Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży

Summary

Tutaj prezentujemy przebieg procesu ekspresji, oczyszczania i wiązania liposomów heterodimerów SNX-BAR w drożdżach.

Abstract

Białka SNX-BAR to ewolucyjnie zachowana klasa białek przebudowujących błonę, które odgrywają kluczową rolę w sortowaniu i transporcie białek i lipidów podczas endocytozy, sortowania w systemie endosomalnym i autofagii. Kluczowe znaczenie dla funkcji białka SNX-BAR ma zdolność do tworzenia homodimerów lub heterodimerów, które wiążą błony przy użyciu wysoce konserwatywnych domen phox-homology (PX) i BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Ponadto oligomeryzacja dimerów SNX-BAR na błonach może wywoływać tworzenie kanalików błonowych i pęcherzyków, a aktywność ta odzwierciedla ich funkcje jako białek płaszcza dla nośników transportowych pochodzących z endosomów. Naukowcy od dawna wykorzystują badania wiązania in vitro z wykorzystaniem rekombinowanych białek SNX-BAR na syntetycznych liposomach lub gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV), aby ujawnić dokładny skład lipidów potrzebnych do napędzania przebudowy błony, ujawniając w ten sposób ich mechanizm działania. Jednak ze względu na wyzwania techniczne związane z systemami podwójnej ekspresji, toksycznością ekspresji białka SNX-BAR u bakterii oraz słabą rozpuszczalnością poszczególnych białek SNX-BAR, większość dotychczasowych badań dotyczyła homodimerów SNX-BAR, w tym niefizjologicznych dimerów, które tworzą się podczas ekspresji u bakterii. Niedawno zoptymalizowaliśmy protokół, aby przezwyciężyć główne niedociągnięcia typowego bakteryjnego systemu ekspresji. Korzystając z tego przepływu pracy, pokazujemy, jak skutecznie wyrażać i oczyszczać duże ilości heterodimerów SNX-BAR oraz jak je rekonstytuować na syntetycznych liposomach do testów wiązania i kanalików.

Introduction

Organelle związane z błoną, takie jak błona plazmatyczna, retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego, lizosom (wakuola drożdży) i endosom tworzą system endomembranowy komórki eukariotycznej. Większość organelli ma zdolność komunikowania się i wymiany materiału z innymi organellami za pośrednictwem nośników transportu pęcherzyków. Sposób, w jaki komórka koordynuje pakowanie i tworzenie nośników transportu pęcherzyków w systemie endomembranowym, nie jest dobrze poznany. Wiadomo jednak, że białka i lipidy, które stanowią większość systemu endobłonowego, pochodzą z internalizacji pęcherzyków endocytarnych z błony plazmatycznej (PM). Endosom jest głównym organellą akceptorową dla tych pęcherzyków i składa się z wielu połączonych ze sobą zestawów organelli rurkowych. Główną funkcją endosomu jest ułatwianie pozyskiwania składników odżywczych, regulowanie obrotu białek i lipidów, ochrona przed infekcją patogenami oraz służenie jako główne źródło uzupełniania lipidów dla błony plazmatycznej. Ponieważ endosom otrzymuje większość białek ładunkowych i lipidów z błony plazmatycznej, działa jak komora sortująca, izolując ładunki do rurowych endosomalnych nośników transportowych (ETC). Wszelkie białka, które nie zostały sekwestrowane w ETC, pozostawia się do degradacji przez system endo-lizosomalny. Rozregulowanie sortowania ładunków na ETC może prowadzić do utraty pobierania składników odżywczych, obrotu białkami lub homeostazy lipidów, co skutkuje licznymi zaburzeniami metabolicznymi, rozwojowymi i neurologicznymi^1,2. Jednak pomimo centralnej roli ETC w endosomie, nie jest znany podstawowy mechanizm, w jaki sposób endosom może selektywnie koordynować pakowanie wielu heterogenicznych ładunków do nośników rurkowych.

Rodzina sortowania nexin (SNX) to ewolucyjnie zachowana klasa białek, które okazały się kluczowe dla wielu reakcji transportu pęcherzyków w komórce^3,4,5. Neksyny sortujące są rekrutowane do błony endosomu i pomagają w wychwytywaniu ładunku poprzez ich charakterystyczną domenę homologii phox (PX), która wiąże fosfatydyloinozytolo-3-monofosforan (PtdIns(3)P), lipid wzbogacony w błonę endosomu. Ssaki kodują trzydzieści trzy białka SNX, które można dalej podzielić na wiele podrodzin, w zależności od obecności innych domen¹. Przede wszystkim podrodzina SNX-BAR jest największą podrodziną składającą się z dwunastu u ludzi, podczas gdy u pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae, podrodzina jest zredukowana do zaledwie siedmiu SNX-BAR. Białka SNX-BAR mają zarówno domenę PX, jak i domenę Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR), która pobudza rezerwuary lipidowe do wiązania błon o dodatniej krzywiźnie. W związku z tym rodzina SNX-BAR ma naturalne powinowactwo do endosomu i może pośredniczyć w tworzeniu ETC poprzez zdolność do przebudowy błony. In vitro właściwości remodelujące SNX-BAR można indukować przez dodanie oczyszczonych SNX-BAR do syntetycznych liposomów, a następnie tworzenie wąskich, powlekanych kanalików można uwidocznić za pomocą mikroskopii elektronowej. Korzystając z tych metod, naukowcy ustalili, że zarówno stężenie oligomeryzacji, jak i siła zwężenia wydają się różnić w rodzinie SNX-BAR, co sugeruje, że mogą one pomóc zarówno w tworzeniu, jak i rozszczepianiu ETC.

SNX-BARs można dalej klasyfikować według ich wyjątkowych właściwości dimeryzacji. Testy wiązania in vitro i badania strukturalne wykazały, że białka SNX-BAR mogą tworzyć tylko specyficzne homodimery lub heterodimery. W związku z tym, w zasadzie, każdy potencjalny dimer-oligomer SNX-BAR może zapewnić powłokę kanalikową dla specyficznego dla ładunku szlaku transportu i podobnie, ograniczona oligomeryzacja innych protomerów SNX-BAR może również definiować odrębne szlaki eksportowe. Jednak ze względu na dużą liczbę SNX-BAR i różnorodność w rodzinie SNX, hipoteza jednego sortowania ładunku typu nexin-one jest bardzo mało prawdopodobna. Zamiast tego bardziej prawdopodobny jest skoordynowany wysiłek z wykorzystaniem wielu czynników, takich jak SNX-BAR, ładunek, specyficzność lipidowa i inne zależności. Podobnie, ostatnie badania drożdży z rodziny SNX4 ujawniły dowody na dodatkową specyficzność lipidową, poza PtdIns(3)P, w celu wzmocnienia nośników transportu endosomów⁶. W tym badaniu homodimer SNX-BAR Mvp1-Mvp1 został oczyszczony z bakterii, a natywne heterodimery Snx4-Atg20 i Vps5-Vps17 poddano ekspresji i oczyszczeniu z wysoką wydajnością z drożdży, podczas gdy stwierdzono, że tylko Snx4-Atg20 preferencyjnie wiąże fosfatydyloserynę (PS) i tworzy wąskie struktury przypominające rurki w badaniach wiązania liposomów⁶. Podczas gdy inni w tej dziedzinie ujawnili ważne właściwości SNX-BAR przy użyciu rekombinowanych homodimerów SNX-BAR z bakterii, toksyczność związana z ekspresją heterodimerów SNX-BAR w podobnych systemach utrudniła ich natywną charakterystykę^7,8,9,10. Dlatego bez niezawodnego systemu do uzyskania czystych natywnych heterodimerów o ekspresji rekombinowanej, naukowcy muszą zrezygnować z tych kierunków badań. Na rysunku 1 przedstawiamy czteroczęściowy przepływ pracy, aby 1) skonstruować szczep drożdży z nadekspresją heterodimerów SNX-BAR do tandemowego oczyszczania powinowactwa, 2) wyrazić i oczyścić natywne heterodimery SNX-BAR, 3) przygotować jednowarstwowe syntetyczne liposomy i 4) skonfigurować test kanalików liposomowych lub sedymentacji, zapewniając naukowcom niezbędne narzędzie do zbadania rosnącego katalogu neksyn sortujących występujących w przyrodzie.

Protocol

1. Budowa szczepu drożdży

1. Zacznij od TVY614 (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)¹¹ jako szczepu macierzystego. Szczep ten ma niedobór proteaz wakuolarnych, które przyczyniają się do większości degradacji białek po lizie komórek, a tym samym pozwala na czystsze i bardziej wydajne oczyszczanie.
2. Zaprojektuj primers¹² i zintegruj znacznik tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) na C-końcu Atg20 (SNX-BAR ORF 1) za pomocą rekombinacji homologicznej. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby potwierdzić integracje (Rysunek 2).
3. Wykonaj western blot lizatu komórkowego względem znacznika TAP, aby potwierdzić poprawną integrację¹³.
   nuta: Zalecamy pobranie 3 komórek OD (1 OD ≈ 1 x 10⁷ komórek) do weryfikacji SDS-PAGE i western blot. Należy pamiętać, że integracja znacznika TAP powinna nastąpić przed zastąpieniem endogenicznych promotorów promotorem GAL1, aby umożliwić łatwiejszą weryfikację znacznika TAP za pomocą western blot.
4. Zastąp endogenne promotory Snx4 (SNX-BAR ORF1) i Atg20 (SNX-BAR ORF 2) nieoznakowanym promotorem GAL1, stosując sekwencyjną homologiczną rekombinację i etapy transformacji każdej indywidualnej klasy ORF¹⁴.
5. Użyj starterów flankujących poza miejscami integracji, aby PCR potwierdzić udane integracje (Rysunek 2). Spowoduje to zerowy fenotyp docelowych SNX-BAR przy braku galaktozy w pożywce wzrostowej.

2. Indukcja drożdży i oczyszczanie dimera SNX-BAR

UWAGA: Komórki drożdży mogą być rozmnażane na standardowych płytkach agarowych YPD (ekstrakt drożdżowy, pepton i 2% glukozy), ponieważ modyfikacje są zintegrowane chromosomalnie.

1. Zaszczepić duży wacik komórek w 50 ml standardowego podłoża YP (ekstrakt drożdżowy i pepton) z 2% rafinozą i 0,1% glukozą jako źródłem węgla w kolbie o objętości co najmniej 4 razy większej niż objętość kultury i hodować przez noc w wytrząsarce o temperaturze 30 °C, aby umożliwić prawidłowe napowietrzenie. Należy się spodziewać, że wzrost w tym medium będzie wolniejszy w porównaniu ze standardowym YPD.
2. Następnego ranka użyj 50 ml kultury wstępnej, aby zaszczepić w 1 l standardowej pożywki YP z 2% rafinozą i 0,1% glukozy i rosnąć przez 4-5 godzin w wytrząsarce o temperaturze 30 °C.
   nuta: Objętość kultury wstępnej użytej do zaszczepienia 1 litra kultury może być dostosowana w zależności od OD₆₀₀ w kulturze wstępnej. OD₆₀₀ w 1 l kultury po inokulacji powinien wynosić około 0,2, aby umożliwić co najmniej dwa podwojenia podczas 4-5 godzinnego wzrostu.
   1. Do wzrostu należy użyć kolby Fernbacha z przegrodą, aby umożliwić prawidłowe napowietrzenie, wystarczy kolba objętościowa o pojemności 2,8 l. Mniejsze napowietrzenie może skutkować wolniejszym wzrostem i mniejszymi granulkami komórkowymi podczas zbioru.
3. Sprawdź OD₆₀₀, aby upewnić się, że kultura jest w fazie logarytmu (0,5-1) po 4-5 godzinach wzrostu. W zależności od wzrostu odmiany, dostosuj czas wzrostu, aby umożliwić co najmniej dwa podwojenia. Dodać do 2% galaktozy i hodować przez noc w 30 °C shaker.
   nuta: OD₆₀₀ po nocnym wzroście może się różnić, ale kultura powinna być nasycona. Należy pamiętać, że komórki nie muszą być usuwane z 0,1% glukozy przed dodaniem 2% galaktozy dla tego protokołu wzrostu. Zalecamy pobranie 3 OD komórek nieindukowanych i indukowanych na tym etapie dla SDS-PAGE i western blot w celu weryfikacji (Rysunek 3A, B, Pas 1-2).
4. Zbierać komórki przez odwirowanie przy 4500 x g przez 15 minut. Można tu zastosować wahliwy wirnik kubełkowy, który mieści kulturę o objętości 1 l.
5. Przenieść osad drożdży do stożkowej probówki o pojemności 50 ml; w razie potrzeby można przeprowadzić drugi etap wirowania. Granulka komórkowa ma na ogół około 10-15 ml objętości, mierzoną za pomocą oznaczeń podziałki i może być natychmiast zużyta lub przechowywana w temperaturze -80 °C.
   1. Zawiesić osad w 15 ml buforze oczyszczającym (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM Ditiothreitol (DTT), koktajl inhibitorów proteazy), aby uzyskać końcową objętość około 30 ml.
6. Przed użyciem schłodzić homogenizator w temperaturze 4 °C i zrównoważyć go z buforem oczyszczającym. Lizuj komórki za pomocą mechanicznego zaburzacza komórek lub homogenizatora. Załaduj próbkę do homogenizatora i poddaj lizie w temperaturze 20 000-25 000 psi przez 2-3 rundy; Należy pamiętać, że gdy komórki ulegają lizie, wymagane jest większe ciśnienie wejściowe, aby utrzymać 20 000-25 000 psi. Zebrać lizat komórkowy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie.
   nuta: Jeżeli konieczne jest poddanie lizie dodatkowych próbek, homogenizator powinien zostać dokładnie oczyszczony i wyrównany przed załadowaniem następnej próbki. Trzymaj wszystkie lizaty komórkowe na lodzie.
7. Natychmiast usunąć lizat komórkowy w temperaturze 35 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki. Należy pamiętać, że lipidy z lizy komórek będą unosić się na wierzchu podczas wirowania i nie wpłyną na oczyszczanie.
   nuta: Zalecamy zaoszczędzenie 0,5-1% lizatu i granulatu dla próbek SDS-PAGE. Zazwyczaj nie obserwuje się większych różnic i można wykonać dodatkowy western blot w celu potwierdzenia rozpuszczalności białka TAP (Ryc. 4, odpowiednio pasy 1 i 2).
8. Zrównoważyć 300 μl kulek sefarozy IgG z buforem oczyszczającym. Dodać do oczyszczonego lizatu komórkowego i inkubować przez 2 godziny, obracając w temperaturze 4 °C.
9. Zebrać kulki w kolumnie chromatograficznej o pojemności 10 ml i pozwolić na przepływ niezwiązanego lizatu.
10. Przepłucz kulki za pomocą 10 ml buforu do płukania (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT), dodając po 1 ml na raz i pozwalając mu całkowicie przepłynąć.
    nuta: Zalecamy zachowanie 2% związanych kulek IgG dla próbki SDS-PAGE. Zazwyczaj obserwujemy cztery główne pasma; dwa białka SNX-BAR oraz ciężkie i lekkie łańcuchy IgG (Rysunek 4, Tor 3). Zalecamy zachowanie równoważnych ilości "eluatu" i "kulek IgG po TEV" w celu porównania skuteczności rozszczepienia TEV.
11. Zbierz koraliki i przenieś je do probówki mikrowirówkowej. Dodać do 500 μl całkowitej objętości ze świeżym buforem do przemywania i 2 μl proteazy TEV o stężeniu 10 mg/ml i inkubować przez noc, obracając w temperaturze 4 °C.
12. Następnego ranka całkowicie usunąć supernatant za pomocą igły 27 G i ocenić czystość białka za pomocą 10% poliakrylamidu SDS-PAGE (Rysunek 4, tor 4).
    nuta: Zazwyczaj uzyskujemy 500 μl 0,5-1 mg / ml 95% czystego heterodimeru (Rysunek 4, tor 4). Można również przeprowadzić dodatkowe oczyszczanie przy użyciu żywicy kalmodulinowej, jednak zazwyczaj obserwujemy znaczne zmniejszenie plonów i zalecamy zaprzestanie tego procesu, jeśli czystość wynosi >90%. TEV nie zakłóca testów wiązania liposomów, chociaż TEV można dodatkowo usunąć za pomocą kulek agarozowych Ni-NTA¹⁵.
13. Aby zagęścić, przenieść próbkę do filtra odśrodkowego o pojemności 0,5 ml z odcięciem 10 KDa i odwirować zgodnie z instrukcjami producenta do 50 μl lub mniej. Określ ilościowo skoncentrowane białka za pomocą testu białek Bradforda. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia.

3. Przygotowanie liposomów

1. Kup dostępne w handlu lipidy: fosfatydyloserynę (PS), PI3P, ergosterol i fosfatydylocholinę (PC). W razie potrzeby ponownie zawiesić w zalecanym rozpuszczalniku, aby uzyskać podstawowe lipidy.
   nuta: Lipidy są ponownie zawieszane w mieszaninie metanolu i chloroformu zgodnie z zaleceniami producenta. Przed użyciem upewnij się, że zapasy lipidów są czyste i ogrzane do temperatury pokojowej. Zawieszone lipidy mogą być przechowywane w argonie i zamykane za pomocą filmu woskowego (lub jego odpowiednika) w temperaturze -20 °C przez 6-12 miesięcy lub do momentu zaobserwowania utraty aktywności.
2. Obliczyć objętość wymaganą dla każdego zasobu lipidowego w celu wytworzenia mieszaniny o pożądanym składzie lipidowym (patrz Tabela 1). Załóżmy, że w mieszaninie lipidów znajduje się łącznie 1 mol lipidów.
3. Wykonaj ten krok w dygestorium chemicznym. Szklane strzykawki należy oczyścić, pobierając pełną objętość chloroformu i wyrzucając ją do pojemnika na odpady. Powtórz jeszcze dwa razy. Podczas przenoszenia chloroformu należy używać wyłącznie szklanych strzykawek lub pipet. Podczas pobierania chloroformu należy powoli pociągnąć za korek, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków gazu do strzykawki.
4. Za pomocą szklanych strzykawek przenieś lipidy podstawowe w przeliczeniu do czystej szklanej probówki hodowlanej, aby uzyskać końcową mieszaninę lipidów składającą się z 1% PI3P, 20% ergosterolu, 30% PS, PC (Tabela 1). W zależności od rozpuszczalników, w których każdy lipid jest ponownie zawieszony, mieszanina może stać się mętna po dodaniu każdego lipidu.
   nuta: Aby zmienić stężenia PS (0-30%), odpowiednio dostosuj głośność i skompensuj ją za pomocą zmiennego PC (Tabela 1).
5. Ostrożnie wysuszyć mieszaninę lipidów za pomocą azotu skierowanego na mieszaninę lipidów ruchami okrężnymi, aby równomiernie wysuszyć lipidy. Użyj niskiego przepływu gazu, aby utrzymać lipidy na dnie szklanej rurki podczas procesu suszenia. Owiń szklaną probówkę hodowlaną folią, pozostawiając otwór odkryty, a następnie odwadniaj w próżni przez 1 godzinę.
6. Dodać 400 μl buforu wiążącego (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl₂) w celu całkowitego odwodnienia lipidów, aby uzyskać końcowe stężenie liposomu 2,5 mM.
   nuta: Końcowe stężenie liposomów można regulować, dodając mniej lub więcej buforu wiążącego. Na przykład można dodać 200 μl buforu wiążącego, aby w razie potrzeby uzyskać stężenie liposomu 5 mM (patrz poniżej).
   1. Zawiesić lipidy, wstrząsając ze średnią prędkością wiru w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Bufor powinien wydawać się mętny podczas ponownego zawieszania lipidów.
7. Przenieś zawieszone liposomy do probówki mikrowirówkowej. Od tego momentu można używać plastikowych końcówek do pipet, ponieważ lipidy nie są już ponownie zawieszane w chloroformie. Należy pamiętać, że roztwór liposomu powinien wyglądać na mętny.
8. Zamroź i rozmroź liposomy od siedmiu do ośmiu razy, zanurzając probówkę mikrowirówki najpierw w ciekłym azocie, a następnie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszanina liposomów powinna wydawać się całkowicie zamrożona i stała na oko przed rozmrożeniem.
9. Wykonaj czynności z udziałem chloroformu w dygestoriach chemicznych. Oczyścić dwie szklane strzykawki o pojemności 1 ml, pobierając i wyrzucając pełne objętości chloroformu, trzy razy każda, w celu usunięcia wszelkich pozostałości lipidów. Zrównoważyć każdą szklaną strzykawkę z ultraczystą wodą, pobierając dwie objętości strzykawki, a następnie zrównoważyć z buforem wiążącym, pobierając dwie objętości strzykawki.
10. Zmontuj mini-ekstruder zgodnie z zaleceniami producenta. Zrównoważyć jedną membranę o długości fali 200 nm i dwa kawałki podpór filtra (patrz tabela materiałów), zanurzając każdą z nich w buforze wiążącym.
11. Umieść membranę między wspornikami filtra i umieść w mini-ekstruderze. Aby zmniejszyć martwą objętość w zmontowanym mini-ekstruderze i upewnić się, że zespół jest szczelny, należy przepuścić objętość buforu wiążącego porównywalną z objętością mieszaniny liposomów przez mini-ekstruder za pomocą szklanych strzykawek o pojemności 1 ml.
12. Użyj jednej ze szklanych strzykawek o pojemności 1 ml i wyciągnij mieszaninę liposomów. Odwrócić probówkę mikrowirówki, aby zebrać ostatnią mieszaninę liposomów w nasadce probówki w celu wciągnięcia do szklanej strzykawki.
13. Wytłaczaj liposomy, przechodząc przez membranę 200 nm 19-21 razy. Zbierz wytłaczane liposomy w nowej probówce do mikrowirówki.
    nuta: Wytłaczane liposomy powinny wydawać się mniej mętne niż liposomy przed wytłaczaniem. Liposomy należy stosować tego samego dnia i przechowywać na lodzie. Ostatnia ekstruzja powinna umieścić liposomy w strzykawce naprzeciwko tej, w której się zaczęła.

4. Wiązanie i kanaliki liposomowe SNX-BAR

1. Wstępnie oczyszczone białko w ilości 100 000 x g w ultrawirówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C przed przeprowadzeniem eksperymentów z wiązaniem liposomów i sedymentacją. Usunąć supernatant i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki; Nie naruszaj pelletu, jeśli taki jest.
2. Aby przeprowadzić testy wiązania liposomów i kanalików, inkubuj 4 μM oczyszczone liposomy Snx4-Atg20 i 2,5 mM w całkowitej objętości reakcji 20 μL, zmieniając objętość dodanych liposomów.
   nuta: W tym samym eksperymencie należy użyć tej samej objętości liposomów.
3. Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 30 min.
   nuta: Sugerujemy maksymalizację ilości 2,5 mM liposomów dodawanych do każdej reakcji przy użyciu nie mniej niż 10 μl liposomów, aby umożliwić wizualizację podczas sedymentacji. Jeśli w reakcji 20 μl liposomów 2,5 mM zostanie użyte, końcowe stężenie liposomów wyniesie 1,25 mM. Jeżeli oczyszczone białka są rozcieńczone i wymagana jest większa objętość dla białka 4 μM, lipidy mogą być ponownie zawieszone w 200 μl podczas etapu hydratacji w celu podwojenia stężenia liposomów (patrz krok 3.6); Będzie to jednak wymagało znajomości stężenia białka przed wytworzeniem liposomów.
4. Wizualizacja i kwantyfikacja kanalików liposomowych.
   1. Natychmiast przeprowadź reakcje wiązania liposomów do analizy pod mikroskopem elektronowym. Umieść próbki na siatce miedzianej pokrytej węglem i zabarwiej ujemnie za pomocą 1% octanu uranylu (Rysunek 5B)¹⁶.
   2. Analizuj próbki pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (200 kV).
   3. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć i określić ilościowo średnicę kanalików. Aby dokładnie określić ilościowo średnicę kanalika pojedynczego kanalika, wykonaj trzy pomiary średnicy wzdłuż długości kanalika i uśrednij (Rysunek 5B).
      nuta: Do określenia istotności statystycznej zastosowano dwukierunkową analizę wariancji (Rysunek 5E). Octan uranylu jest zarówno radioaktywny, jak i toksyczny. Do wykonania tego kroku wymagany jest odpowiedni certyfikat bezpieczeństwa w laboratorium.
5. Wiązanie liposomów i sedymentacja.
   1. Przenieść reakcję (20 μl, z kroku 4.3) do probówki wirówkowej z poliwęglanu i za pomocą kompatybilnego wirnika wirować z prędkością 100 000 x g w ultrawirówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Należy pamiętać, że pellet powinien pozostać nienaruszony.
   2. Zawiesić osad w SDS-PAGE 40 μL buforu próbki i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Dodać 20 μl buforu próbki do supernatantu. Załaduj równoważne ilości osadu i supernatantu w 10% poliakrylamidowym żelu SDS-PAGE i wykonaj barwienie Coomassie, aby uwidocznić SNX-BAR związane z liposomami (Rysunek 5A).
   3. Aby określić ilościowo ilość kompleksu SNX-BAR we frakcji osadu, należy określić ilościowo intensywność pasma za pomocą densytometrii i określić ilościowo proporcję białek SNX-BAR we frakcji osadu.
      nuta: Dwukierunkowa analiza wariancji została wykorzystana do określenia istotności statystycznej (Rysunek 5C).

Results

Ten protokół opisuje metodę powtarzalnej i solidnej produkcji endogennych kompleksów SNX-BAR drożdży, które mogą być używane do dalszych testów przebudowy błony (Rysunek 1). Konstrukcja szczepu drożdży użytego do oczyszczania wykorzystuje skuteczność rekombinacji homologicznej w pączkujących drożdżach, umożliwiając modyfikacje w loci genomowych docelowych SNX-BAR (Rysunek 2). Taki projekt ma dwie zalety: (i) ponieważ selekcja nie jest wymagana do ut...

Discussion

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany przepływ pracy do oczyszczania dimerów SNX-BAR w drożdżach oraz dwa testy do oceny ich właściwości biofizycznych na syntetycznych liposomach. Główną zaletą w porównaniu z typową ekspresją białek rekombinowanych w Escherichia coli lub innych systemach jest zdolność do równomiernej ekspresji białek SNX-BAR w natywnym gospodarzu, co pozwala uniknąć problemów z toksycznością i nierozpuszczalnością, które występują przy oczyszczaniu SNX-BAR w innych systemach. Warto również zauważy...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 μ m PC	Membrany Avanti	610006
10 mL Poly-Prep Kolumna chromatograficzna (Bio-Rad)	Bio-Rad	731-1550
27 G igła	BD Biosciences	301629
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra z odcięciem 10K	Amicon	UFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizator	Avestin	EF-C3
BCA	Pierce	23225
Beckman Optima MAX-XP Ultrawirówka	Beckman Coulter	393315
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy	Roche	4693116001
DOPC	Avanti	850375
DOPS	Avanti	840035
Ergosterol (Sigma)	Zestaw wytłaczarek Sigma	47130-U
z Blok 0,2 μ L/1 mL	Avanti	610000
FEI Transmisyjny mikroskop elektronowy Tecnai F20 (200 kV)
Szklane probówki hodowlane	VWR	47729-570
Kulki sefarozy IgG (GE Healthcare)	GE Healthcare	17-0969-01
Szklane strzykawki mikrolterowe	Hamilton	7637-01
New Brunswick Excella E25	Eppendorf	M1353-0000	lub równoważne wytrząsanie 30 & deg; C
Ni-NTA Magnetyczne kulki agarozowe	Pierce	78605
Optima XE-90 Ultrawirówka	Beckman Coulter	A94516
Parafilm M	VWR	52858-076
PI3P	Echelon	P-3016	lub odpowiednik Echelon
Zespół butelki z poliwęglanu	Beckman Coulter	355622
TLA-100 o stałym kącie Rotor	Beckman Coulter	343840
Typ 45 Ti Rotor	Beckman Coulter
Odsysacz próżniowy, dolny i pokrywa z zaworem gniazdowym	VWR	75871-436
Pompa próżniowa Alcatel (Pascal 2005 C1)	A& J Odkurzacz	PN07050
Vortex z uchwytem na piankę	VWR	10153-838
ZESTAW VWR MIKRORURKA	VWR	12620-880