Wykrywanie ustalenia wspólnego dopływu krwi u myszy parabiotycznych przez wstrzyknięcie glukozy do żyły ogonowej

Podsumowanie

Tutaj opisujemy nową metodę wykrywania udanego ustanowienia wspólnego krążenia krwi dwóch parabiontów poprzez wstrzyknięcie glukozy do żyły ogonowej, która powoduje minimalne szkody i nie jest śmiertelna dla parabiontów.

Streszczenie

Parabioza to eksperymentalna metoda chirurgicznego łączenia dwóch równoległych zwierząt wzdłuż osi podłużnej ciała. Przedstawiamy protokół wykrywania pomyślnego ustalenia chimeryzmu krwi u parabiontów poprzez wstrzyknięcie glukozy do żyły ogonowej. Skonstruowano myszy parabiotyczne. Glukozę wstrzyknięto mysz-dawcy przez żyłę ogonową, a wahania poziomu glukozy we krwi mierzono u obu myszy za pomocą glukometru krwi w różnych punktach czasowych. Nasze wyniki wykazały, że po wstrzyknięciu glukozy poziom glukozy we krwi u myszy dawców gwałtownie wzrósł po 1 minucie, a następnie powoli spadał. Tymczasem poziom glukozy we krwi myszy biorców osiągnął szczyt 15 minut po wstrzyknięciu. Podobne wyniki uzyskano w przypadku błękitu Evansa, stosowanego jako kontrola pozytywna dla glukozy. Synchroniczne wahania poziomu glukozy we krwi wskazują, że przepływ krwi między dwiema myszami został pomyślnie ustalony.

Wprowadzenie

Parabioza to metoda modelowania, w której dwa żywe organizmy są łączone ze sobą chirurgicznie i rozwijają się jako jeden system fizjologiczny ze wspólnym układem krążenia¹. Takie modele są szeroko stosowane do badania fizjologii ze względu na zaletę, że substancje wytwarzane przez jednego osobnika mogą działać na oba zwierzęta w tym samym czasie za pośrednictwem wspólnego układu krążenia. Od połowy XIX wieku, kiedy eksperymenty parabiotyczne zostały zapoczątkowane przez Paula², metody konstruowania modeli parabiotycznych stały się ustandaryzowane. Brakowało jednak prostej i wygodnej metody weryfikacji pomyślnego ustalenia chimeryzmu krwi. Doniesiono, że krążenie krzyżowe można z powodzeniem ocenić poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,5% niebieskiego barwnika Evansa do jednego z parabiontów, a następnie pomiar absorbancji błękitu Evansa we krwi obu parabiontów za pomocą czytnika mikropłytek³. Inna metoda wymaga specyficznej rasy myszy, która zawiera monocyty znakowane CD45.1⁺ i CD45.2⁺ w każdym parabiontie. Cytometria komórkowa jest następnie wykorzystywana do określenia chimeryzmu krwi poprzez pomiar częstości występowania dwóch markerów w monocytach ze śledziony lub krwi⁴. Jednak metody te są często śmiertelne lub kłopotliwe dla zwierząt, a bezpieczna i prosta metoda szybkiej i wiarygodnej weryfikacji modeli parabiotycznych jest wysoce pożądana. W tym celu opracowaliśmy nową metodę, która została zwalidowana w mysim modelu parabiozy. Stężenie glukozy w próbkach krwi pobranych z żyły ogonowej mierzy się za pomocą glukometru, a wzorzec zmian poziomu glukozy u myszy dawców i biorców jest uważany za wskaźnik chimeryzmu krążenia. Nazwaliśmy tę metodę "metodą fluktuacji glukozy". Zastosowanie tej metody walidacji nie ogranicza się do myszy, ale może zostać rozszerzone na różne modele patologiczne, z wyjątkiem tych, które mają poważne rozregulowanie metabolizmu glukozy. Procedura jest prosta, oszczędza czas i jest bezpieczna.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt i opieki nad nimi zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Harbinie.

UWAGA: Narzędzia i sprzęt wymagane do tej metody są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie materiałów i zwierząt

1. Zamów samce myszy C57BL/6 o wadze od 20 g do 25 g od standardowego dostawcy zwierząt laboratoryjnych.
2. Trzymaj myszy w cyklu 12 godzin światła: 12 godzin ciemności w temperaturze 24−26 °C z dostępem ad libitum do wody i pożywienia.

2. Parabioza

1. Znieczulenie myszy należy podać dootrzewnowo 2,2,2-tribromoetanol o stężeniu 0,1 ml/10 g. Potwierdzić prawidłowe znieczulenie zgodnie z objawami rozluźnienia mięśni, powolnego i stałego oddechu, utraty odruchu stymulacji skóry i zaniku odruchu rogówkowego.
2. Nałóż maść okulistyczną z patyczkiem higienicznym, aby zapobiec suchości oczu.
3. Wykonaj procedurę parabiozy zgodnie z wcześniejszym opisem⁵.
   1. Ułóż myszy w pozycji leżącej. Dokładnie ogol lewą stronę jednej myszy i prawą stronę drugiej myszy, zaczynając od około 1 cm powyżej łokcia do 1 cm poniżej kolana za pomocą golarki elektrycznej. Użyj kremu do depilacji, aby całkowicie usunąć sierść na ogolonej skórze.
   2. Przetrzyj ogolone obszary jodoforem. Umieść myszy na podgrzewanej podkładce pokrytej sterylną podkładką.
   3. Wykonaj podłużne nacięcia skóry, zaczynając od 0,5 cm powyżej łokcia do 0,5 cm poniżej stawu kolanowego, używając ostrych nożyczek po ogolonej stronie każdego zwierzęcia.
   4. Delikatnie odłącz skórę od powięzi podskórnej po nacięciu.
   5. Połącz łokć i kolano parabiontu za pomocą szwu 3-0.
   6. Zszyj ogoloną skórę ciągłym szwem 5-0.
4. Wstrzyknij 0,5 ml 0,9% NaCl podskórnie każdej myszy, aby zapobiec odwodnieniu.
5. Wstrzyknąć tramadol (10 mg/25 g/dobę) domięśniowo każdej myszy w celu złagodzenia bólu.

3. Walidacja chimeryzmu cyrkulacji

1. Metoda fluktuacji glukozy
   UWAGA: Zweryfikuj pomyślne zbudowanie chimeryzmu krążenia między parabiontami metodą fluktuacji glukozy (bez postu) w 10 dobie po operacji parabiozy.
   1. Znieczulić parabionty przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2,2,2-tribromoetanolu 20 g/l każdej myszy w stężeniu 0,1 ml/10 g.
   2. Zamocuj myszy dawcy w żylnym stabilizatorze ogona myszy wizualnej.
   3. Przetrzyj żyły ogonowe na boku jednego z ogonów parabionta wacikiem nasączonym 70−75% alkoholem, aby oczyścić ogon i rozszerzyć naczynia krwionośne.
   4. Trzymać w prawej ręce strzykawkę o pojemności 1,0 ml zawierającą glukozę i trzymać igłę równolegle do żyły (w odległości mniejszej niż 15°).
   5. Włóż igłę w miejscu około 2−4 cm od końcówki ogona.
   6. Wstrzyknąć dawcy 100 μl glukozy (1,2 g/kg) w ciągu 10 s.
      UWAGA: Termin dawca odnosi się do parabiontu, który otrzymuje zastrzyk glukozy przez żyłę ogonową. Biorcą jest drugi parabiont, który nie otrzymuje glukozy bezpośrednio.
   7. Oczyść palce u nóg jodoforem. Odetnij palce myszy dawcy i biorcy nożyczkami i zbierz kroplę krwi w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu glukozy (1 min, 5 minut, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min i 60 min). Usuń skrzep krwi w każdym punkcie czasowym pobrania, aby uniknąć większych uszkodzeń.
      UWAGA: Objętość pobranej krwi wynosiła 10-25 ul dla jednego testu, a łącznie 90-225 ul.
   8. Wlej krew do środka pasków testowych glukometru w celu wykrycia poziomu glukozy.
2. Użyj niebieskiego Counterstaina Evana jako kontroli pozytywnej³.
   1. Wstrzyknąć dootrzewnowo 200 μl 0,5% niebieskiego barwnika Evana Counterstain.
   2. 2 godziny później poddać parabionty eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 20 g/l 2,2,2-tribromoetanolu każdej myszy w stężeniu 0,2 ml/10 g i pobrać krew z obu parabiontów przez nakłucie serca.
   3. Odwirować próbki krwi o masie 916 x g przez 15 minut.
   4. Zbierz surowicę z supernatantu.
   5. Rozcieńczyć serum 0,9% NaCl w stosunku 1:50.
   6. Zmierzyć absorbancję rozcieńczonych próbek surowicy przy długości fali 620 nm za pomocą spektrofotometru.

Wyniki

U sześciu myszy dawców poziom glukozy we krwi gwałtownie wzrósł do 26,5 µmol/L (wzrost o 173%) średnio 1 min po wstrzyknięciu 100 µL glukozy (1,2 g/kg) do żyły ogonowej, a następnie stopniowo spadał do 13,3 µmol/L w 60 min. U myszy biorców poziom glukozy we krwi rósł powoli po wstrzyknięciu i osiągnął pierwszy poziom szczytowy w 15 min (wzrost o 47%, 12,2 µmol/L). Na podstawie powyższych wyników standard chimeryzmu krążenia ustalono następująco: 1) gwałtowny wzrost poziomu glukozy we krwi...

Dyskusja

Parabioza odnosi się do techniki chirurgicznej polegającej na połączeniu dwóch żywych zwierząt w celu ustanowienia wspólnego układu naczyniowego^za pomocą środków eksperymentalnych ^6,7,8. Zaletą tego modelu jest to, że substancje wytwarzane przez jednego osobnika mogą działać na oba zwierzęta w tym samym czasie. W ten sposób model parabiozy może być wykorzystany do zbadania roli substancji lub czynnika w powiązanej chorobie, prow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
zakrzywione kleszcze	Instrumenty chirurgiczne JZ, Chiny	J31340
	Instrumenty chirurgiczne JZ, Chiny	WA1030
	Instrumenty chirurgiczne JZ, Chiny	60017961
strzykawki 2,5 ml	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicylina	Solarbio, Chiny	IP0150
tramadol	Yijishiye, Chiny	YJT712520
glukometr	Roche Diabetes Care, Indiana	Paski testowe Accu-Chek Active Niebieski
Counterstain Evan's	Solarbio, Chiny	G1810
	Nair, USA	LL9161
Koc rozgrzewający ( Poduszka grzewcza)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Golarka elektryczna	Codos, Chiny	CP-5000
3-0,5-0 szew chirurgiczny	Fabryka igieł do szwów medycznych w Szanghaju, Chiny	SYZ 3-0 #, SYZ 5-0 #

Cienkie nożyczki Kleszcz igłowy Krem do depilacji