Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Podsumowanie

Ta metoda opisuje użycie modelu myszy R26R-Confetti (Confetti) do badania zmineralizowanych tkanek, obejmując wszystkie etapy od strategii hodowlanej do pozyskiwania obrazów. Dołączony jest ogólny protokół, który można zastosować do wszystkich tkanek miękkich oraz zmodyfikowany protokół, który można zastosować do tkanek zmineralizowanych.

Streszczenie

Oznaczanie pojedynczej komórki w ciele w celu monitorowania, jakie typy komórek może ona spowodować i śledzenia jej migracji przez organizm lub określania jej długowieczności, może być skutecznym sposobem na ujawnienie mechanizmów rozwoju i utrzymania tkanek. Jednym z najważniejszych dostępnych obecnie narzędzi do monitorowania komórek in vivo jest model myszy Confetti. Model Confetti może być wykorzystany do genetycznego znakowania pojedynczych komórek u żywych myszy różnymi białkami fluorescencyjnymi w sposób specyficzny dla typu komórki i monitorowania ich losu, a także losu ich potomstwa w czasie, w procesie zwanym klonalnym śledzeniem genetycznym lub śledzeniem linii klonalnej. Model ten został opracowany prawie dekadę temu i przyczynił się do lepszego zrozumienia wielu procesów biologicznych, w szczególności związanych z biologią komórek macierzystych, rozwojem i odnawianiem dorosłych tkanek. Jednak zachowanie sygnału fluorescencyjnego do czasu zebrania obrazu i jednoczesnego uchwycenia różnych sygnałów fluorescencyjnych jest technicznie trudne, szczególnie w przypadku tkanki zmineralizowanej. W tej publikacji opisano krok po kroku protokół użycia modelu Confetti do analizy chrząstki płytki wzrostu, którą można zastosować do dowolnej zmineralizowanej lub niezmineralizowanej tkanki.

Wprowadzenie

Ulepszone metody monitorowania zachowania komórek są pożądane w celu zwiększenia wydajności eksperymentu przy użyciu modeli zwierzęcych. Jednym z najbardziej pouczających podejść do monitorowania zachowania komórek in vivo jest śledzenie linii klonalnej za pomocą wielokolorowych szczepów myszy reporterowych¹, w tym szeroko stosowanego R26R-Confetti (Confetti) mouse². Poprzez genetyczne znakowanie pojedynczych komórek białkami fluorescencyjnymi i śledzenie tych komórek w czasie, naukowcy z wielu dziedzin wykorzystali mysz Confetti do ujawnienia wglądu w wiele różnych systemów biologicznych.

Mysz Confetti to system reporterowy oparty na loxP, w którym rekombinacja DNA zależna od Cre powoduje trwałą ekspresję jednego z kilku możliwych białek fluorescencyjnych w sposób stochastyczny². Allel R26R-Confetti zawiera wszechobecnie wyrażany promotor CAGG, który znajduje się bezpośrednio przed Neo R-cassette², którego sekwencja poliadenylacji kończy transkrypcję³, po którym następuje Brainbow 2.1 construct⁴. W związku z tym rekombinacja za pośrednictwem Cre jednocześnie wycina kasetę^{Neo R} i prowadzi do produkcji pewnych białek fluorescencyjnych w zależności od tego, które części konstruktu Brainbow 2.1 zostaną wycięte. Ta cecha sprawia, że mysz Confetti jest niezwykle elastyczna, ponieważ może być używana do celowania w dowolną populację komórkową myszy, dla której dostępny jest określony szczep Cre. Skrzyżowanie specyficznego tkankowo szczepu Cre ze szczepem R26R-Confetti zapewnia specyfikę etykietowania. Jednak szczep Cre powinien być również indukowalny (np. CreERT lub CreERT2, które wymagają wiązania tamoksyfenu, aby umożliwić im wejście do jądra i wywołanie rekombinacji DNA⁵), tak aby znakowanie można było osiągnąć w określonych punktach czasowych. W ten sposób populacja komórkowa może być znakowana poprzez wstrzyknięcie powstałego potomstwa CreERT-dodatniego / dodatniego konfetti z tamoksyfenem w pożądanym punkcie czasowym i śledzone do pewnego wieku, kiedy można pobrać interesujące tkanki do analizy. Po przetworzeniu tkanki, komórki znakowane fluorescencyjnie mogą być bezpośrednio wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, dzięki czemu potomstwo każdej początkowo znakowanej komórki można oddzielić od potomstwa wygenerowanego przez dowolną inną znakowaną komórkę na podstawie ich specyficznych znaczników fluorescencyjnych, umożliwiając w ten sposób ocenę klonalności (tj. klonalne śledzenie genetyczne

).

Ze względu na elastyczność modelu Confetti, został on zastosowany do badania rozwoju i utrzymania wielu różnych tkanek w zdrowiu i chorobie^2,6^,7,8,9,10,11. Jednym z powszechnych sposobów wykorzystania modelu jest oznaczenie określonej populacji komórek i określenie, do których tkanek one (i/lub ich potomstwo) się przyczyniły. Jednym z takich odkryć przy użyciu tego podejścia było to, że ząb dorosły składa się z komórek o pochodzeniu glejowym⁶. Innym zastosowaniem modelu jest badanie homeostazy komórek macierzystych. Na przykład, model Confetti ujawnił, że nisze komórek macierzystych w kryptach jelitowych stopniowo stają się monoklonalne, ponieważ niektóre klony komórek macierzystych dominują podczas konkurencji między komórkami macierzystymi². Model może być również wykorzystany do oceny proliferacji komórek, co jest szczególnie przydatne do badania wolno dzielących się komórek. Na przykład oceniono tworzenie klonów w chrząstce stawowej¹² i zbadano krótkoterminowy wpływ antagonisty jeża na chondrocyty płytki wzrostu u pięciotygodniowych myszy¹³.

Pomimo względnej prostoty modelu Confetti, sygnał fluorescencyjny może być technicznie trudny do zachowania do momentu zebrania obrazu, szczególnie podczas analizy zmineralizowanych tkanek. W tym przypadku protokół opisuje zoptymalizowany model do wykorzystania myszy Confetti z kością postnatalną (do 6 miesiąca życia), umożliwiając bezpośrednią wizualizację białek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii konfokalnej bez konieczności immunodetekcji. Ten uproszczony protokół można zastosować do tkanek niezmineralizowanych. Ponadto dołączono opis sposobu przechowywania próbek w celu zachowania sygnału fluorescencyjnego przez dłuższy okres co najmniej 3 lat. Zarys protokołu znajduje się w Rysunek 1.

Protokół

Wszystkie prace na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Doświadczeń na Zwierzętach (Komitet Północny w Sztokholmie/Norra Djurförsöksetiska Nämd) i przeprowadzone zgodnie z Przepisami i Wytycznymi Szwedzkiej Agencji ds. Zwierząt dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.

1. Hodowla myszy

1. Aby wygenerować napięcie, skrzyżuj mysz R26R-Confetti z interesującą ją linią Cre. Młode odsadzone od piersi w wieku 21 dni.
   UWAGA: Myszy mogą być wykorzystywane do hodowli od około 8 tygodnia życia lub zgodnie z lokalnymi wytycznymi. Genotypowanie (nieopisane tutaj) można przeprowadzić na podstawie biopsji pobranych przy odsadzeniu. Wiek w momencie odsadzenia można dostosować zgodnie z lokalnymi wytycznymi.

2. Etykietowanie konfetti

UWAGA: Ta strategia etykietowania jest odpowiednia dla szczepów Cre indukowanych tamoksyfenem.

1. Przygotować roztwór do 2,5 mg/ml tamoksyfenu w oleju kukurydzianym w szklanej butelce. Rozpuścić przez podgrzanie do temperatury 37 °C w piecu przez maksymalnie 60 minut, mieszając co 5 minut za pomocą wiru, aż proszek się rozpuści.
   UWAGA: W przypadku zwiększonych dawek tamoksyfenu można przygotować roztwory do 20 mg/ml przy użyciu tej metody.
2. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy, chronić przed światłem.
3. Wywołać rekombinację, podając 50 μl 2,5 mg/ml tamoksyfenu rozpuszczonego w oleju kukurydzianym dootrzewnowo w pierwszej dobie po urodzeniu (P1).
   UWAGA: W zasadzie tamoksyfen może być podawany w każdym wieku, już w pokoleniu F1. Dawka tamoksyfenu powinna być zróżnicowana w zależności od ekspresji Cre, wieku myszy i zastosowania eksperymentalnego. Więcej informacji można znaleźć w sekcji dyskusji. Myszy Cre ujemne traktowane w ten sam sposób mogą być używane jako kontrola negatywna dla sygnałów fluorescencyjnych konfetti.
   UWAGA: Upewnij się, że osoby zajmujące się zwierzętami są ostrzegane o stosowaniu tamoksyfenu i upewnij się, że materiały klatki są utylizowane zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska i bezpieczeństwa.

3. Pobieranie tkanek

1. Poddaj myszy eutanazji w 27 dniu po urodzeniu (P27), stopniowo wypełniając przestrzeń zawierającą myszy dwutlenkiem węgla do co najmniej 80% objętości i utrzymując to stężenie przez 3 minuty. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Trzymaj myszy na lodzie podczas sekcji innych zwierząt.
2. Wypreparuj tkankę, która Cię interesuje. Poniżej przedstawiono protokół pobierania bliższych płytek wzrostu kości piszczelowej i dystalnej kości udowej oraz chrząstki stawowej kolana, odpowiedni dla myszy po urodzeniu w wieku do 6 miesięcy.
   1. Usuń skórę wokół kończyn tylnych aż do stopy, używając ostrych nożyczek i kleszczy zębatych.
   2. Z grubsza przyciąć tkankę mięśniową i tłuszczową z nóg ostrymi nożyczkami.
      UWAGA: Nie czyść idealnie kości, ponieważ otaczające tkanki zapewniają pewne wsparcie strukturalne podczas cięcia, ale upewnij się, że cała skóra została usunięta.
   3. Za pomocą skalpela przeciąć tkankę miękką w miejscu, w którym górna część nogi styka się z ciałem, aż widoczna będzie głowa kości udowej, a następnie przeciąć więzadła w stawie biodrowym, aby usunąć nogę.
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli nie można znaleźć głowy kości udowej, przeciąć kość udową blisko biodra mocnymi nożycami.
   4. Odetnij stopę od reszty nogi za pomocą skalpela lub ostrych nożyczek.

4. Utrwalanie i przetwarzanie tkanek

UWAGA: W zależności od interesującej tkanki, postępuj zgodnie z jednym z dwóch protokołów opisanych poniżej (4.1 dla tkanek miękkich lub 4.2 dla zmineralizowanych tkanek myszy w wieku powyżej około 45 dni, jak opisano poniżej). W przypadku obu metod należy przechowywać wypreparowane próbki w 3,7% roztworze soli fizjologicznej buforowanej formaldehydem/fosforanem (PBS) na lodzie, podczas gdy pozostałe zwierzęta są poddawane sekcji.

1. W przypadku tkanek miękkich oraz zmineralizowanych kości piszczelowych i udowych do wieku około P45 należy utrwalić tkankę we wstępnie schłodzonym 3,7% formaldehydzie/PBS przez 6 godzin, delikatnie tocząc na rotatorze w temperaturze 4 °C. Użyj objętości co najmniej 10 razy większej niż objętość tkanki. Przejdź bezpośrednio do kroku 4.3.
2. W przypadku tkanek zmineralizowanych, w tym kości piszczelowych i udowych w wieku powyżej około P45, wymagany jest etap odwapnienia.
   1. Przygotować 1 l 10% roztworu EDTA/_dH2O o pH dostosowanym do 8,05 przy użyciu wodorotlenku sodu. Następnie rozcieńczyć formaldehyd do 3,7% za pomocą tego roztworu. Stężenie robocze EDTA wyniesie 9%.
   2. Utrwalić tkankę, umieszczając ją na noc we wstępnie schłodzonym 3,7% formaldehydzie/PBS, delikatnie tocząc na rotatorze w temperaturze 4 °C.
   3. Umieścić tkankę we wstępnie schłodzonym roztworze 3,7% formaldehydu/9% EDTA/_dH2O (pH 8,05) i delikatnie obrócić w temperaturze 4 °C w objętości co najmniej 10 razy większej niż objętość tkanki. Powtórz ten krok, umieszczając kości w świeżym, wstępnie schłodzonym 3,7% formaldehydzie/9% EDTA/_dH2O przez 3x przez następne 48 godzin
      UWAGA: To krótkie odwapnienie wystarczy, aby umożliwić przecięcie kości udowej i piszczelowej myszy w wieku do 6 miesięcy. W przypadku tkanek gęściej zmineralizowanych może być konieczne dalsze odwapnienie w celu poprawy histologii.
3. Przenieść tkankę do wstępnie schłodzonej 30% sacharozy/_dH2O. Upewnij się, że pojemnik jest wypełniony po brzegi i delikatnie obracaj przez noc w temperaturze 4 °C. Użyj objętości co najmniej 10 razy większej niż objętość tkanki. Tkanka często unosi się na wodzie, gdy po raz pierwszy zostanie umieszczona w tym roztworze i opadnie na dno butelki do rana.
4. Aby usunąć pozostały roztwór sacharozy, należy krótko przemyć tkankę, wyjmując ją z roztworu sacharozy za pomocą kleszczyków i całkowicie pokrywając próbkę około 5 ml związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na kilka sekund.
5. Napełnij wstępnie oznakowany kriomold OCT i umieść tkankę na dnie. Pracuj szybko, aby próbki nie pozostawały zbyt długo w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Ważne jest, aby umieścić próbkę w dogodnej orientacji na etapie cięcia. Aby zwiększyć szanse na przecięcie przez całe kolumny płytki wzrostu po śledzeniu za pomocą Col2CreERT:Confetti, umieść przyśrodkową stronę skierowaną w dół, używając głowy kości udowej jako prowadnicy i umieść próbkę jak najbardziej płasko do dna formy.
6. Osadź próbkę, umieszczając formę na suchym lodzie i czekając, aż OCT całkowicie zastygnie. Umieść krioformy tak płasko, jak to możliwe, aby uniknąć ruchu/przesuwania się tkanki w formie. Po zakończeniu przechowywać próbki w temperaturze -20 °C, jeśli nie są natychmiast używane.
   UWAGA: Zużyć w ciągu 12 tygodni, ponieważ z wiekiem klocki stają się trudniejsze do krojenia.

5. Podział na sekcje

UWAGA: Wykonaj kriosekcję za pomocą kriostatu z jednorazowymi ostrzami odpowiednimi do twardych tkanek. Odpowiedni jest każdy standardowy kriostat.

1. Wyjmij blok z formy i przymocuj go do uchwytu, nakładając OCT między górną część bloku a uchwyt i schładzając w kriostacie w temperaturze -20 °C przez co najmniej 5 minut, tak aby OCT całkowicie zastygł.
2. Schłodzić wstępnie zarówno uchwyt próbki, jak i uchwyt ostrza do temperatury -20 °C, a następnie umieścić próbkę/uchwyt w uchwycie uchwytu, a ostrze w uchwycie ostrza, aby zrównoważyć przez kilka minut.
   UWAGA: Podane temperatury mogą różnić się o kilka stopni w zależności od kriostatu i tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
3. Użyj kriostatu, aby przyciąć blok i wyciąć skrawki tkanki o odpowiedniej grubości, aby umożliwić wizualizację klonów w tkance będącej przedmiotem zainteresowania.
   1. Do analizy płytki wzrostu pourodzeniowego przygotuj skrawki o wielkości 30−160 μm i zbierz je na szkiełkach. Niektóre modele kriostatu mogą zezwalać na zbieranie grubych sekcji tylko przy użyciu ustawienia trymowania.
4. Suszyć szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż całkowicie wyschną.
   UWAGA: Czas trwania tego etapu może się różnić w zależności od właściwości tkanki i grubości przekroju. Temperatura w pomieszczeniu również może mieć wpływ na szybkość tego kroku.
5. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 36 miesięcy lub, w przypadku natychmiastowego przetwarzania, przejść do kroku 6.2.

6. Przygotowanie i montaż prowadnicy

1. Wyjmij szkiełko z zamrażarki i podnieś poziomo do temperatury pokojowej w uchwycie na szkiełka. Poczekaj, aż kondensacja odparuje.
2. Usuń OCT za pomocą pipety Pasteura, aby delikatnie nałożyć PBS w temperaturze pokojowej na szkiełko. Im grubszy przekrój, tym dłuższy czas jest wymagany. W przypadku odcinków o grubości 160 μm należy wykonać dwa płukania: inkubować raz przez 15 minut i usunąć płyn, a następnie nałożyć świeży PBS na 5 minut i usunąć płyn.
   UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie OCT i może być zmieniany w zależności od właściwości tkanki i grubości przekroju, w zależności od potrzeb. Temperatura w pomieszczeniu prawdopodobnie wpłynie na szybkość tego kroku.
3. Szkiełka należy zamontować w roztworze 75% 2,2-tiodieetanolu/_dH2Ow temperaturze pokojowej z szkiełkami nakrywkowymi o długości 60 mm.
   UWAGA: Preparaty można przygotować bezpośrednio przed obrazowaniem, ale sygnał fluorescencyjny jest stabilny przez 1-2 tygodnie, jeśli jest trzymany z dala od światła w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C.

7. Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Ustaw mikroskop.
   1. Włącz mikroskop i otwórz oprogramowanie. Kliknij przycisk Uruchom system.
   2. Wybierz kanały, klikając najpierw Smart Setup na karcie Akwizycja, a następnie wybierając trzy kanały odpowiadające czerwonemu białku fluorescencyjnemu (RFP), żółtemu białku fluorescencyjnemu (YFP) i białku cyjanu fluorescencyjnemu (CFP) pod nagłówkiem Barwnik. Kliknij Najlepszy sygnał, a następnie Zastosuj, aby wybrać lasery.
      UWAGA: Zawartość zakładki Akwizycja jest pokazana w Pliku uzupełniającym 1A. Jeśli wymagane kanały nie są obecne, dodaj je za pomocą przycisku "+" pod nagłówkiem Barwnik. Niezbędne informacje dotyczące lasera, długości fal wzbudzenia i zakresu rejestrowanych długości fal emisji są pokazane dla trzech białek fluorescencyjnych Confetti w pliku uzupełniającym 1B-D.
   3. Wybierz soczewkę obiektywu 20x pod nagłówkiem Obiektyw na karcie Tryb akwizycji.
2. Zlokalizuj płytkę wzrostową lub inną tkankę będącą przedmiotem zainteresowania.
   1. Aby zapewnić odrębny widok, najpierw wybierz kanał zapytania ofertowego, klikając jego nazwę na karcie Kanały. Powoduje to, że szczegóły kanału zapytania ofertowego są wyświetlane w zakładce Ścieżka światła. Kliknij pole wyboru obok T-PMT.
      Uwaga: Kanał T-PMT pokazuje nieodbite światło laserowe, które służy do wizualizacji niefluorescencyjnych części tkanki.
   2. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka i umieść płytkę wzrostową lub inną tkankę zainteresowania bezpośrednio między ścieżką światła a soczewką obiektywu.
   3. Aby uprościć lokalizację tkanki, usuń zaznaczenie kanałów YFP i CFP, zaznaczając pola wyboru pod nagłówkiem Ścieżki na karcie Kanały.
   4. Wybierz kanał T-PMT, klikając jego nazwę w nagłówku Ścieżki. Kliknij opcję Live (Na żywo) w zakładce Acquisition (Akwizycja) i zwiększ Gain (Master) dla kanału T-PMT, aby zobrazować sekcję tkanki na ekranie, która jest pokazana w skali szarości.
   5. Przesuń pozycję szkiełka za pomocą joysticka, aby zlokalizować obszar zainteresowania, a następnie ustaw ostrość za pomocą odpowiedniego pokrętła mikroskopu.
   6. Kliknij przycisk Stop (Zatrzymaj) na karcie Acquisition (Akwizycja), aby wyłączyć ekspozycję lasera.
3. Zdefiniuj parametry obrazowania.
   1. Użyj pól wyboru na karcie Kanały, aby wybrać jeden z kanałów, a następnie kliknij opcję Na żywo na karcie Pozyskiwanie, aby wyświetlić obraz tego kanału na ekranie. Następnie, za pomocą lewego przycisku myszy myszy, wyreguluj suwaki, aby ustawić zakres emitowanego sygnału fluorescencyjnego, który jest zbierany, moc lasera (suwak pod nagłówkiem Lasery), wzmocnienie (Master) i przesunięcie cyfrowe w zakładce Kanały, aby wyświetlić komórki oznaczone konfetti na ekranie. Wartości wytyczne dla wszystkich tych parametrów są podane w pliku uzupełniającym 1B-D dla zapytań ofertowych, YFP i CFP. Wykonaj ten krok dla każdego kanału, jeden po drugim.
      UWAGA: Aby upewnić się, że wizualizowany sygnał nie jest autofluorescencją, jako kontrolę ujemną na tym etapie można użyć przekroju zwierzęcia z ujemnym wynikiem Cre. Ponieważ T-PMT został połączony z laserem RFP (krok 7.2.1), dostosowanie mocy lasera do zapytania ofertowego wpłynie na sygnał T-PMT.
   2. W razie potrzeby dostosuj rozmiar otworu, aby zwiększyć wykrywanie fluorescencji.
      UWAGA: Im większy rozmiar otworka, tym więcej sygnału fluorescencyjnego jest wykrywane w kierunku Z. Wskazówką w tym zakresie jest wynikowa jednostka Airy Unit (AU), która jest automatycznie wskazywana pod wskaźnikiem otworkowym, gdzie 1 AU jest optymalne dla jakości obrazu. Zbyt duże zwiększenie AU zakłóci późniejszą analizę, ponieważ trudniej będzie rozróżnić poszczególne komórki w kierunku Z).
   3. Sprawdź konfigurację, aby upewnić się, że nagrane sygnały nie nakładają się na siebie.
      1. Kliknij pola wyboru na karcie Kanały, aby wybrać wszystkie trzy kanały i naciśnij przycisk Snap na karcie Akwizycja.
      2. Na wynikowym obrazie przewijaj między wyświetlanymi kanałami, klikając podświetlone na niebiesko pola nad każdym wymienionym kanałem na karcie Wymiary. Ręcznie sprawdź, czy kanały na ekranie nakładają się na siebie. Jeśli sygnały nakładają się na siebie (np. jeśli każda czerwona komórka jest również żółta), wróć do początku kroku 7.3 i powtórz czynność, dostosowując parametry nakładających się kanałów, aż będzie można je od siebie odróżnić. Upewnij się, że dla każdej etykiety (tj. RFP, YFP lub CFP) można wizualizować co najmniej jeden klon zawierający tylko jedną z etykiet.
4. Zdobądź obraz.
   1. Wybierz kartę Acquisition Mode (Tryb akwizycji), aby określić jakość obrazu za pomocą wartości Frame Size (Rozmiar klatki), Szybkość i Averaging Number (Liczba uśredniania).
      UWAGA: Typowe ustawienia dla tych eksperymentów są wskazane w pliku uzupełniającym 1A. Zmniejszenie powiększenia pod nagłówkiem Obszar skanowania na karcie Akwizycja może zwiększyć pole widzenia bez zmiany czasu wymaganego do uzyskania obrazu.
   2. Na karcie Pozyskiwanie pod nagłówkiem Akwizycja wymiarowa kliknij pole wyboru Z-Stack. Otwórz kartę Z-stack, aby ustawić interwał między obrazami w kierunku Z na 2,5 μm.
   3. Aby ustawić prawidłowe lokalizacje, wybierz tylko RFP/T-PMT na karcie Kanały i kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić czerwone klony z widocznym konturem tkanki. Ustaw pierwszy i ostatni plasterek, klikając Ustaw pierwszy i Ustaw ostatni na odpowiednim plasterku, regulując ostrość za pomocą pokrętła mikroskopu.
   4. Kliknij kartę Skanowanie kafelków na karcie Akwizycja i wprowadź łączną liczbę kafelków w kierunku poziomym i pionowym w odpowiednich polach.
   5. Aby przechwycić obraz, wybierz wszystkie żądane kanały na karcie Kanały, a następnie kliknij przycisk Przyciągaj, aby zebrać pojedynczy obraz, lub przycisk Rozpocznij eksperyment, aby zebrać skan stosu/kafelka Z.
5. Po uzyskaniu obrazu kliknij Plik, a następnie Zapisz jako i zapisz obraz w typie pliku, który zachowuje jak najwięcej informacji o ustawieniach mikroskopu, aby umożliwić późniejsze przejrzenie i ponowne wykorzystanie.
6. Wykonuj dalszą analizę za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wyniki

Aby oznaczyć chondrocyty w chrząstce nasadowej i zobrazować ich klonalną ekspansję wraz z wiekiem za pomocą tamoksyfenu podawanego na P1, Col2CreERT:Myszy konfetti zostały oznaczone, a ich tylne kończyny zostały zebrane na P27. Sekcję środkową określono poprzez wizualizację więzadła krzyżowego (Rycina 2A) i zwizualizowano klony w bliższej płytce wzrostu piszczeli (Figura 2B). Dane te pokazują, że pojedyncze komórki, które były Col2-dodatnie na P1 i zostały znakowane białkami fluorescencyjnymi Confetti po podaniu tamoksyfenu, przeszły ekspansję klonalną, a następnie pozostały na płytce wzrostowej do P27. Początkowe zmiany w ekspansji klonalnej od podobnego punktu rozwojowego można zobaczyć na rysunku 1 z niedawnej publikacji¹³.

Aby dać przykład sygnału fluorescencyjnego po długotrwałym przechowywaniu (krok 5.5), zebrany fragment był przechowywany natychmiast po (zobacz Rysunek 2A,B) przez ponad 3 lata przed jego przygotowaniem i zobrazowaniem (Rysunek 2C, Wideo 1).

Aby zademonstrować niektóre typowe problemy z protokołem, sekcja uszkodzona podczas kroku kriosekcji jest pokazana w Rysunek 3A. Obszar przekroju (między płytką wzrostową a chrząstką stawową) rozszerzony w Rycina 3B pokazuje, że ta dawka tamoksyfenu prowadzi do tak wysokiego poziomu rekombinacji w tym obszarze, że wyklucza to analizę klonalną.

Rysunek 1: Przegląd eksperymentalny. Schemat blokowy podsumowujący kluczowe etapy metody. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazy konfetti z myszy Col2CreERT:Confetti. (A) Próbki myszy Col2CreERT:Confetti zostały przetworzone bez odwapniania lub etapu długoterminowego przechowywania. Odcinek środkowy zlokalizowano za pomocą więzadła krzyżowego jako markera. Obraz ten został zwizualizowany za pomocą skanowania kafelków po wykryciu zapytania ofertowego za pomocą T-PMT (Skala = 300 μm). (B) Kolumny klonalne są pokazane w bliższej części kości piszczelowej płytki wzrostowej widocznej w (A), po rekonstrukcji 3D. (C) Szkiełko sąsiadujące z tym pokazanym w (A) i (B) przechowywane w długotrwałym przechowywaniu przez ponad 3 lata zostało przetworzone w celu obrazowania i rekonstrukcji 3D. RFP, YFP i CFP są pokazane w (B) i (C) (Podziałka liniowa = 50 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wyzwania związane ze stosowaniem metody. (A) Białe przerywane linie wyznaczają pęknięcie w przekroju przechodzącym przez płytkę wzrostową myszy Col2CreERT:Confetti (pasek skali = 50 μm). Obszar w białym polu jest pokazany w (B) (podziałka = 25 μm). RFP, YFP i CFP są pokazane w obu panelach, a kanał nieodbitego światła laserowego (T-PMT) jest również pokazany w (A) w celu wizualizacji tkanki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Trójwymiarowa rekonstrukcja płytki wzrostu z Col2CreERT: Mysz z konfetti. Preparat przygotowany z myszy Col2CreERT: Confetti był przechowywany w długotrwałym przechowywaniu po przekroju przez ponad 3 lata, a następnie przetworzony do obrazowania. Rekonstrukcja trójwymiarowa została przeprowadzona automatycznie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i wyeksportowana w postaci wideo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Typowa konfiguracja mikroskopu konfokalnego. (A) Główne elementy sterujące obecne w zakładce Akwizycja. (B−D) Parametry lasera, długość fali wzbudzenia i zakres zarejestrowanych długości fal emisji są pokazane dla trzech białek fluorescencyjnych Confetti. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Model Confetti był szeroko stosowany do badania zmineralizowanych tkanek chrzęstnych 12,13,14 i do opisania zoptymalizowanego protokołu. Myszy konfetti² z jedną kopią lub dwiema kopiami allelu R26R-Confetti mogą być używane do hodowli i eksperymentów. Rekombinacja u myszy z jednym allelem konstruktu Brainbow 2.1 da cztery potencjalne znaczniki: czerwone białko fluorescencyjne (RFP, cytoplazmatyczne), żółte białko fluorescencyjne (YFP, cytoplazmatyczne), cyjanowe białko fluorescencyjne (CFP, zlokalizowane w błonie) i zielone białko fluorescencyjne (GFP, zlokalizowane w jądrze), podczas gdy rekombinacja u homozygotycznych myszy Confetti (tj. zawierających dwie kopie konstruktu Brainbow 2.1) da 10 możliwych wyjść kolorystycznych (RFP+RFP, RFP+YFP, RFP+CFP, RFP+GFP, YFP+YFP, YFP+CFP, YFP+GFP, CFP+CFP, CFP+GFP, GFP+GFP). Jednakże, ponieważ zdarzenia wycinania i inwersji DNA zachodzą w sposób stochastyczny, rekombinacja w celu wytworzenia GFP zachodzi tylko w niewielkiej części komórek, jak wcześniej opisano², i pozornie różni się w zależności od typu komórki lub użytej linii Cre ^2,12,13. W związku z tym, biorąc pod uwagę niskie występowanie zdarzeń rekombinacji prowadzących do ekspresji GFP, sześć wyjść kolorystycznych jest najczęstszych u homozygotycznych myszy Confetti.

Ważną kwestią przy planowaniu eksperymentów z myszką Confetti jest znalezienie odpowiedniej odmiany Cre. Po pierwsze, ponieważ allel konfetti ma kilka miejsc loxP, jedno zdarzenie rekombinacji nie wyklucza drugiego⁴. Oznacza to, że jeśli komórka jest znakowana i dzieli się, aby wytworzyć klon jednego koloru, drugie zdarzenie rekombinacji w jednej z jej komórek potomnych wygeneruje inny kolor, maskując w ten sposób prawdziwą ekspansję klonalną. W związku z tym nieindukowalne szczepy Cre, w których enzym jest zawsze aktywny, jeśli aktywny jest odpowiadający mu promotor, nie są wskazane. Po drugie, w niektórych szczepach ekspresja rekombinazy Cre często odbywa się kosztem endogennego białka, tworząc w ten sposób własny fenotyp (np. w przypadku szczepu myszy knock-in Prg4-GFPCreERT2, w którym myszy mają dwa allele Cre¹⁵), więc pożądana jest pojedyncza kopia allelu Cre. We wszystkich opisanych eksperymentach pojedyncza kopia Col2CreERT¹⁶ była przenoszona przez samca lub samicę rodzica w celu wygenerowania myszy Col2CreERT: Confetti, jak opisano¹³. Następnie ważnym czynnikiem jest specyfika linii Cre dla typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Na przykład Col2CreERT jest specyficzny dla chondrocytów, ale znakuje kilka odrębnych populacji chondrocytów we wczesnej chrząstce poporodowej¹⁷. Wreszcie, aktywność różnych szczepów Cre może się znacznie zmieniać wraz z wiekiem zwierzęcia, ponieważ endogenna aktywność promotora wykorzystywanego do ekspresji Cre zmienia się, nawet w komórkach tego samego typu (np. Prg4-GFPCreERT2, który może wymagać większej liczby dawek tamoksyfenu, aby oznaczyć komórki strefy powierzchownej jako myszy w wieku¹⁵ lat).

Liczba znakowanych komórek będzie odzwierciedlona przez ilość podanego tamoksyfenu, dlatego nie zawsze pożądane jest podanie maksymalnej dawki, ponieważ odróżnienie klonów od siebie może być trudne. Ze względu na to, że ekspresja Cre będzie się różnić w zależności od regulacji różnych promotorów, a także wraz z wiekiem, dawka tamoksyfenu będzie musiała zostać dostosowana w celu optymalizacji etykietowania. Ważne jest, aby pamiętać, że komórki nie są fluorescencyjne natychmiast po wyzwoleniu rekombinacji, ponieważ potrzeba czasu, aby rekombinacja zaszła, a powstałe białka fluorescencyjne zgromadziły się wystarczająco do obrazowania. Potrzebny jest szeroki zakres godzin (od 24 do 72 godzin), na który wydaje się, że ma wpływ linia Cre, typ komórki i wiek zwierzęcia. Ze względu na to, że tamoksyfen może być biologicznie aktywny długo po podaniu¹⁸ , zawsze zaleca się dokładne sprawdzenie skuteczności rekombinacji w każdym modelu.

Na etapie mikroskopii konfokalnej wzbudzenie białek fluorescencyjnych konfetti wymaga penetracji tkanki światłem laserowym. Ponieważ różne tkanki mają różne właściwości, światło lasera może nie przenikać przez odcinki wszystkich tkanek o grubości 160 μm. Jednak takie grube odcinki można wykorzystać do chrząstki płytki wzrostowej, jak użyto na rysunku 2, rysunku 3. Należy pamiętać, że każdy mikroskop jest inny i jest mało prawdopodobne, że opisane ustawienia (plik uzupełniający 1) będą działać idealnie bez drobnych korekt. Jednym z głównych wyzwań jest rozróżnienie różnych białek fluorescencyjnych, aby upewnić się, że nie dochodzi do zanieczyszczenia z jednego kanału do drugiego. Na przykład sygnał w kanale YFP spowodowany fluorescencją pochodzącą z GFP nakłada się na kanały YFP i RFP. Kanały YFP i CFP również muszą być dokładnie sprawdzone. Można to zrobić na kilka sposobów. Po pierwsze, zakres emisji długości fal światła fluorescencyjnego, które są rejestrowane dla każdego białka fluorescencyjnego, może zostać zawężony. Po drugie, regulacja mocy lasera w połączeniu z cyfrowym wzmocnieniem może zoptymalizować sygnał. W tym badaniu te kroki były wystarczające, ale opierają się na silnym sygnale fluorescencyjnym. Oznacza to, że teoretycznie nieefektywne przetwarzanie tkanek może zmniejszyć aktywność białek fluorescencyjnych, a słabe źródło światła laserowego może zakłócić separację kanałów.

Jedną z zalet myszy Confetti jest to, że można ją łączyć z dużą liczbą dostępnych genetycznie zmutowanych szczepów, dzięki czemu można badać wpływ określonych genów na dynamikę klonalną 10,11,12,13,14,19,20, choć z pewnymi ograniczeniami. Na przykład rekombinacji alleli konfetti i genu będącego przedmiotem zainteresowania nie można rozdzielić w przypadku stosowania mutantów opartych na Cre loxP w połączeniu ze śledzeniem linii klonalnej. Niemniej jednak, takie zbiegające się zdarzenia rekombinacji mogą być skuteczne 10,14,20. Na przykład, możliwość ta została wykorzystana do zbadania zwiększonej liczby komórek w strefie spoczynku myszy po pourodzeniowej ablacji TSC1 specyficznej dla chondrocytów na płytce wzrostowej²¹ i ujawniła klonalne pokrewieństwo między tymi komórkami w czasie¹³. Dodatkowo, specyficzna tkankowo analiza klonalna przy użyciu myszy Confetti może być stosowana ze zmutowanymi myszami nieopartymi na Cre loxP¹¹, a także możliwe jest połączenie tych podejść z farmakologicznymi ^8,9,13 i / lub modelami chirurgicznymi⁸ w celu wizualizacji odpowiedzi klonalnych na inne zaburzenia funkcjonalne. Kolejne możliwości pojawiają się przy łączeniu skrawków znakowanych konfetti z immunodetekcją białek endogennych metodą immunofluorescencji. Taka analiza pozwala na identyfikację śledzonych komórek i ich kolokalizację ze znanym markerem. Dzięki opisanej tutaj metodzie utrwalania możliwe jest przeprowadzenie immunofluorescencji i nadal wizualizacja fluorescencji z białek fluorescencyjnych Confetti^12,13. Jednak we wspomnianych pracach pobieranie antygenu nie było wymagane. Ostre metody odzyskiwania antygenu, takie jak gotowanie w buforze cytrynianowym, prowadzą do całkowitej utraty fluorescencji konfetti. Chociaż białka fluorescencyjne Confetti można następnie wykryć za pomocą przeciwciał²², może dojść do utraty tożsamości klonalnej.

Podsumowując, użycie modelu Confetti do oznaczania komórek in vivo jest pouczającym narzędziem do analizy losu tych komórek w czasie. Opisana metoda zapewnia szybki i skuteczny sposób bezpośredniej wizualizacji ekspresji białek fluorescencyjnych w tkankach zmineralizowanych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,2-tiodieetanol	Sigma	MKCF9328
szkiełka nakrywkowe o długości 60 mm	Mendel-Glä zer	220588
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Zeiss	LSM 710
Olej kukurydziany	Sigma	C8267
Cryomold (standard)	Sakura	4557
Cryostat	Thermo	Model: NX70
Jednorazowe ostrza kriostatu	Histolab	207500014	Specjalnie do stosowania z twardymi tkankami
EDTA	Scharlan	AC0960005P
Koncentrat formaldehydu	Merck	8.18708.1000
Butelki szklane	Sigma	V7130	Może być stosowany do rozcieńczania tamoksyfenu oraz do utrwalania i przetwarzania tkanek
Oprogramowanie Imaris	Oxford Instruments	N/A	Oprogramowanie do analizy obrazu do rekonstrukcji 3D
Isoflurane	Zoetis	11-8162
OCT	Sakura	102094-104
Pipeta Pasteura	Sarstedt	86.1171
PBS	Gibco	14200075
Wodorotlenek sodu	Merck	1.06498.1000
Sacharoza		Sigma S0389
Prowadnice Superfrost UltraPlus	Mendel-Glä zer	J3800AMNZ
Tamoxifen	Sigma	T5648
Zen2 oprogramowanie	Zeiss	N/A	Darmowe oprogramowanie do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej