Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy przebieg procesu ekspresji, oczyszczania i wiązania liposomów heterodimerów SNX-BAR w drożdżach.

Streszczenie

Białka SNX-BAR to ewolucyjnie zachowana klasa białek przebudowujących błonę, które odgrywają kluczową rolę w sortowaniu i transporcie białek i lipidów podczas endocytozy, sortowania w systemie endosomalnym i autofagii. Kluczowe znaczenie dla funkcji białka SNX-BAR ma zdolność do tworzenia homodimerów lub heterodimerów, które wiążą błony przy użyciu wysoce konserwatywnych domen phox-homology (PX) i BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Ponadto oligomeryzacja dimerów SNX-BAR na błonach może wywoływać tworzenie kanalików błonowych i pęcherzyków, a aktywność ta odzwierciedla ich funkcje jako białek płaszcza dla nośników transportowych pochodzących z endosomów. Naukowcy od dawna wykorzystują badania wiązania in vitro z wykorzystaniem rekombinowanych białek SNX-BAR na syntetycznych liposomach lub gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV), aby ujawnić dokładny skład lipidów potrzebnych do napędzania przebudowy błony, ujawniając w ten sposób ich mechanizm działania. Jednak ze względu na wyzwania techniczne związane z systemami podwójnej ekspresji, toksycznością ekspresji białka SNX-BAR u bakterii oraz słabą rozpuszczalnością poszczególnych białek SNX-BAR, większość dotychczasowych badań dotyczyła homodimerów SNX-BAR, w tym niefizjologicznych dimerów, które tworzą się podczas ekspresji u bakterii. Niedawno zoptymalizowaliśmy protokół, aby przezwyciężyć główne niedociągnięcia typowego bakteryjnego systemu ekspresji. Korzystając z tego przepływu pracy, pokazujemy, jak skutecznie wyrażać i oczyszczać duże ilości heterodimerów SNX-BAR oraz jak je rekonstytuować na syntetycznych liposomach do testów wiązania i kanalików.

Wprowadzenie

Organelle związane z błoną, takie jak błona plazmatyczna, retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego, lizosom (wakuola drożdży) i endosom tworzą system endomembranowy komórki eukariotycznej. Większość organelli ma zdolność komunikowania się i wymiany materiału z innymi organellami za pośrednictwem nośników transportu pęcherzyków. Sposób, w jaki komórka koordynuje pakowanie i tworzenie nośników transportu pęcherzyków w systemie endomembranowym, nie jest dobrze poznany. Wiadomo jednak, że białka i lipidy, które stanowią większość systemu endobłonowego, pochodzą z internalizacji pęcherzyków endocytarnych z błony plazmatycznej (PM). Endosom jest głównym organellą akcepto....

Protokół

1. Budowa szczepu drożdży

1. Zacznij od TVY614 (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)¹¹ jako szczepu macierzystego. Szczep ten ma niedobór proteaz wakuolarnych, które przyczyniają się do większości degradacji białek po lizie komórek, a tym samym pozwala na czystsze i bardziej wydajne oczyszczanie.
2. Zaprojektuj primers¹² i zintegruj znacznik tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) na C-końcu Atg20 (SNX-BAR ORF 1) za pomocą rekombinacji homologicznej. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby potwierdzić integracje (Rysunek 2).
3. W....

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje metodę powtarzalnej i stabilnej produkcji endogennych kompleksów SNX-BAR drożdży, które mogą być wykorzystane w dalszych analizach przebudowy błon (Rycina 1). Konstrukcja szczepu drożdży wykorzystanego do oczyszczania opiera się na efektywności rekombinacji homologicznej u drożdży pączkujących, co pozwala na modyfikacje w locusach genomowych docelowych białek SNX-BAR (Rycina 2). Takie podejście ma dwie .......

Dyskusja

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany przepływ pracy do oczyszczania dimerów SNX-BAR w drożdżach oraz dwa testy do oceny ich właściwości biofizycznych na syntetycznych liposomach. Główną zaletą w porównaniu z typową ekspresją białek rekombinowanych w Escherichia coli lub innych systemach jest zdolność do równomiernej ekspresji białek SNX-BAR w natywnym gospodarzu, co pozwala uniknąć problemów z toksycznością i nierozpuszczalnością, które występują przy oczyszczaniu SNX-BAR w innych systemach. Warto również zauważy.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2 μ m PC	Membrany Avanti	610006
10 mL Poly-Prep Kolumna chromatograficzna (Bio-Rad)	Bio-Rad	731-1550
27 G igła	BD Biosciences	301629
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra z odcięciem 10K	Amicon	UFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizator	Avestin	EF-C3
BCA	Pierce	23225
Beckman Optima MAX-XP Ultrawirówka	Beckman Coulter	393315
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy	Roche	4693116001
DOPC	Avanti	850375
DOPS	Avanti	840035
Ergosterol (Sigma)	Zestaw wytłaczarek Sigma	47130-U
z Blok 0,2 μ L/1 mL	Avanti	610000
FEI Transmisyjny mikroskop elektronowy Tecnai F20 (200 kV)
Szklane probówki hodowlane	VWR	47729-570
Kulki sefarozy IgG (GE Healthcare)	GE Healthcare	17-0969-01
Szklane strzykawki mikrolterowe	Hamilton	7637-01
New Brunswick Excella E25	Eppendorf	M1353-0000	lub równoważne wytrząsanie 30 & deg; C
Ni-NTA Magnetyczne kulki agarozowe	Pierce	78605
Optima XE-90 Ultrawirówka	Beckman Coulter	A94516
Parafilm M	VWR	52858-076
PI3P	Echelon	P-3016	lub odpowiednik Echelon
Zespół butelki z poliwęglanu	Beckman Coulter	355622
TLA-100 o stałym kącie Rotor	Beckman Coulter	343840
Typ 45 Ti Rotor	Beckman Coulter
Odsysacz próżniowy, dolny i pokrywa z zaworem gniazdowym	VWR	75871-436
Pompa próżniowa Alcatel (Pascal 2005 C1)	A& J Odkurzacz	PN07050
Vortex z uchwytem na piankę	VWR	10153-838
ZESTAW VWR MIKRORURKA	VWR	12620-880