycji DNA, poprzez wprowadzenie dwuniciowych pęknięć (DSB), na przykład5. Technologie te, w tym wykorzystanie nukleaz palca cynkowego, nukleaz efektorowych podobnych do aktywatorów transkrypcji oraz zgrupowanych regulatorowych krótkich powtórzeń palindromowych (CRISPR/Cas9), pozwalają na manipulowanie dowolnym genem będącym przedmiotem zainteresowania w jego locus. Najnowsze systemy CRISPR/Cas9 składają się z przewodnika RNA (gRNA), który kieruje nukleazą Cas9 w celu wygenerowania DSB w określonym miejscu w genomie. System ten zyskał szerokie uznanie w modyfikowaniu endogennych genów w dowolnej komórce lub tkance docelowej, nawet w najbardziej tradycyjnie trudnych do leczenia organizmach5. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi systemami ze względu na swoją prostotę, szybkość i wydajność.

W onkologii, technologia CRISPR/CAS9 zaspokoiła potrzebę skutecznego naśladowania komórek rakowych. Aby ustalić ten system w HNC, manipulowaliśmy silnym onkogenem KRAS i dwoma ważnymi genami supresorowymi nowotworów, APC i p536. Według bazy danych GENIE7, ta kombinacja jest rzadka w HNC. Mutacje RAS (HRAS, NRAS, KRAS) są obecne tylko w ~7% wszystkich populacji HNC. Guzy te są zwykle oporne na terapię8,9.

Dostarczanie Cas9 i jego gRNA odbywa się poprzez transdukcję wirusa za pomocą AAV lub lentiwirusów. Rekombinowany AAV jest często preferowaną metodą dostarczania genów do komórek docelowych ze względu na wysokie miano, łagodną odpowiedź immunologiczną, zdolność do transdukcji szerokiego zakresu komórek i ogólne bezpieczeństwo. Korzystając z systemu AAV, wygenerowano różne linie komórkowe myszy specyficzne dla tkanek, a nowe linie komórkowe są nadal opracowywane10,11,12. Jednak wydajny system edycji genomu, który może generować mysie modele linii komórkowych HNC, nie został jeszcze opracowany. W tym badaniu staraliśmy się opracować system oparty na AAV-Cas9 in vitro do przekształcania pierwotnych komórek języka myszy w stan rakotwórczy. Ten unikalny protokół transformacji CRISPR/Cas9 i ustalona linia komórek nowotworowych mogą być wykorzystane do lepszego zrozumienia biologii HNC indukowanej przez różnorodne zmiany genomowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Ben Guriona w Negev. Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez IACUC (IL.80-12-2015 i IL.29-05-2018(E)). Wszystkie aspekty testów na zwierzętach, pomieszczeń i warunków środowiskowych wykorzystanych w tym badaniu były zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych13.

1. Produkcja wirusów związanych z adenowirusem

  1. Dzień 1: Hodowla komórkowa
    1. Wysiew 4 x 106 HEK293T komórek na płytkę 14,5 cm w 15 ml DMEM. Przygotować 10 płytek do transfekcji polietyleniną (PEI) (1 μg/μL).
  2. Dzień 2: Transfekcja komórek HEK293T za pomocą PEI
    1. Usuń pożywkę i ponownie podaj ciepłym DMEM na 1 godzinę przed transfekcją.
    2. Podgrzewane odczynniki do transfekcji i DMEM.
    3. Użyć 10 μg plazmidu będącego przedmiotem zainteresowania zawierającego AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 μg plazmidu kapsydu AAV 2/9n (z genem rep AAV2 i genem kapsydu AAV9 oraz 10 μg plazmidu pomocniczego (pAdDelta F5 helper) na płytkę (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Dostępna jest nowa generacja plazmidu pomocniczego - pAdDeltaF614,15,16, który może być również używany do produkcji AAV.
    4. Wymieszaj plazmidy w 1 ml zwykłego DMEM na płytkę. Następnie dodać 90 μl polietyleniminy (całkowity plazmid: stężenie PEI = 1:3) do mieszanki plazmidowej i krótko wirować.
    5. Inkubować mieszaninę PEI-plazmidowego DNA przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Dodawać mieszaninę kroplami na HEK293T komórek i przenosić płytki do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Dzień 3: Zmiana podłoża po transfekcji
    1. Całkowicie usuń pożywkę i dodaj 15 ml świeżego DMEM.
  4. Dzień 5: Zbieranie wirusa
    1. Przygotować kąpiel z suchym lodem i etanolem.
    2. Zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść je do probówek o pojemności 50 ml (2 płytki na probówkę o pojemności 50 ml).
    3. Wiruj probówki o gramaturze 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Odrzucić supernatant ze wszystkich probówek. Dodać 0,5 ml buforu do lizy (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) na płytkę (tj. 5 ml na 10 płytek) tylko do pierwszej probówki. Ponownie zawiesić ogniwa i przenieść całkowitą objętość do następnej probówki i kontynuować do ostatniej probówki.
    5. Przenieść zawiesinę komórek do świeżej probówki o pojemności 50 ml. Przemyć probówki tą samą objętością buforu do lizy (0,5 ml na płytkę) przy użyciu tej samej metody przenoszenia, jak opisano w kroku 1.4.4.
    6. Zawiesinę komórkową należy poddać trzem rundom ~10-minutowych cykli zamrażania/rozmrażania między kąpielą z suchym lodem/etanolem a łaźnią wodną o temperaturze 37 °C. Wiruj krótko po każdym rozmrożeniu.
    7. Jeżeli oczyszczanie przeprowadza się w tym samym dniu, należy ustawić bufor równoważący i elukcyjny (patrz tabela 1 dla receptury) na RT.
    8. Dodać 50 jednostek benzonazy na płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 h.
      UWAGA: Benzonaza służy do trawienia resztkowych kwasów nukleinowych z komórek produkujących gospodarza oraz plazmidowego DNA obecnego w zawiesinie komórki.
    9. Wirować probówki o masie 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Zebrać supernatant do strzykawki za pomocą stalowej igły o sile 18 G i przepchnąć roztwór przez filtr 0,45 μm do probówki o pojemności 15 ml w celu uzyskania surowego lizatu.
    11. Surowy lizat przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni do czasu oczyszczenia lub kontynuowania oczyszczania.

2. Oczyszczanie AAV

  1. Dzień 5 lub później
    1. Umieścić bufor równoważący i elukcyjny w temperaturze pokojowej.
    2. Przemyć kolumny chromatograficzne 10 ml buforu równoważącego.
    3. Dodać 0,5 ml na płytkę heparyny-agarozy do kolumny17, a następnie dodać bufor równoważący (4x objętość heparyny-agarozy). Wymieszaj roztwory, odwracając kolumnę i pozwól agarozie osiąść.
    4. Eluować bufor równowagi z kolumny grawitacyjnie.
      UWAGA: Pozostaw trochę buforu równowagi, aby zapobiec wysychaniu agarozy.
    5. Załadować surowy lizat na kolumnę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C przy stałym mieszaniu. Ustaw kolumnę w pozycji pionowej i pozwól agarozie osiąść.
    6. Eluować surowy lizat grawitacyjnie.
    7. Przemyć kolumnę buforem równoważącym (4 razy objętość heparyny-agarozy).
    8. Umieścić odśrodkowy filtr białkowy o sile 100 kDa pod kolumną i wymyć wirusa za pomocą buforu elucyjnego (3 razy większa objętość heparyny-agarozy) do filtra.
      UWAGA: Bufor elucyjny nie powinien przekraczać 15 ml.
    9. Odwirować filtr przy 3,000 x g przez ~30 minut, aż w filtrze pozostanie mniej niż 1 ml.
    10. Napełnij filtr PBS i odwiruj przy 3,000 x g przez ~30 minut, aż w filtrze pozostanie mniej niż 1 ml. Powtórz ten krok 2 razy, aby usunąć wszystkie sole.
    11. Zagęścić roztwór wirusa w filtrze przez odwirowanie przy 3 000 x g, aby uzyskać jak najmniejszą objętość (mniej niż 200 μl).
    12. Odessać roztwór wirusa za pomocą igły i strzykawki i przepchnąć roztwór przez filtr 0,22 μm do probówki.
    13. Przygotuj porcje skoncentrowanych cząstek wirusa do przechowywania.
      UWAGA: Podwielokrotności powinny wynosić ~20 μL do krótkotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C i ~5 μL do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.
    14. Określ miano wirusa i skuteczność transdukcji wirusa zgodnie z wcześniejszym opisem14,18,19,20.

3. Izolacja i hodowla komórek pierwotnych

  1. Dzień 1
    1. Poddanie eutanazji 6-tygodniowego chłopca lub samicy witaminy B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J przez uduszenie CO2 lub dowolny inny protokół zatwierdzony przez IACUC.
      UWAGA: Te myszy knockin CRISPR / Cas9 mają zależną od rekombinazy Cre ekspresję endonukleazy cas9 i EGFP kierowaną przez promotor CAG. Sekwencja Lox-Stop-Lox (LSL) obecna w genomie tych myszy zapobiega ekspresji Cas9 i EGFP przy braku rekombinazy Cre. W połączeniu z pojedynczymi przewodnikami RNA (sgRNA) i źródłem Cre, umożliwiają edycję jednego lub wielu genów myszy in vivo lub ex vivo14.
    2. Wypreparuj język myszy poddanych eutanazji za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    3. Ręcznie rozdziel tkankę, mieląc tkankę języka na bardzo małe fragmenty za pomocą skalpela. Zbierz fragmenty tkanek w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 4,5 ml zwykłej pożywki RPMI (bez surowicy).
    4. Dodać potrójną mieszaninę enzymów (200 μl) (receptura patrz tabela 1) do fragmentów tkanki.
    5. Inkubować mieszaninę tkankowo-enzymatyczną w temperaturze 37 °C przez 30 minut i stukać w probówkę co 10 minut, aby zwiększyć dysocjację enzymatyczną tkanki.
    6. Dodać 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawierającej HBSS/PBS do mieszaniny tkankowo-enzymatycznej, aby zatrzymać działanie enzymu.
    7. Przefiltruj powyższą zawiesinę komórek przez sterylną siatkę nylonową o grubości 70 μm, aby oddzielić rozproszone komórki i większe fragmenty tkanek.
    8. Przefiltrowaną zawiesinę komórkową przepłukać przez odwirowanie przez 300 x g przez 5 minut w HBSS/PBS w temperaturze pokojowej.
    9. Zawiesić osad w pożywce hodowlanej (10% FBS w RPMI/DMEM) i hodować na szalkach hodowlanych o średnicy 60 mm, aż utworzą się odrębne kolonie komórek.
      1. Agregaty komórek hodowlanych utrzymywane na górze filtra w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm zawierającym 3 ml kompletnej pożywki (10% FBS w RPMI/DMEM) do momentu utworzenia kolonii komórkowych.
    10. Zbadaj mikroskopowo komórki pierwotne pod kątem obecności zanieczyszczenia fibroblastami po 1 tygodniu hodowli. Traktuj pierwotne komórki powstałe z agregatów i zawiesin komórkowych 0,25 trypsyny 0,02% roztworu EDTA w temperaturze 37 °C przez 1 minutę w celu usunięcia fibroblastów.
      UWAGA: Zwykle pierwotna hodowla z agregatów komórkowych wytwarza więcej kolonii w porównaniu z zawiesinami jednokomórkowymi. Komórki z tych kolonii zapewniają lepszą wydajność transdukcji dzięki transdukcji AAV.

4. Transdukcja AAV komórek pierwotnych

  1. Dzień 10
    1. Zasiewaj 2 x 105 komórek pierwotnych na studzienkę w 6 dołkach w 2 ml kompletnej pożywki (10% FBS w RPMI/DMEM).
    2. Następnego dnia należy przeprowadzić transdukcję komórek za pomocą 1012 genomu wirusa/ml (1010 jednostek transdukcyjnych/ml) i inkubować komórki w pożywce zawierającej cząsteczki wirusa przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
    3. Usuń pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa i nakarm komórki transdukowane AAV kompletną pożywką.
      UWAGA: Tylko komórki, które przeszły transdukcję, będą wyrażać GFP i zaczną się namnażać. Komórki, które nie przeszły transdukcji, ostatecznie umrą w ciągu 2 tygodni.
    4. Po 2 tygodniach ekspansji hodowli wysiewaj komórki do walidacji i eksperymentów rakotwórczych in vivo.
      UWAGA: Genomowe DNA z komórek transdukowanych AAV i normalne komórki pierwotne od myszy Cas9 zostały wyekstrahowane w celu walidacji określonej edycji genomu przy użyciu standardowych protokołów. Sekwencjonowanie wyekstrahowanego DNA i analizę zsekwencjonowanych danych (Tabela 2) przeprowadzono przy użyciu testu sekwencjonowania nowej generacji opartego na wychwytywaniu hybrydyzacji (np. platforma MSK-IMPACT), jak opisano wcześniej21.

5. Walidacja przemiany normalnych komórek w komórki rakotwórcze za pomocą immunofluorescencji i western blottingu

  1. Immunofluorescencji
    1. Wysiewaj 2 x 105 komórek na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm i umieść je na noc w inkubatorze.
    2. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS (pH = 7,4) i proces znakowania immunofluorescencyjnego.
    3. Inkubować utrwalone komórki z pierwszym pierwszorzędowym przeciwciałem w 1% BSA lub 1% surowicy w PBST w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Głównymi stosowanymi przeciwciałami są królicze przeciwciało monoklonalne anty-KRT 14, królicze przeciwciało monoklonalne anty-E-kadheryny i mysie przeciwciało mAb Cas9.
    4. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z szkiełek nakrywkowych, przemłukując komórki 3x przez 5 minut 1x PBS.
    5. Inkubować komórki z drugorzędowymi przeciwciałami anty-króliczymi IgG Cy3 osła i/lub kozi Cy3 kozi w 5% BSA w PBST przez 1 godzinę w RT w ciemności.
    6. Usunąć roztwór przeciwciała wtórnego z szkiełek nakrywkowych i umyć komórki 3 razy, jak opisano w kroku 5.1.4.
    7. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą kropli podłoża montażowego zawierającego DAPI (DAPI Fluoromount).
    8. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu zobrazowania szkiełek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Western blotting (zachodnia plama)
    1. Nasiona 1 x 106 przekształconych komórek w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm i umieść je na noc w inkubatorze.
    2. Umyj i zeskrob przekształcone komórki do 200 μl lodowatego PBS.
    3. Odwirować probówkę zawierającą zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    4. Odessać supernatant i poddać lizie komórki przy użyciu buforu do lizy (patrz tabela 1) zawierającego koktajle inhibitorów fosfatazy i inhibitor proteazy przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować lizaty przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i w temperaturze 4 °C i zebrać oczyszczone lizaty.
    5. Użyj dostępnego w handlu zestawu testowego Bradforda, aby określić stężenie białka zgodnie z protokołem producenta. Użyj 4 razy bufor do próbek (500 mM Tris pH = 6,8, 40% glicerol, 8% SDS, 20%H2O, 0,02% błękitu bromofenolowego), aby dostosować próbki białek do 0,5 lub 1 μg/μL. Gotować w temperaturze 96 °C przez 5 min.
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub do czasu przeprowadzenia analizy Western blot.
    6. Oddzielić równe ilości całkowitego lizatu (30 μg) przez 10% elektroforezę w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Upewnij się, że barwnik dotrze do dna żelu. Przenieść białko do membrany nylonowej przez półsuche blot w temperaturze 25 V przez 30 minut.
    7. Wlej 5% BSA w soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS)-0,1% Tween (TBST) na membranę, aby całkowicie ją pokryć. Blokować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować mebrane z pierwszorzędowymi przeciwciałami (anty-Cre, anty-Cas9, anty-GFP, anty-β kateniną, anty p53, anty-fosfo-ERK i anty-β aktyną rozcieńczoną w 5% BSA TBST) w temperaturze 4 °C przez noc.
    8. Po inkubacji myć membrany przez 10 minut 1x TBST, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa membranę. Wykonaj to płukanie 3x, a następnie dodaj przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczone 1:10 000 w 5% BSA TBST) do membrany. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Po inkubacji myć membrany przez 10 minut 1x TBST, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa membranę. Wykonaj obrazowanie chemiluminescencyjne (patrz Tabela materiałów), aby naświetlić pasma i odpowiednio uchwycić obrazy.
  3. Walidacja potencjału rakotwórczego transformowanych komórek u myszy immunokompetentnych
    UWAGA: Myszy były utrzymywane i leczone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi Uniwersytetu Ben-Guriona w Negev. SKINIENIE. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) i myszy C57BL/6 wykorzystano do badań in vivo. Myszy trzymano w przefiltrowanych powietrzem komorach z przepływem laminarnym z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i karmiono je jedzeniem i wodą ad libitum.
    1. Użyj 6-8 tygodniowej samicy NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) i myszy C57BL/6 do badania.
    2. Trypsynizuj komórki przekształcone w AAV-Cas9. Zatrzymaj trypsynizację za pomocą DMEM podgrzanego w temperaturze 37 °C i zbierz w probówce o pojemności 50 ml.
    3. Odwirować probówkę o sile 800 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM bez FBS. Ponownie przeprowadzić wirowanie i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1x PBS.
      UWAGA: Nie trzymaj ogniw w 1x PBS zbyt długo. Zawsze utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.
    4. Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki i rozcieńczyć komórki do pożądanego stężenia (2,5 x 107 komórek/ml) za pomocą 1x PBS. Generuj guzy poprzez podskórne wstrzyknięcie zawiesiny komórkowej przekształconej w AAV-Cas9 w prawą flankę każdego NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) mysz (2 x 106 komórek/mysz). Aby wygenerować model ortotropowy u myszy syngenicznych, wstrzyknij 0,5 × 106 komórek pierwotnych lub komórki przekształcone w AAV-Cas9 do języka myszy immunokompetentnych C57BL / 6.
    5. Poddaj zwierzęta eutanazji 2 tygodnie po wstrzyknięciu przez uduszenie CO2 i wypreparuj guzy od myszy poddanych eutanazji w celu analizy immunohistochemicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystanie systemu AAV do transformacji normalnych komórek Cas9
Rysunek 1 przedstawia szczegółową mapę wektora plazmidu transgenu AAV użytego w niniejszym badaniu. Rysunek 2 przedstawia schemat budowy i zasadę działania systemu opartego na AAV-Cas9. W celu wytworzenia cząstek wirusowych komórki HEK293T przetransfekowano wektorem transgenu AAV oraz innymi wektorami pakującymi wirusa przy użyciu metody trans...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kilka metod było wcześniej stosowanych do przekształcania komórek pierwotnych w hodowli ze zmiennym stopniem powodzenia 25,26,27,28. Większość z tych metod wykorzystuje mysie komórki fibroblastów do transformacji 14,17,18,19 lub wykorzystuje czynniki rakotwórcze, takie jak tlenek 4-nitrochinolino-1 (4-NQO)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

M.S. jest członkiem Rady Doradczej Instytutu Nauk Biologicznych, a Menarini Ricerche otrzymała fundusze na badania od Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics i Menarini Ricerche. M.S. jest również współzałożycielem Medendi Medical Travel, a w ciągu ostatnich 2 lat otrzymał honoraria od Menarini Ricerche i ADC Pharma. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Dr. Danielowi Gitlerowi za dostarczenie nam plazmidu pAd Delta 5 Helper. Ta praca została sfinansowana przez Izraelską Fundację Naukową (ISF, 700/16) (dla ME), Amerykańsko-Izraelską Dwunarodową Fundację Naukową (BSF, 2017323) (dla ME i MS), Izraelskie Stowarzyszenie Raka (ICA, 20170024) (dla ME), Izraelską Fundację Badań nad Rakiem (ICRF, 17-1693-RCDA) (dla ME) oraz Concern Foundation (#7895) (dla ME). Stypendium: stypendium Alon dla ME i stypendia BGU Kreitman dla SJ i MP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała
Anti mysie HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anty królik HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Mysiatechnologia sygnalizacji komórkowej14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure Kozia anty-mysia IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Technologia sygnalizacji komórkowej4370
Królicza monoklonalnatechnologiasygnalizacji komórkowej anty E kadheryny3195S
Królik monoklonalny anty-KRT 14AbcamAB-ab181595
i beta; aktynaMP Biomedicals691001
i beta; kateninaTechnologia sygnalizacji komórkowej9582S
Linie komórkowe
HEK93TATCCCRL-3216
Podłoża hodowlane, chemikalia i odczynniki
Bradford OdczynnikBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI fluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova i Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 i XLS071.0250
FBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Heparyna - AgarozaSigmaH6508
Izolat II Zestaw genomowego DNABiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries Izrael Beit-Haemek Sp. z o.o.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Roztwór paciorkowcapióra Przemysł biologiczny Izrael Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biotechnology30525-89-4
Koktajl inhibitorów fosfatazBiotoolB15001A/B
Koktajl inhibitorów proteazyMilliporeSigmaP2714-1BTL
Bufor TrisMERCK Millipore648311-1KG
silny>Enzymy
BenzonaseSigmaE1014
Kolagenaza IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HialuronidazaMilliporeSigmaH3506
TrypsynaBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Wyroby szklane
Szkiełka nakrywkoweBar Naor BNCB00130RA1
SlidesBar NaorBN9308C
Szczepy myszy
C57BL/6Envigo
B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITUprzejmy prezent od dr Randalla J. Platta i dr Josepha Rosenbluha, Broad Institute of MIT i Harvardu, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 wektor kapsyduAddgene112865
pAD Delta F5pomocnik Ben Guriona Uniwersytet NegevDostarczone przez dr Daniela Gitlera, Wydział Fizjologii i Biologii Komórki, Wydział Nauk o Zdrowiu oraz Złotowski Center for Neuroscience, Uniwersytet Ben-Guriona w Negev, Beer-Sheva 84105, Izrael.
Wyroby z tworzyw sztucznych
Amicon-ULTRA filtr 100 KDaMilliporeUFC910024
0,22 µ m filtry sterylne, 4 mmMillexSLGV004SL
0,45 &; m filtry sterylne, 13 mmMillexSLHV013SL
Płytki hodowlaneGreiner Bio-One
Probówki FalconGreiner Bio-One
mAb <

Bibliografia

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75(2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018(2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273(2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854(2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464(2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341(2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281(2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495(2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rak g owy i szyiCRISPR Cas9transdukcja AAVpierwotna hodowla kom rkowakom rki nab onka j zykaedycja gen wtransformacja tumorigennamyszy syngeniczneanaliza immunofluorescencyjnaWestern blotting
Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.