Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60440

⸱

12 listopada 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca przedstawia protokół do uzyskania jednorodnych kultur komórkowych pierwotnych neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych. Kultury te można wykorzystać do analiz porównawczych cech morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych neuronów ruchowych oka i rdzenia.

Streszczenie

Neurony okoruchowe (CN3) i neurony bloczkowe (CN4) wykazują niezwykłą odporność na choroby zwyrodnieniowe neuronów ruchowych, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) w porównaniu do rdzeniowych neuronów ruchowych (SMN). Zdolność do izolowania i hodowli pierwotnych mysich CN3, CN4 i SMN zapewniłaby podejście do badania mechanizmów leżących u podstaw tej selektywnej podatności. Do tej pory większość protokołów wykorzystuje heterogeniczne hodowle komórkowe, co może zakłócić interpretację wyników eksperymentów. Aby zminimalizować problemy związane z populacjami mieszanych komórek, niezbędne są czyste kultury. W tym miejscu pierwszy protokół szczegółowo opisuje, jak skutecznie oczyszczać i hodować CN3/CN4 wraz z odpowiednikami SMN z tych samych zarodków przy użyciu transgenicznych zarodków myszy IslMN:GFP dnia embrionalnego 11,5 (E11,5). Protokół zawiera szczegółowe informacje na temat rozwarstwienia i dysocjacji tkanek, izolacji komórek opartej na FACS oraz hodowli in vitro komórek z jąder CN3/CN4 i SMN. Protokół ten dodaje nowatorski system hodowli CN3/CN4 in vitro do istniejących protokołów, a jednocześnie zapewnia czystą kulturę SMN dopasowaną do gatunku i wieku do porównania. Analizy koncentrujące się na morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych cechach neuronów ruchowych są możliwe w tym systemie hodowli. Protokół ten umożliwi badania nad mechanizmami, które definiują rozwój neuronów ruchowych, selektywną podatność i chorobę.

Wprowadzenie

Kultura pierwotnych neuronów ruchowych to potężne narzędzie, które umożliwia badanie rozwoju, funkcji i podatności neuronów na egzogenne stresory. Hodowle neuronów ruchowych są szczególnie przydatne do badania chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS)1,2, których mechanizmy chorobowe nie są w pełni poznane. Co ciekawe, pomimo znacznej śmierci komórek rdzeniowych neuronów ruchowych (SMN) zarówno u pacjentów z ALS, jak i myszy modelowych ALS, śmierć komórek w neuronach okoruchowych (CN3) i neuronach bloczkowych (CN4) jest stosunkowo rzadka1,3,4,5,6,7,8,9. Dlatego analizy porównawcze czystych kultur CN3/CN4 i SMN mogą dostarczyć ważnych wskazówek na temat mechanizmów leżących u podstaw względnej podatności. Niestety, główną przeszkodą w takich analizach jest niemożność wyhodowania oczyszczonych kultur tych neuronów ruchowych.

Opisano wiele protokołów oczyszczania SMN z modeli zwierzęcych. Większość z tych protokołów wykorzystuje techniki wirowania w gradiencie gęstości10,11,12 i/lub p75 NTR-antibody-based cell sorting sorting technology13,14,15,16. Wirowanie w gradiencie gęstości wykorzystuje większy rozmiar SMN w stosunku do innych komórek rdzeniowych, podczas gdy p75NTR jest białkiem zewnątrzkomórkowym wyrażanym wyłącznie przez SMN w rdzeniu kręgowym. Prawie 100% czyste kultury SMN zostały wygenerowane przez jeden lub oba te protokoły11,12,14. Jednak protokoły te nie odniosły sukcesu w generowaniu kultur CN3 / CN4, ponieważ CN3 / CN4 nie wyrażają p75NTR, a inne specyficzne markery CN3 / CN4 nie zostały zidentyfikowane. Są one również mniejsze niż SMN i dlatego trudniej je odizolować na podstawie rozmiaru. Zamiast tego badania in vitro CN3 lub CN4 opierały się na dissociated17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, and slice27,28 kultur, które składają się z heterogenicznych typów komórek, i nie istnieją żadne protokoły dotyczące izolacji i hodowli pierwotnych CN3 lub CN4.

Tutaj opisany jest protokół wizualizacji, izolacji, oczyszczania i hodowli CN3, CN4 i SMN z tego samego dnia embrionalnego 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgeniczne myszy29 (Rysunek 1, Rysunek 2A). IslMN: GFP specyficznie znakuje neurony ruchowe farnezylowanym GFP, który lokalizuje się w błonie komórkowej. Protokół ten umożliwia porównanie wielu typów neuronów ruchowych w zależności od gatunku i wieku w celu wyjaśnienia mechanizmów patologicznych w chorobie neuronu ruchowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Dziecięcego w Bostonie.

1. Ustawianie krzyżowania czasowego przed sekcją

  1. Aby wygenerować prenatalne myszy embrionalne do pobrania neuronów ruchowych, zważ każdą samicę myszy i ustaw krycie w czasie między dorosłymi transgenicznymi myszami IslMN: GFP 11,5 dnia przed dniem izolacji neuronów. W celu opracowania tego protokołu wykorzystano myszy 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP w wieku 2-9 miesięcy, a wieczorem ustalono krycie w czasie.
  2. Następnego ranka zbadaj samice myszy pod kątem zatyczek dopochwowych. Należy wziąć pod uwagę dzień, w którym czop został zidentyfikowany jako dzień embrionalny (E) 0,5.
  3. Zważyć samice myszy i zbadać pod kątem młodych za pomocą ultradźwięków (patrz tabela materiałów) w zakresie E8,5−11. Sprawdź, czy nie ma oznak udanego krycia.
    1. Potwierdź udane krycie, wykrywając przyrost masy ciała u samic myszy (zwykle >1,5 g na E9,5, jeśli jest więcej niż 5-6 zarodków).
    2. Wizualnie potwierdź zarodki pod ultradźwiękami. Zarodki są łatwo wykrywalne za pomocą ultradźwięków po E9,5. USG wykonuje się tylko u kobiet, które przybrały na wadze, ponieważ częściej są w ciąży niż te, które tego nie robią.
      nuta: Samice myszy mogą przybierać na wadze z powodów innych niż ciąża, więc sam przyrost masy ciała nie jest wiarygodnym wskaźnikiem ciąży. Potwierdzenie ultrasonograficzne zapobiega niepotrzebnemu poświęcaniu samic, które nie są w ciąży, ale nie jest niezbędne, jeśli jest niedostępne.

2. Warunki sekcji i przygotowanie narzędzi

  1. Wykonać wszystkie prace związane z powlekaniem (z wyjątkiem czyszczenia szkiełek nakrywkowych kwasem), przygotowaniem podłoża, dysocjacją tkanek (z wyjątkiem wirowania i inkubacji) oraz pracami hodowlanymi w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylność pożywki i embrionalnych neuronów ruchowych.
  2. Zwracając szczególną uwagę na sterylną technikę, należy przeprowadzić sekcję tkanek poza okapem z przepływem laminarnym przy minimalnym ryzyku zanieczyszczenia.
  3. Wysterylizuj jedną płytkę separacyjną, jedną parę nożyczek do mikropreparacji, jedną parę kleszczy opatrunkowych do kciuków, dwie pary pęset Dumont #5, jeden nóż do mikropreparacji i jedną mini perforowaną łyżkę Moria, zanurzając ją w 70% etanolu przed użyciem.

3. PDL/Lamininowe powlekanie naczyń/Szkiełka nakrywkowe

UWAGA: Hodowla dysocjowała pierwotne neurony ruchowe na płytkach 96-dołkowych lub 24-dołkowych, w zależności od liczby komórek wymaganych do aplikacji. Komórki można obrazować bezpośrednio na płytce do hodowli tkankowej bez użycia szkiełek nakrywkowych, jeśli studzienki są optycznie przezroczyste, a grubość jest zgodna z obrazowaniem.

  1. W przypadku zastosowań wymagających szkiełek nakrywkowych, należy przygotować szkiełka nakrywkowe oczyszczone kwasem, wysterylizowane i wysuszone na powietrzu co najmniej 2 dni przed izolacją neuronów, jak opisano wcześniej30. Partie szkiełek nakrywkowych mogą być przygotowywane w ten sposób z dużym wyprzedzeniem przed eksperymentami i mogą być przechowywane do 6 miesięcy bez wpływu na jakość doświadczenia.
  2. Przygotować roztwór roboczy 20 μg/ml poli-D-lizyny (PDL) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 2 dni przed izolacją neuronu.
    1. Podwielokrotność PDL (1 mg/ml) wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C w postaci roztworu podstawowego.
  3. Pokryć powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego lub studzienki płytki do hodowli tkankowej wystarczającą ilością roztworu roboczego roztworu PDL (np. 100 μl na basenik na płytkach 96-dołkowych lub 500 μl na basenik na płytkach 24-dołkowych z szkiełkami nakrywkowymi lub bez). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. Następnego dnia umyć 3x wysterylizowaną wodą.
    1. Uszczelnić płytki folią parafinową i przechowywać umyte płytki pokryte PDL w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca, jeśli zostaną całkowicie wysuszone po ostatnim myciu.
  5. Przygotować roztwór roboczy z 10 μl lamininy (1,1−1,2 mg/ml) w 1,2 ml PBS.
    1. Zapasy alikwot lamininy (1,1−1,2 mg/ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Pokryj powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego lub studni wystarczającą ilością roztworu lamininy, aby równomiernie pokryć powierzchnię. Przed użyciem inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    nuta: Płytki i szkiełka nakrywkowe pokryte PDL/lamininą można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 37 °C, ale preferowana jest świeżo pokryta laminina. Usuń lamininę bezpośrednio przed posiewem30. Nie należy dopuścić do wyschnięcia Lamininy. Jeśli płytki mają być przechowywane dłużej niż kilka godzin, należy je owinąć folią parafinową.

4. Przygotowanie sekcji, pożywki do hodowli neuronów ruchowych i rozwiązania dysocjacyjne

UWAGA: Stężenia w nawiasach wskazują końcowe stężenia każdego odczynnika.

  1. Przygotować podłoże preparacyjne.
    1. Rozmrozić inaktywowaną termicznie surowicę końską przez noc w temperaturze 4 °C, przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności rozmrozić w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.
    2. Przechowywać suplement witaminy B27 (50x) w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C. Roztwory rozmrozić w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem. Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania.
    3. Przechowuj suplement glutaminy (100x) w temperaturze 4 °C lub -20 °C. Podziel na porcje po 0,5 ml w przypadku przechowywania w temperaturze -20 °C.
    4. Przechowywać penicylinę-streptomycynę (10 000 j./ml) w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C. Roztwory należy rozmrozić w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.
    5. Aby przygotować pożywkę separacyjną, zmieszaj 9,4 ml Hibernate E z 200 μl surowicy końskiej (2%), 200 μl 50x suplementu B27 (1x), 100 μl 100x suplementu glutaminy (1x) (np. GlutaMAX) i 100 μl 10 000 U/ml penicyliny-streptomycyny (100 U/ml). Użyj tego podłoża do zbierania wypreparowanych tkanek i wykonania ostatecznej zawiesiny zdysocjowanych komórek.
    6. Dodać 500 μl pożywki preparacyjnej do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml w celu pobrania tkanek na dzień przed izolacją neuronów. Przygotować jedną probówkę dla każdego rodzaju tkanki, która zostanie pobrana (np. kontrola pozytywna, kontrola ujemna, CN3/CN4, SMN) i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem.
    7. Połącz 49 ml pożywki hibernacyjnej E o niskiej fluorescencji z 1 ml suplementu B27 (1x) i napełnij 24-dołkową płytkę tym podłożem (2 ml / dołek) dzień przed izolacją neuronów. Użyj tego naczynia do zbierania zarodków myszy. Przed użyciem przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli neuronów ruchowych.
    1. Przygotować 250 μl podwielokrotności 25 mM 2-merkaptoetanolu w pożywce L15 firmy Leibovitz. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Wygeneruj 5 μl podwielokrotności 100 μg/ml roztworów BDNF, CNTF i GDNF rozcieńczonych w sterylizowanej wodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić porcje w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.
    3. Przygotować 10 mM roztwór forskoliny, dodając 64 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do 5 mg (1,0670 μM) forskoliny i dobrze odwirować, aby całkowicie się rozpuścić. Następnie dodaj wysterylizowaną wodę (1,003 ml) do roztworu DMSO i dobrze odwiruj. Przechowywać 12 μl podwielokrotności 10 mM forskoliny w temperaturze -20 °C i rozmrażać podwielokrotności w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.
    4. Przygotować 12 μl podwielokrotności 100 mM izobutylometyloksantyny (IBMX) rozcieńczonej w DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 °C i rozmrozić porcje w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.
    5. Aby przygotować pożywkę do hodowli neuronów ruchowych, zmieszaj 9,4 ml pożywki neuropodstawowej z 200 μl surowicy końskiej (2%), 200 μl 50x suplementu B27 (1x), 100 μL 100x suplementu glutaminy (1x), 100 μL 10 000 U/m: penicylina-streptomycyna (100 U/ml) i 20 μL 25 mM 2-merkaptoenolu (50 μM), Najlepiej bezpośrednio przed użyciem. Ten krok można wykonać do 1 dnia przed izolacją neuronów.
    6. Tuż przed użyciem dodaj po 1 μl po 100 μg/ml BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) i GDNF (10 ng/mL) oraz 10 μL 10 mM forskoliny (10 μM) i 10 μL 100 mM IBMX (100 μM) do pożywki hodowlanej neuronów ruchowych. Podgrzej podłoże do temperatury 37 °C.
  3. Przygotuj roztwory dysocjacyjne.
    1. Przygotuj roztwór papainy (20 j./ml papainy i 0,005% DNazy) oraz roztwór inhibitora albuminy i owomukoidów (1 mg/ml inhibitora ovomukoidów, 1 mg/ml albuminy i 0,005% DNazy) zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przygotować 500 μl porcji każdego z roztworów inhibitorów owomukoidów i papainy i przechowywać w temperaturze -80 °C. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić podwielokrotności w temperaturze 37 °C.

5. Brzuszne śródmózgowie i rozwarstwienie rdzenia kręgowego

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki z wyjątkiem kroków 5.1.1−5.1.3 i 5.1.5−5.1.6 pod stereomikroskopem fluorescencyjnym. Całkowity czas sekcji na eksperyment wynosi zwykle 3-5 godzin, w zależności od biegłości w technice sekcji i liczby neuronów ruchowych wymaganych w każdym eksperymencie.

  1. Rozwarstwienie śródmózgowia brzusznego
    1. Poddaj ciężarnej myszy eutanazji około 11,5 dnia po zapłodnieniu przez gazowy dwutlenek węgla i zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Dokładnie spryskaj brzuch etanolem i usuń macicę za pomocą sterylnych nożyczek do mikropreparacji i kleszczy opatrunkowych na kciuki. Umyj macicę krótko w sterylnym PBS, a następnie przenieś na płytkę separacyjną wypełnioną wstępnie schłodzonym sterylnym PBS.
    3. Ostrożnie usuń zarodki IslMN: GFP z macicy za pomocą sterylnych nożyczek do mikroanaliz, kleszczy do opatrunku kciuka i pęsety Dumont #5 w lodowatym sterylnym PBS w jasnym świetle mikroskopu. Używając sterylnej mini-perforowanej łyżki Moria, przenieś każdy zarodek do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce wypełnionej wstępnie schłodzonym podłożem Hibernate-E o niskiej fluorescencji uzupełnionym 1x B27. Trzymaj płytkę 24-dołkową na lodzie.
    4. Przenieś jeden zarodek na sterylną płytkę preparacyjną i przykryj go całkowicie lodowatym sterylnym roztworem soli Hanka (HBSS).
    5. Upewnij się, że etapy preparacji są wykonywane przy oświetleniu mikroskopu izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Za pomocą pęsety usuń ogon i twarz zarodka, nie uszkadzając śródmózgowia (Ryc. 2Ba). Umieść zarodek na brzuchu z kończynami okrakiem pod spodem i ogonem skierowanym w stronę przodu mikroskopu, w kierunku sekcji (oznaczonej gwiazdką, Ryc. 2Bb).
    6. Za pomocą pęsety rozetnij dach czwartej komory, aby wytworzyć mały otwór. Użyj tego otworu, aby zaczepić pęsetę w przestrzeni utworzonej między czwartą komorą a jej dachem. Rozkrój wzdłuż grzbietowej powierzchni zarodka rostralnego do kory i bocznie do płyty podłogowej i kolumny motorycznej (Rysunek 2Ca,b). Otwórz wypreparowaną tkankę w sposób otwarty, aby odsłonić jądra CN3 i CN4 GFP-dodatnie.
      nuta: Mały fragment tkanki z brzusznego śródmózgowia zawierający mezenchymę, CN3 i CN4 zostanie teraz odsłonięty.
    7. Ostrożnie oddziel brzuszną śródmózgowie od zarodka i usuń tkankę oponową za pomocą pęsety i noża do mikropreparacji. Wypreparuj obustronne jądra CN3 i CN4 GFP-dodatnie z dala od płytki podłogowej i innych otaczających tkanek GFP-ujemnych za pomocą pęsety i noża do mikropreparowania (Rysunek 2D). Zmaksymalizuj liczbę neuronów ruchowych GFP-dodatnich w wyciętej tkance, ale unikaj ich dotykania lub uszkadzania.
    8. Jeśli pożądany jest zbiór oddzielnych jąder CN3 i CN4, przeciąć wzdłuż linii środkowej tych dwóch jąder (żółta przerywana linia w Rysunek 2D). Za pomocą pipety P1000 zebrać wypreparowaną brzuszną tkankę śródmózgowia z minimalnym HBSS i umieścić ją w oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml wypełnionej pożywką do preparowania (patrz krok 4.1.5). Przechowywać na lodzie do momentu dysocjacji.
    9. Kontynuuj łączenie brzusznej części śródmózgowia z dodatkowych zarodków w tej samej probówce, aż całkowita liczba spełni wymagania eksperymentalne (patrz krok 8, aby uzyskać informacje na temat idealnej liczby komórek).
      nuta: Zaleca się zebranie co najmniej 10 brzusznych śródmózgowia dających około 1 x 104 neuronów ruchowych CN3 / CN4, ponieważ tkanki są narażone na stres podczas dysocjacji i sortowania.
  2. Rozwarstwienie brzusznego rdzenia kręgowego
    1. Trzymaj zarodek w pozycji leżącej z głową skierowaną do przodu mikroskopu, w kierunku dysektorium. Przytrzymaj zarodek jedną parą pęsety i włóż końcówkę drugiej pary pęsety do nieotwartej ogonowej części czwartej komory.
    2. Otwórz resztę tyłomózgowia i rdzeń kręgowy grzbietowo na całej długości ogonowej zarodka. Otwórz przez przecięcie tkanki grzbietowej, zaczynając od czwartej komory i kierując się w stronę kanału centralnego ogonowego rdzenia kręgowego, używając kleszczy jako nożyczek (Rysunek 2Ca,b). Uważaj, aby podczas tego zabiegu nie dotykać ani nie uszkodzić brzusznego rdzenia kręgowego.
    3. Przytrzymaj zarodek jedną parą pęsety i ściśnij płatek tkanki grzbietowej z każdej strony drugą parą pęsety (Rysunek 2Ea,b).
      nuta: Wycięte tkanki grzbietowe zawierają skórę grzbietową, mezenchymę, zwoje korzenia grzbietowego (DRG), grzbietowe tyłomózgowie i rdzeń kręgowy. Usuń jak najwięcej tych tkanek bez uszkadzania jąder SMN, ponieważ są one adhezyjne i mogą zatrzymywać SMN podczas filtrowania lub powodować zatykanie podczas sortowania FACS.
    4. Usuń brzuszny rdzeń kręgowy za pomocą noża do mikrodysekcji, aby przebić się bezpośrednio pod GFP-dodatnim SMN. Podnieś brzuszny rdzeń kręgowy ruchami przypominającymi piłę po obu stronach (Rysunek 2Fa,b). Przeciąć pływający brzuszny rdzeń kręgowy poprzecznie bezpośrednio nad C1, gdzie wystaje pierwszy przedni róg GFP-dodatni (Ryc. 2G). Również przeciąć poprzecznie na górnej granicy kończyny dolnej (Rysunek 2G). Po tym zabiegu należy usunąć część szyjno-lędźwiową (L2-L3) brzusznego rdzenia kręgowego.
    5. Umieść brzuszny rdzeń kręgowy grzbietową stroną do góry i przytrzymaj, naciskając tkankę GFP-ujemną między kolumnami GFP-dodatniego SMN za pomocą jednej pary pęsety. Usuń pozostałą przyczepioną mezenchymę, DRG i grzbietowy rdzeń kręgowy, przycinając obie strony kolumny SMN GFP-dodatniej nożem do mikrodysekcji (Rysunek 2H). Zadbaj o to, aby zmaksymalizować neurony ruchowe GFP-dodatnie bez ich uszkadzania.
    6. Za pomocą pipety P1000 zebrać wypreparowaną tkankę brzusznego rdzenia kręgowego z minimalnym HBSS i umieścić w znakowanej SMN probówce do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml wypełnionej pożywką do preparacji. Przechowywać na lodzie do momentu dysocjacji. Kontynuuj łączenie brzusznych rdzeni kręgowych z dodatkowych zarodków w tej samej probówce, aż całkowita liczba spełni wymagania doświadczalne.
      nuta: Zaleca się pobranie co najmniej trzech brzusznych rdzeni kręgowych o wartości około 2,1 x10 4 SMN, ponieważ tkanki są narażone na stres podczas dysocjacji i sortowania.
    7. Zbierz neurony ruchowe twarzy i kończyny zarodków myszy IslMN: GFP jako kontrole GFP-dodatnie i GFP-ujemne odpowiednio do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Kończyny są GFP-ujemne, ponieważ aksony GFP-dodatnie SMN nie rozszerzyły się jeszcze na kończyny w tym wieku embrionalnym.

6. Dysocjacja tkanek

UWAGA: Całkowity czas dysocjacji wynosi zazwyczaj 1,5 godziny na eksperyment.

  1. Ciepły roztwór papainy i inhibitora albuminy i owomukoidu podsycić do 37 °C 30 minut przed dysocjacją.
  2. Krótko odwiruj mikrowypreparowane tkanki z małą prędkością.
  3. Za pomocą pipety P100 ostrożnie usuń jak najwięcej Hibernate E bez zasysania tkanek.
    nuta: Pamiętaj, aby usunąć wszystkie pozostałości Hibernate E po tym kroku, aby uniknąć zmniejszenia skuteczności dysocjacji papainy w następnym kroku.
  4. Dodać odpowiednią objętość roztworu papainy (Tabela 1) do każdej z 1,7 ml probówek do mikrowirówek zawierających mikrowycięte próbki tkanek.
    nuta: Określono odpowiednią objętość papainy do dysocjacji, aby zmaksymalizować efektywną dysocjację przy jednoczesnej minimalizacji stresu na komórkach.
  5. Delikatnie rozetrzeć 8x pipetą P200. Wykonaj wszystkie kroki rozcierania delikatnie, aby zachować żywotność neuronów ruchowych.
  6. Inkubować probówki zawierające tkanki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, mieszając przez przesuwanie palcem 10 razy co 10 minut. Po inkubacji delikatnie rozetrzeć każdą zawiesinę 8 razy pipetą P200. Wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut.
  7. Aby zapewnić skuteczność hamowania jaju w następnym kroku, użyj pipety P1000, aby usunąć i wyrzucić jak najwięcej supernatantu bez zasysania tkanek.
  8. Zawiesić osady w odpowiedniej objętości roztworu inhibitora albuminy i owomukooidów (Tabela 1), delikatnie rozcierając 8x pipetą P200.
  9. Odczekaj 2 minuty, aby pozostałe kawałki niezdysocjowanej tkanki osiadły na dnie probówki.
  10. Zebrać jak najwięcej supernatantu bez zasysania niezdysocjowanych tkanek za pomocą pipety P200. Przenieść supernatant do świeżych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
  11. Jeśli niektóre fragmenty tkanki pozostaną niezdysocjowane po kroku 6.10, powtórz kroki 6.8−6.10 dla niezdysocjowanych tkanek, które pozostają w oryginalnych probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,7 ml, aby zmaksymalizować końcową wydajność zdysocjowanych komórek, jednocześnie minimalizując stres na komórkach zdysocjowanych wcześniej, zawartych w supernatancie kroku 6.10.
  12. Wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety P1000.
  13. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki rozwarstwiającej (Tabela 1), pipetując 8x za pomocą pipety P1000. Odpowiednią objętość zawiesiny końcowej określono tak, aby gęstość komórek nie przekraczała 107 komórek/ml, co może blokować strumień cytometrii przepływowej, ale także aby komórki nie były nadmiernie rozcieńczane, co skutkuje spowolnieniem prędkości sortowania.
  14. Przefiltruj zawiesiny przez sitka komórkowe o wielkości 70 μm, aby wyeliminować wszelkie duże grudki lub niestrawioną tkankę. Przenieść zawiesiny do probówek z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie do momentu, gdy będą potrzebne.

7. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany przy użyciu sortera FACS wyposażonego w fioletowy laser 15 mw 405 nm, niebieski laser 100 mw 488 nm, pomarańczowy laser 75 mw 594 nm i czerwony laser 40 mw 640 nm. Komórki posortowano jako płyn osłonkowy w sterylnym PBS w warunkach aseptycznych przez dyszę 100 μm. W celu zminimalizowania stresu komórkowego, natężenie przepływu ustawiono na ciśnienie próbki 1−3, tak aby uzyskano maksymalnie 1000−4000 zdarzeń na sekundę. Całkowity czas FACS wynosi zwykle 1-2 godziny na eksperyment.

  1. Ustaw napięcia dla rozproszenia do przodu i bocznego, aby można było prawidłowo zobrazować populację komórek. Ustawienie odpowiednich napięć do sortowania ogniw jest skomplikowane i wymaga doświadczonego operatora FACS.
  2. Aby rozróżnić różne populacje komórek, należy wykreślić komórki na podstawie rozmiaru określonego przez obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) w porównaniu ze złożonością wewnętrzną określoną przez obszar rozproszenia bocznego (SSC-A). Narysuj bramkę wokół żywych komórek, jak pokazano w Rysunek 3Aa i Rysunek Ba, aby wykluczyć szczątki i martwe komórki. Pogrupuj komórki w regionie bramkowanym jako populację 1 (P1).
  3. Aby wykluczyć skupiska komórek i dublety, wykreśl komórki P1 następnie na podstawie szerokości rozproszenia bocznego (SSC-W) w porównaniu z SSC-A. Bramka populacji pojedynczych komórek jako populacja 2 (P2) (Rysunek 3Ab i Rysunek Bb).
  4. Wykreśl komórki P2 na podstawie szerokości rozproszenia do przodu (FSC-W) w porównaniu z FSC-A i przeprowadź populację pojedynczych komórek jako populację 3 (P3) (Rysunek 3Ac i rysunek Bc).
    UWAGA: Użycie dwóch kolejnych bramek w 7.3 i 7.4 wyklucza zagęszczenia komórek i dublety (wysoki FSC-W i wysoki FSC-A).
  5. Komórki bramki P3 oparte na GFP kontra allofikocyjanina (APC). Kanał APC wykrywa autofluorescencję. Bramkowanie na tym kanale pozwala uniknąć wychwytywania komórek autofluorescencyjnych. Użyj ogniw GFP-ujemnych, aby dostosować napięcie dla kanałów fluorescencyjnych FITC/GFP. Idealnie, umieść bramki dla tych populacji komórek około 102. Wybierz progi bramki dla populacji GFP-dodatniej 4 (P4) indywidualnie dla każdego typu neuronu ruchowego (Rysunek 3Ad i Rysunek Bd).
    nuta: Ustaw bramkę GFP znacznie wyżej dla SMN niż dla CN3s/CN4s, aby uzyskać czystą kulturę (Rysunek 3Ad i Rysunek Bd). Dolna bramka GFP dla kultur SMN prowadzi do zanieczyszczenia kultur przez neurony glejowe i nieruchowe. Jest to prawdopodobne, ponieważ w niektórych neuronach glejowych i nieruchowych występuje niski poziom ekspresji GFP z powodu nieszczelnego promotora. Odsetek komórek GFP-dodatnich w porównaniu z komórkami ogółem wynosi zwykle 0,5-1,5% dla CN3 / CN4 i 1,5-2,5% dla SMN. Jeśli sekcja zakończyła się sukcesem, liczby te można wykorzystać jako punkt odniesienia do określenia właściwej pozycji dla bramki GFP-dodatniej (Rysunek 3Ae i Rysunek Be).
  6. Wykonaj FACS zgodnie z protokołem producenta. Zbierz komórki P4 do świeżych probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,7 ml wypełnionych 500 μl pożywki do hodowli neuronów ruchowych. Przechowywać na lodzie do momentu poszycia.
    nuta: Chociaż komórki można sortować bezpośrednio do studzienek, powoduje to nieparzystą liczbę komórek na studzienkę. Posortuj komórki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,75 ml, a następnie ręcznie płytkuj, aby uzyskać bardziej równomierny rozkład posiewu.

8. Kultura oczyszczonych pierwotnych neuronów ruchowych

  1. Rozcieńczone zawiesiny CN3/CN4 i SMN izolowane metodą FACS za pomocą pożywki do hodowli neuronów ruchowych podgrzanej do 37 °C do gęstości odpowiednio 5 x 103 i 1 x 104 komórek/ml.
    nuta: Jeden zarodek E11.5 daje około 1 x 103 CN3 / CN4 i 7 x 103 SMN. Jednak plony te zależą w dużej mierze od czystości wypreparowanych tkanek, dokładności dysocjacji komórek i odpowiedniego progowania bramek GFP podczas FACS.
  2. Przenieść 96 płytek dołkowych wstępnie pokrytych PDL i lamininą z inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C do okapu z przepływem laminarnym i odessać lamininę z każdej studzienki. Płytki i szkiełka nakrywkowe należy zużywać natychmiast bez mycia.
  3. Dodać 200 μl rozcieńczonych zawiesin CN3/CN4 i SMN do każdej studzienki 96-dołkowych płytek pokrytych PDL/lamininą. Końcowe zagęszczenie komórek powinno wynosić 1 x 103 i 2 x 103 komórki/studzienkę odpowiednio dla CN3/CN4 i SMN.
    nuta: Początkowa gęstość posiewu SMN w 96 dołkach (2 x 103 komórki / dołek) jest dwukrotnie większa niż CN3s / CN4 (1 x 103 komórki / dołek) w celu uzyskania podobnej końcowej liczby i gęstości neuronów ruchowych po 2 i 9 dniach in vitro (DIV) (4−6 x 102 i 2−4 x 102 komórki na studzienkę, odpowiednio).
  4. Hodowla neuronów w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Karmić neurony co 5 dni, usuwając połowę starej pożywki (100 μl) i zastępując ją taką samą objętością świeżej pożywki hodowlanej neuronów ruchowych. Upewnij się, że procesy neuronalne stają się widoczne na 1 DIV i stają się grubsze i dłuższe o 14 DIV (Rysunek 4). Ciała komórek nerwowych stają się powiększone i mają tendencję do agregacji w długotrwałych hodowlach, szczególnie w przypadku SMN (Rysunek 4).
    nuta: Wykonaj wszystkie zmiany pożywki i roztworu, pozostawiając połowę pierwotnej objętości pożywki, aby uniknąć oderwania hodowanych komórek. Obejmuje to etapy fiksacji i immunocytochemii (ICC). Jeśli wszystkie media zostaną usunięte, niezależnie od tego, jak delikatnie, większość komórek oderwie się i zostanie zmyta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszego protokołu było wysokiej jakości oczyszczenie i długoterminowa hodowla zarówno pierwotnych neuronów CN3/CN4, jak i SMN, aby umożliwić analizy porównawcze mechanizmów leżących u podstaw schorzeń neuronów ruchowych (przegląd przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2).

Po pomyślnej izolacji i wyhodowaniu neuronów w kulturze uzyskano niemal czyste kultury pier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Historycznie rzecz biorąc, badania in vitro neuronów ruchowych CN3 i/lub CN4 opierały się na heterogenicznych kulturach, takich jak zdysocjowane 17,18,19,20,21, eksplantat 17,22,23,24,25,26 i plaster

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) za instrukcje dotyczące technik preparacji SMN; Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, Immunologia Division Flow Cytometry Facility of Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core oraz Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility za izolację FACS pierwotnych neuronów ruchowych; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, dodatkowi członkowie laboratorium Engle oraz członkowie konsorcjum Projektu ALS za pomoc techniczną i przemyślaną dyskusję. Badanie to było wspierane przez Project ALS. Ponadto R.F. został sfinansowany przez Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad oraz grant szkoleniowy NIH w zakresie genetyki T32 GM007748; J.J. był wspierany przez program szkoleniowy NIH/NEI w zakresie molekularnych podstaw chorób oczu (5T32EY007145-16) za pośrednictwem Schepens Eye Research Institute oraz przez Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) przez Boston Children's Hospital; MCW był wspierany przez NEI (5K08EY027850) i Children's Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); E.C.E. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488-sprzężony kozioł anty-mysi IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-sprzężony F(ab')2 kozia anty-królicza IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Suplement (50x), bez surowicyThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP Cytometr przepływowyBD Bioscience- Posiada 4 systemy laserowe wyposażone w lasery 405, 488, 594 i 640 nm.
BD Falcon 70μ m Nylonowe sitka komórkoweCORNING352350Do filtrowania komórek dysocjujących przed FACS.
Probówki BD Falcon z okrągłym dnem i zatrzaskiemCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 dołków, PS, dno F (studnia kominowa)Greiner Bio-One International655090Próbowaliśmy wielu naczyń 96-dołkowych i to była najlepsza do hodowli i analiz po
okrągłych szkłach nakrywkowych ICC do mikroskopiiKarl Hecht & Assistent1001/14Użyliśmy tego szkiełka nakrywkowego, ponieważ powierzchnia była duża (średnica: 14 mm).
CNTF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Sp. z o.o.CYT-272
Kwas cyklopiazonowy z Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA. Jeden ze stresorów ER.
4&,6-diamidino-2-fenylonolol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 Kleszcze Inox Rozmiar końcówki 0,05 mm x 0,01 mm Porady biologiczneInstrument chirurgiczny RobozRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Sp. z o.o.CYT-305
GlutaMAX suplementThermo Fisher Scientific35050-061
Hanks' Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E niska fluorescencjaBrainBitsHELFFluorescencja, która utrudnia obserwację ekspresji GFP zarodka, powinna być niska.
Surowica końska, inaktywowana termicznie, pochodzenia nowozelandzkiegoThermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Izobutylometyloksantyna
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz' s L15 średniThermo Fisher Scientific11415064
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
Mikro nożyczki preparacyjneRoboz Instrument chirurgicznyRS-5913
Mikronóż 4,75 "ostrze 1,7 mm x 27 mmRoboz Instrument chirurgicznyRS-6272
Moria Mini perforowana łyżkaFine Science Tools10370-19
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko neuronalnej klasie III i beta;-tubulinie (TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Mikroskop fluorescencyjny żywych komórek Nikon Perfect Focus Eclipse Ti i oprogramowanie Elementskontrastowe interferencyjne różnicowe firmy Nikon i obrazy immunocytochemiczne kultur komórkowych zostały zarejestrowane za pomocą tych urządzeń:
Kwas azotowy 90%, dymiący (certyfikowany ACS)Fisher ScientificA202-212Do płukania szkiełek nakrywkowych
Olympus 1,7 ml mikroprobówki, przezroczysteGenesee Scientific22-281Są to probówki, które opisaliśmy w kontekście "probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml".
System dysocjacji papainyWorthington Biochemical CorpLK003150Z tego zestawu przygotowuje się roztwór papainy i roztwór inhibitora alubumin-ovomucoid.
Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly D-lizyna (PDL)MiliporeSigmaA-003-E
Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko Islet1Abcamab1095171:200
SMZ18 i SMZ1500 mikroskopy stereoskopowe z zoomem DS-Ri1 Wykonano dysekcję aparatu Nikon i uchwycono obrazy wypreparowanych zarodków i tkanek pod tymi mikroskopami fluorescencyjnymi.
Sylgard 170 silikonowa kapsułka - A+B 0,9 kg zestawDow Corning1696157Za pomocą tego zestawu wykonujemy naczynia preparacyjne
Naczynia poddane obróbce TC, 100 mm x 20 mmGenesee Scientific25-202Za pomocą tego naczynia wykonujemy naczynia rozwarstwiające.
Kleszcze opatrunkowe Thum 4,5 "ząbkowane 2,2 mm szerokości końcówkiRoboz Instrument chirurgicznyRS-8100
Przetwornik do LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSDo ultrasonografii u samic myszy
Ultrasonograf weterynaryjnyGE HealthcareLOGOQ e VETDo ultrasonografii u samic myszy
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Zeiss serii LSM 700 i oprogramowanie ZenCarl Zeiss-Konfokalny obraz zarodka został uchwycony za pomocą tych urządzeń
Obrazy .

Bibliografia

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
  3. Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
  6. Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
  7. Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
  8. Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
  9. Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
  10. Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
  11. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  12. Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763(2015).
  13. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  14. Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  17. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  18. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  19. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  20. Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
  21. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
  22. Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
  23. Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  24. Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
  25. Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
  26. Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
  27. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  28. Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911(2019).
  29. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
  30. Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
  31. An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423(2019).
  32. Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
  33. Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
  34. Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
  35. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  36. Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  37. Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
  38. Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
  39. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurony okulorukiemneurony bloczkowemyszy Isl1 GFPizolacja kom rek metod FACSsekcja tkanekhodowla pierwotna neuron woczyszczanie neuron w ruchowych115 dzie embrionalnykom rki GFP dodatnie
Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.