Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60435

⸱

18 listopada 2019

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół wirowania o różnicowej prędkości w połączeniu z wirowaniem gradientu gęstości w celu oddzielenia mitochondriów od tkanek ludzkiego raka jajnika i kontroli tkanek jajnika do ilościowej analizy proteomicznej, co skutkuje wysokiej jakości próbką mitochondrialną oraz wysokoprzepustową i wysoce odtwarzalną ilościową analizą proteomiczną ludzkiego raka jajnika.

Streszczenie

Rak jajnika to powszechny rak ginekologiczny o wysokiej śmiertelności, ale niejasnym mechanizmie molekularnym. Większość nowotworów jajnika diagnozuje się w zaawansowanym stadium, co poważnie utrudnia terapię. Zmiany mitochondrialne są cechą charakterystyczną ludzkich nowotworów jajnika, a mitochondria są centrami metabolizmu energetycznego, sygnalizacji komórkowej i stresu oksydacyjnego. Dogłębny wgląd w zmiany proteomu mitochondrialnego w raku jajnika w porównaniu z kontrolną tkanką jajnika przyniesie korzyści w dogłębnym zrozumieniu mechanizmów molekularnych raka jajnika oraz odkryciu skutecznych i wiarygodnych biomarkerów i celów terapeutycznych. Przedstawiono skuteczną metodę przygotowania mitochondriów w połączeniu ze znacznikiem izobarycznym do ilościowej proteomiki względnej i bezwzględnej kwantyfikacji (iTRAQ) w celu analizy ludzkiego raka jajnika i kontroli proteomów mitochondrialnych, w tym wirowania o różnej prędkości, wirowania w gradieniu gęstości, oceny jakości próbek mitochondrialnych, trawienia białek trypsyną, znakowania iTRAQ, frakcjonowania silnej kationowymienności (SCX), chromatografii cieczowej (LC), masy tandemowej spektrometria (MS/MS), analiza baz danych i analiza ilościowa białek mitochondrialnych. Udało się zidentyfikować wiele białek, aby zmaksymalizować pokrycie proteomu mitochondrialnego ludzkiego raka jajnika i osiągnąć zróżnicowany profil białek mitochondrialnych w ludzkim raku jajnika.

Wprowadzenie

Rak jajnika jest powszechnym nowotworem ginekologicznym o wysokiej śmiertelności, ale niejasnym mechanizmie molekularnym1,2. Większość nowotworów jajnika diagnozuje się w zaawansowanym stadium, co poważnie utrudnia terapię. Zmiany mitochondrialne są cechą charakterystyczną ludzkich nowotworów jajnika, a mitochondria są centrami metabolizmu energetycznego, sygnalizacji komórkowej i stresu oksydacyjnego3,4,5,6,7. Dogłębny wgląd w zmiany proteomu mitochondrialnego w raku jajnika w porównaniu z kontrolną tkanką jajnika przyniesie korzyści w dogłębnym zrozumieniu mechanizmów molekularnych raka jajnika oraz odkryciu skutecznych i wiarygodnych biomarkerów i celów terapeutycznych. Metabolizm mitochondrialny został zaproponowany i uznany za cel terapii przeciwnowotworowej, a terapia antymitochondrialna może ostatecznie być bardzo korzystna w zapobieganiu nawrotom i przerzutom raka8. Indywidualne profilowanie metaboliczne jest już praktykowane jako użyteczne narzędzie do stratyfikacji nowotworów i strategii predykcyjnych9,10.

Długoterminowym celem tych badań jest opracowanie i wykorzystanie ilościowej metody proteomiki mitochondrialnej do badania raka jajnika w celu wyjaśnienia zmian w proteomie mitochondrialnym między rakiem jajnika a tkankami kontrolnymi jajnika oraz zmian ich sieci molekularnej z systematycznego punktu widzenia multiomicznego11,12, co zaowocuje odkryciem biomarkerów molekularnych ukierunkowanych na mitochondria13 W celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych raka jajnika, przewidywania i spersonalizowanego leczenia pacjentek z rakiem jajnika. Znaczniki izobaryczne do oznaczania względnej i bezwzględnej kwantyfikacji (iTRAQ) 3,4 są skuteczną metodą ilościowego określania zmian białek mitochondrialnych. Przygotowanie wysokiej jakości próbek mitochondrialnych z ludzkiego raka jajnika i kontrolnych tkanek jajnika jest warunkiem wstępnym analizy ilościowej proteomów mitochondrialnych iTRAQ3. Preparat mitochondrialny w połączeniu z proteomiką ilościową iTRAQ został z powodzeniem wykorzystany w długoterminowych programach badawczych dotyczących proteomu mitochondrialnego ludzkiego raka jajnika, w tym w ustaleniu map referencyjnych proteomu mitochondrialnego3, analiza profili mitochondrialnych o zróżnicowanej ekspresji4,14 oraz modyfikacje potranslacyjne, w tym fosforylacja, która już doprowadziła do odkrycia ważnych zmian w sieci szlaków sygnałowych w ludzkich nowotworach jajnika5, w tym zmian w metabolizmie energetycznym4, metabolizm lipidów i systemy szlaków mitofagii3.

Poprzednie badania wykazały, że wirowanie o różnicowej prędkości w połączeniu z wirowaniem w gradionym gradiencie gęstości jest skuteczną metodą izolacji i oczyszczania mitochondriów z ludzkiego raka jajnika oraz kontroli tkanek jajnika3,4,5,14. Znakowanie iTRAQ w połączeniu z chromatografią cieczową z silną kationową wymianą (SCX) i chromatografią cieczową (LC)-tandemową spektrometrią mas (MS/MS) jest kluczową techniką wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania białek z przygotowanych próbek mitochondrialnych.

Tutaj opisane są szczegółowe protokoły preparacji mitochondriów w połączeniu z proteomiką ilościową iTRAQ. Zostały one z powodzeniem wykorzystane w analizie proteomów mitochondrialnych tkanki ludzkiego raka jajnika. Protokoły obejmują przygotowanie próbek, wirowanie z różnicową prędkością, wirowanie w gradiencie gęstości, ocenę jakości próbek mitochondrialnych, trawienie białek za pomocą trypsyny, znakowanie iTRAK, frakcjonowanie SX, LC, MS/MS, przeszukiwanie baz danych i analizę ilościową białek mitochondrialnych. Co więcej, protokół ten łatwo przekłada się na analizę innych proteomów mitochondrialnych tkanek ludzkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki tkanki jajnikowej, w tym tkanki raka jajnika (n = 7) i normalne kontrolne tkanki jajnika (n = 11) zostały użyte do tego protokołu. Obecny protocol3,4,5 jest zatwierdzony przez Komitet Etyki Medycznej Szpitala Xiangya Uniwersytetu Central South w Chinach.

1. Przygotowanie mitochondriów z tkanek ludzkiego raka jajnika

  1. Przygotować 250 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego, mieszając 210 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 100 mM chlorku potasu (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM kwasu diaminotetraoctowego (EDTA), 0,1 mM glikolu etylenowego kwasu bis(2-aminoetylowego)tetraoctowego (EGTA), 1 mM inhibitora proteazy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), 2 mM ortowanadanu sodu (V) i 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), Odczyn pH 7,4.
  2. Umieść ~1,5 g tkanek raka jajnika w czystym szklanym naczyniu.
  3. Dodaj 2 ml wstępnie schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów, aby 3x delikatnie zmyć krew z powierzchni tkanki.
  4. Użyj czystych nożyczek okulistycznych, aby całkowicie zmielić tkankę na około 1 mm3 kawałki i przenieś zmielone tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  5. Dodać 13,5 ml buforu do izolacji mitochondriów zawierającego 0,2 mg/ml nagarzyny, a następnie użyć homogenizatora elektrycznego do homogenizacji (użyj skali 2, 10 s 6x, odstęp 10 s) zmielonych tkanek (2 min, 4 °C).
  6. Dodać kolejne 3 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego do homogenatów tkankowych i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
  7. Odwirować przygotowany homogenat tkankowy (1,300 x g, 10 min, 4 °C). Usunąć surową frakcję jądrową (tj. osad) i zachować supernatant.
  8. Odwirować supernatant (10 000 x g, 10 min, 4 °C). Usuń mikrosomy (tj. supernatant) i zachowaj osad.
  9. Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego i dobrze zawiesić osad przez lekkie pipetowanie.
  10. Odwirować zawiesinę osadów (7 000 x g, 10 min, 4 °C). Odrzuć supernatant i zachowaj surowe mitochondria (tj. osad).
  11. Dodaj 12 ml pożywki o gradiencie gęstości 25% (tj. Nycodenz), aby ponownie zawiesić wyekstrahowane surowe mitochondria.
  12. Wykonaj nieciągły gradient gęstości, wypełniając probówkę od dołu do góry 5 ml 34%, 8 ml 30%, 12 ml 25% (zawierającej surowe mitochondria z kroku 1.11), 8 ml 23% i 3 ml pożywki o 20% gradiencie gęstości i odwiruj ją (52 000 x g, 90 min, 4 °C).
  13. Użyj długiej i strzykawki, aby zebrać oczyszczone mitochondria na granicy między pożywką o gradiencie gęstości 25% i 30% do czystej probówki.
  14. Dodaj bufor izolacyjny mitochondriów do zebranych mitochondriów, aby rozcieńczyć go do trzykrotnej objętości. Odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C) i odrzucić supernatant.
  15. Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego w celu ponownego zawieszenia osadu i odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C). Odrzucić supernatant i zachować osad.
  16. Zebrać ostateczną osadkę (tj. oczyszczone mitochondria) i przechowywać ją w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Połącz wszystkie oczyszczone mitochondria z tkanki raka jajnika jako próbkę mitochondriów do ilościowej analizy proteomicznej.

2. Przygotowanie mitochondriów z ludzkich tkanek kontrolnych jajnika

  1. Przygotować 250 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego zgodnie z opisem w kroku 1.1.
  2. Umieść ~1,5 g normalnych kontrolnych tkanek jajnika w czystym szklanym naczyniu.
  3. Dodaj 2 ml wstępnie schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów, aby 3x delikatnie zmyć krew z powierzchni tkanki.
  4. Użyj czystych nożyczek okulistycznych, aby całkowicie zmielić tkankę na około 1 mm3 kawałki i przenieś zmielone tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  5. Dodaj 8 ml 0,05% trypsyny/20 mM EDTA w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) do zmielonych tkanek kontrolnych i trawić (30 min, temperatura pokojowa), co pomaga w lizie tkanek i komórek oraz uwolnieniu mitochondriów. Następnie odwirować (200 x g, 5 min). Odrzucić supernatant i zachować tkanki i komórki.
  6. Dodać 13,5 ml buforu do izolacji mitochondriów zawierającego 0,2 mg/ml nagarzyny, a następnie użyć homogenizatora elektrycznego do homogenizacji (użyj skali 2, 10 s 6x, odstęp 10 s) zmielonych tkanek (2 min, 4 °C).
  7. Dodać kolejne 3 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego do homogenatów tkankowych i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
  8. Odwirować przygotowany homogenat tkankowy (1 300 x g, 10 min, 4°C). Usunąć surową frakcję jądrową (tj. osad) i zachować supernatant.
  9. Odwirować supernatant (10 000 x g, 10 min, 4°C). Usuń mikrosomy (tj. supernatant) i zachowaj osad.
  10. Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego, aby dobrze zawiesić osad przez lekkie pipetowanie.
  11. Odwirować zawiesinę osadów (7 000 x g, 10 min, 4 °C). Odrzuć supernatant i zachowaj surowe mitochondria (tj. osad).
  12. Dodaj 12 ml pożywki o gradiencie gęstości 25%, aby ponownie zawiesić wyekstrahowane surowe mitochondria.
  13. Wykonaj nieciągły gradient gęstości, wypełniając probówkę od dołu do góry 8 ml 38%, 5 ml 34%, 8 ml 30%, 12 ml 25% (zawierającej surowe mitochondria z kroku 2.12), 8 ml 23% i 3 ml pożywki o 20% gradiencie gęstości i odwiruj ją (52 000 x g, 90 min, 4 °C).
  14. Użyj długiej i strzykawki, aby zebrać oczyszczone mitochondria w zakresie od granicy faz od 25% do 30% do granicy faz od 34% do 38% do czystej probówki.
  15. Dodaj bufor izolacyjny mitochondriów do zebranych mitochondriów, aby rozcieńczyć go do trzykrotnej objętości. Odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C) i odrzucić supernatant.
  16. Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego w celu ponownego zawieszenia osadu i odwirować go (15 000 x g, 20 min, 4 °C). Odrzucić supernatant i zachować osad.
  17. Zebrać ostateczną osadkę (tj. oczyszczone mitochondria) i przechowywać ją w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Połącz wszystkie oczyszczone mitochondria z kontrolnej tkanki jajnika jako próbki mitochondrialne do ilościowej analizy proteomicznej.

3. Weryfikacja jakości oczyszczonych próbek mitochondriów

tkanek
  1. Pobrać probówkę z oczyszczonymi próbkami mitochondrialnymi (tj. granulkami z tkanek raka jajnika z kroku 1.16 i tkankami kontrolnymi jajnika z kroku 2.17) w celu weryfikacji za pomocą mikroskopii elektronowej (EM).
    UWAGA: Szczegółowy protokół został opisany wcześniej15,16.
  2. Przygotować bufor do ekstrakcji białek mitochondrialnych, mieszając 8 M mocznika, 2 M tiomocznik, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM ditiotreitolu (DTT) i 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropylo)dimetyloamonio)-1-propanosulfonianu (CHAPS). Dostosuj pH do 8,52.
  3. Weź probówkę z oczyszczonymi próbkami mitochondrialnymi (tj. granulkami z tkanek raka jajnika w kroku 1.16 i kontrolnymi tkankami jajnika w kroku 2.17) i dodaj bufor do ekstrakcji białek mitochondrialnych (próbki mitochondrialne do buforu do ekstrakcji białek, 1:5) w celu ponownego zawieszenia osadu. Próbki należy 3x zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  4. Odwirować przy 12 000 x g, 30 min, 4 °C, zebrać supernatant (tj. wyekstrahowaną próbkę białka mitochondrialnego) i zmierzyć zawartość białka za pomocą zestawu do oznaczania białka kwasu bicinchoninowego (BCA).
  5. Przygotować 50 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), mieszając 9,08 g Tris i 40 ml ddH2O, dostosowując pH do 8,8 za pomocą HCl i dodając ddH2O do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotować 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8), mieszając 6,06 g Tris i 40 ml ddH2O, dostosowując pH do 6,8 za pomocą HCl i dodając ddH2O do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować 100 ml 30% roztworu akryloamidu-bis, mieszając 29 g akrylamidu, 1 g bis-akrylamidu i 80 ml ddH2O i dodając ddH2O do końcowej objętości 100 ml. Przechowywać w brązowej butelce w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotuj 1,000 ml 10x buforu do elektroforezy tris-glicyny, mieszając 29 g glicyny, 58 g Tris, 3,7 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 800 ml ddH2O, a następnie dodając ddH2O do końcowej objętości 1,000 ml.
  9. Przygotować 10 ml buforu ładującego, mieszając 2 ml gliceryny, 0,02 g błękitu bromofenolowego, 0,4 g SDS, 2 ml Tris-HCl pH 6,8 i 7 ml ddH2O, a następnie dodając ddH2O do końcowej objętości 10 ml.
  10. Przygotować 10 ml 10% żelu rozdzielczego w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), mieszając 4 ml ddH2O, 3,3 ml 30% roztworu akryloamidu-Bis, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% nadsiarczanu amonu i 0,004 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Wlej rozdzielczy roztwór żelu SDS-PAGE do płytki między szklanymi płytkami do poziomu dna grzebienia. Dodaj 2 ml alkoholu izopropylowego na wierzch. Pozostaw na 30 min.
  11. Usuń alkohol izopropylowy i umyj wierzch ddH2O 3x. Wlej 5% roztwór żelu o stężeniu zawierającym 4,1 ml ddH2O, 1,0 ml 30% roztworu acyloamidu-bis, 0,75 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml 10% nadsiarczanu amonu i 0,006 ml TEMED. Natychmiast włóż grzebień do roztworu żelu o zatężeniu, pozostaw na 30 minut, a następnie wyjmij grzebień.
  12. Przygotować 1x bufor do elektroforezy tris-glicyny, rozcieńczając 100 ml 10x buforu do elektroforezy tris-glicyny 900 ml ddH2O i wlać do zbiornika elektroforetycznego.
  13. Wymieszać 30 μg białek mitochondrialnych z raka jajnika i kontrolować tkanki jajnika z kroku 3.4 za pomocą buforu ładującego, aby osiągnąć końcową objętość 20 μl. Gotuj mieszaninę przez 5 minut, a następnie oddziel ją za pomocą 10% żelu rozdzielczego SDS-PAGE przy stałym napięciu 100 V. Gdy błękit bromfenolowy dotrze do dna, przerwij elektroforezę.
  14. Przygotować 1,5 l elektroforetycznego buforu transferowego, mieszając 150 ml 10x buforu do elektroforezy tris-glicyny, 1,050 ml ddH2O i 300 ml metanolu.
  15. Namoczyć membranę PVDF w 100% metanolu na 10 minut i w elektroforetycznym buforze transferowym na co najmniej 5 minut. Namoczyć pięć arkuszy bibuły filtracyjnej w 1x elekroforetycznym buforze transferowym na co najmniej 5 minut.
  16. Wyjąć żel SDS-PAGE zawierający białka i zanurzyć go w buforze elektroforetycznym na 10 minut.
  17. Wykonaj kasetę transferową, umieszczając mokrą gąbkę na białej płytce, trzech arkuszach mokrej bibuły filtracyjnej, membranie PVDF, żelu SDS-PAGE z białkami, dwóch arkuszach mokrej bibuły filtracyjnej i mokrej gąbce od dołu do góry. Unikaj pęcherzyków.
  18. Umieść kasetę transferową w zbiorniku elektroforetycznym, wlej elektroforetyczny bufor transferowy, a następnie przenoś przez 2 godziny pod stałym prądem 200 mA.
  19. Przygotować 10x roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowany przez Tris (TBS), mieszając 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl i dodając ddH2O do końcowej objętości 500 ml. Przygotuj 2 litry 1x TBST, mieszając 200 ml 10x TBS, 2 ml Tween-20 i 1,798 ml ddH2O. Przygotuj 100 ml roztworu blokującego, mieszając 100 ml TBST i 5 g BSA.
  20. Po przeniesieniu wyjmij membranę PVDF, umyj ją lekko w TBST przez 5 minut, a następnie zablokuj w roztworze blokującym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  21. Inkubować błonę PVDF (4 °C przez noc) z różnymi pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla różnych organelli subkomórkowych, w tym laminą B (jądro komórkowe; kozie przeciwciało anty-ludzkie 1: 1000 roztwór blokujący), flotyliną-1 (cytomembrana; roztwór blokujący przeciwciało przeciw człowiekowi królikowi 1:500), COX4I1 (mitochondrium; króliczy roztwór blokujący anty-ludzki 1:1,000), GM130 (aparat Golgiego; mysie przeciwciało anty-ludzkie 1:1,000 roztwór blokujący), katalaza (peroksysom; królicze przeciwciało anty-ludzkie 1: 1,000 roztworu blokującego) i katepsyna B (lizosom; królicze przeciwciało anty-ludzkie 1:1,000 roztwór blokujący). Lekko prać w TBST przez 5 min 3x.
  22. Inkubować membranę PVDF przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (anty-kozioł królika, kozioł anty-królik lub kozioł anty-mysz). Lekko prać w TBST przez 5 min 3x. Wizualizacja za pomocą elektrochemiluminescencji (ECL).

4. Analiza iTRAQ-SCX-LC-MS/MS

UWAGA: Szczegółowe procedury dla sekcji 4 odnoszą się do instrukcji iTRAQ (Tabela materiałów).

  1. Dodać bufor SDT (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7,6 i 100 mM DTT) do oczyszczonych próbek mitochondrialnych (tj. granulek z tkanek raka jajnika z kroku 1.16 i tkanek kontrolnych jajnika z kroku 2.17). Wirować próbkę, aż nie będzie widocznego osadu.
    UWAGA: Stosunek próbki mitochondrialnej do bufora SDT powinien wynosić 1:5.
  2. Gotować próbkę poddaną działaniu SDT przez 5 minut, schłodzić próbkę na lodzie, a następnie odwirować (2 000 x g, 2 min).
  3. Zebrać supernatant jako wyekstrahowane próbki białka mitochondrialnego i zmierzyć zawartość białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
  4. Weź białka mitochondrialne ekstrahowane SDT (200 μg z każdej próbki) do redukcji, alkilacji, trawienia trypsyną, odsalania i liofilizacji3,4. Wykonać trzy powtórzenia dla każdej próbki.
  5. Potraktuj peptydy tryptyczne (100 μg każdej próbki) z kroku 4.4 100 mM roztworem bromku tetraetyloamoniowego (pH 8,5) i oznacz peptydy tryptyczne jednym z odczynników iTRAQ 6-plex zgodnie z jego instrukcjami3,4. Oznacz każdą próbkę 3 razy.
  6. Wymieszaj równo 6 znakowanych próbek peptydu tryptycznego (trzy z tkanek raka jajnika i trzy z kontrolnych tkanek jajnika) i wysusz za pomocą koncentratora próżniowego.
  7. Frakcjonować zmieszane peptydy znakowane iTRAQ za pomocą chromatografii SCX na 60 frakcji (jedna frakcja na 1 minutę), a następnie łączyć co dwie frakcje jako próbkę frakcjonowaną SCX (n = 30).
  8. Poddaj każdą próbkę frakcjonowaną SCX analizie LC-MS/MS na spektrometrze mas3,4 sprzężona z systemem nano LC w 60-minutowym gradiencie separacji LC, aby uzyskać dane MS/MS.
  9. Przeszukaj dane MS/MS w celu zidentyfikowania białek za pomocą wyszukiwarki (Tabela materiałów).
  10. Użyj intensywności jonów reporterowych iTRAQ do ilościowego określenia każdego białka i określenia mitochondrialnych białek o zróżnicowanej ekspresji (mtDEP) ze zmianą >1,5 lub <-1,5 krotności i p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wystąpiły różnice w przygotowaniu mitochondriów z tkanek raka jajnika oraz kontrolnych tkanek jajnika. W niniejszym badaniu stwierdzono, że przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika było znacznie łatwiejsze niż z kontrolnych tkanek jajnika3,4. W protokole przygotowania mitochondriów z kontrolnych tkanek jajnika należało wprowadzić pewne ulepszenia. Po pierwsze, przed homogenizacją tkanki konieczne było dodanie 8 mL 0,05% t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmiany mitochondrialne są cechą charakterystyczną raka jajnika. Przygotowanie wysokiej jakości próbek mitochondrialnych z ludzkiego raka jajnika i tkanek kontrolnych do proteomiki ilościowej na dużą skalę przynosi korzyści w dogłębnym zrozumieniu funkcji mitochondriów w patogenezie raka jajnika i zmianach w mitochondrialnej sieci molekularnej, a także pomaga wyjaśnić jego mechanizm molekularny w celu późniejszego odkrycia terapii celowanej i skutecznych biomarkerów opartych na mitochondriach ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Hunan Provincial Hundred Talent Plan (do X.Z.), Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (do XZ), National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81572278 i 81272798 do XZ), granty z China "863" Plan Project (Grant nr 2014AA020610-1 dla XZ) oraz Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant nr 14JJ7008 dla XZ). X.Z. opracował koncepcję niniejszego manuskryptu, uzyskał ilościowe dane proteomiczne iTRAQ próbek mitochondriów, napisał i zredagował manuskrypt, koordynował odpowiednie prace oraz był odpowiedzialny za wsparcie finansowe i odpowiednie prace. H.L. przygotował próbki mitochondriów. S.Q. uczestniczyła w pracach cząstkowych. X.H.Z brał udział w pisaniu i redagował język angielski. N.L. przeanalizował dane proteomiczne iTROAK. Ostateczny tekst został zatwierdzony przez wszystkich autorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania białek BCAVazymeE112Zestaw do oznaczania białek BCA to specjalna 3-składnikowa wersja naszych popularnych odczynników BCA, zoptymalizowana do pomiaru (A562nm) całkowitego stężenia białka w rozcieńczonych roztworach białkowych (0,5 do 20 mikrogramów/ml).
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SolarbioA8020-5G Frakcjaszoku cieplnego, pochodzenie australijskie, bez proteazy, niska zawartość kwasów tłuszczowych, niskie IgG, pH 7, ≥ 98%
WirówkaXiangYiTDZ4--WS
CHAPSSigmaC9426-5GBioReagent, odpowiedni do elektroforezy, ≥ 98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) Kwas
diaminotetraoctowy (EDTA)Sigma798681-100GBezwodny, sypki, Redi-Dri, ≥ 98%
DTTSigma101977770011,4-Dithiothreitol
Easy nLCProxeon Biosystems (obecnie Thermo Fisher Scientific)
Glikol etylenowy bis(eter 2-aminoetylowy)kwas tetraoctowy (EGTA)SigmaE0396-10GBioXtra, ≥ 97 .0%
HomogenizatorSilentShakeHYQ-3110
Zestaw odczynników iTRAQApplied BiosystemsApplied Biosystems Odczynniki iTRAQ– Przewodnik po chemii, nr części 4351918A
Niskotemperaturowa wirówka superszybkaEppendorf5424R
MannitolMacklinM813424-100GMannitol to poliol (alkohol wielowodorotlenowy) wytwarzany w wyniku uwodornienia fruktozy, który działa jako słodzik, substancja utrzymująca wilgoć i substancja wypełniająca. Ma niską higroskopijność i słabą rozpuszczalność oleju.
Wyszukiwarka MASCOTMatrix Science, Londyn, Wielka Brytania; wersja 2.2
NagarseSolarbioP9090
N-hydroksysukcynimid (SDT)Sigma56480-25GPurum, ≥ 97,0% (T)
NycodenzAlere/Axis-Shield1002424-1
Inhibitor proteazy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF)SolarbioP0100-1MLPMSF jest inhibitorem proteazy, który reaguje z resztą seryny w celu zahamowania trypsyny, chymotrypsyny, trombiny i papainy.
Chlorek potasuMacklinP816354-25GChlorek potasu, KCI, znany również jako muriate potasu i sylwit, jest bezbarwnym krystalicznym ciałem stałym o słonym smaku, który topi się w temperaturze 776 stopni; C (1420 Z). Jest rozpuszczalny w wodzie, ale nierozpuszczalny w alkoholu. Chlorek potasu jest stosowany w nawozach, farmaceutykach, fotografii oraz jako substytut soli.
Proteome Discover 1.4Matrix Science, Londyn, Wielka Brytania
Membrana PVDFMillipore05317Jest to 1 rolka, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 &mikro; m wielkości porów, hydrofobowa membrana transferowa PVDF o niskiej fluorescencji tła do western blotting. Jest kompatybilny z sondami fluorescencyjnymi w zakresie widzialnym i podczerwonym.
Q Exactive spektrometr masowyThermo Fisher Scientific
SCX kolumnaSigma58997Jest to 5-μ m wielkość cząstek, długość 5 cm i razy; średnica wewnętrzna 4,6 mm (Supelco).
Ortowanadan sodu (V)MacklinS817660-25GOrtowanadan sodu (Wanadan) jest ogólnym inhibitorem kompetycyjnym dla białkowych fosfataz fosfatyrozylowych. Hamowanie przez ortowanadan sodu jest odwracalne po dodaniu EDTA lub rozcieńczeniu.
SacharozaMacklinS824459-500Godczynnik Vetec, 99%
ThiomocznikSigma62-56-6ACS, ≥ 99,0%
Baza TrisBaza Sigma10708976001TRIS jest przydatna w zakresie pH 7,0-9,0. Ma pKa 8,1 przy 25°C.
Trypsyna (zastosowanie w hodowli komórkowej)Gibco25200-056Ten płynny preparat trypsyny zawiera EDTA i czerwień fenolową. Gibco Trypsin-EDTA jest wytwarzany z trypsyny w proszku, napromieniowanej mieszaniny proteaz pochodzących z trzustki świni. Ze względu na swoją siłę trawienną trypsyna jest szeroko stosowana do dysocjacji komórek, rutynowego pasażowania hodowli komórkowych i pierwotnej dysocjacji tkanek.
MocznikSigmaU5378-100Gw proszku, BioReagent, do biologii molekularnej, odpowiedni do hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57(2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2(2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455(2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841(2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812(2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mitochondriówtkanka raka jajnikaróżnicowe wirowaniewirowanie w gradiencie gęstościproteomika iTRAQtrawienie białeksilna wymiana kationowachromatografia cieczowatandemowa spektrometria masproteom mitochondrialny
Przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.