Artykuł metodologiczny

Zwiększenie trwałości zdysocjowanych kultur komórek nerwowych z wykorzystaniem biologicznie aktywnej matrycy koralowej

DOI:

10.3791/60443

⸱

3 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdysocjowana hodowla komórek hipokampa jest kluczowym narzędziem eksperymentalnym w neurobiologii. Przeżycie i funkcja komórek nerwowych w hodowli jest zwiększona, gdy szkielety koralowców są używane jako matryce, ze względu na ich rolę neuroprotekcyjną i neuromodulacyjną. W związku z tym komórki nerwowe hodowane na macierzy koralowej wykazują większą trwałość, a tym samym są bardziej odpowiednie do hodowli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kultury dysocjowanych komórek neuronalnych i glejowych hipokampa są cennym modelem eksperymentalnym do badania wzrostu i funkcji neuronów, zapewniając wysoką izolację komórek i kontrolowane środowisko. Jednak przetrwanie komórek hipokampa in vitro jest zagrożone: większość komórek umiera w ciągu pierwszego tygodnia hodowli. Dlatego tak ważne jest zidentyfikowanie sposobów na zwiększenie trwałości komórek nerwowych w hodowli.

Węglan wapnia w postaci krystalicznego aragonitu pochodzącego ze szkieletu koralowców może być używany jako nadrzędna, aktywna matryca dla kultur neuronalnych. Pielęgnując, chroniąc i aktywując komórki glejowe, szkielet koralowca zwiększa przeżywalność i wzrost tych komórek in vitro lepiej niż inne matryce.

Ten protokół opisuje metodę hodowli komórek hipokampa na matrycy koralowej. Matryca ta jest generowana przez przyczepienie ziaren szkieletów koralowców do naczyń hodowlanych, kolb i szklanych szkiełek nakrywkowych. Ziarna pomagają w poprawie środowiska komórek, wprowadzając je do delikatnego trójwymiarowego (3D) środowiska, aby rosły i tworzyły struktury przypominające tkanki. Środowisko 3D wprowadzone przez szkielet koralowca można zoptymalizować dla komórek poprzez mielenie, co umożliwia kontrolę nad wielkością i gęstością ziaren (tj. chropowatością matrycy), właściwością, która, jak stwierdzono, wpływa na aktywność komórek glejowych. Co więcej, zastosowanie ziaren ułatwia obserwację i analizę kultur, zwłaszcza przy użyciu mikroskopii świetlnej. W związku z tym protokół zawiera procedury generowania i optymalizacji macierzy koralowej jako narzędzia poprawiającego utrzymanie i funkcjonalność komórek nerwowych in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kultury zdysocjowanych komórek nerwowych, w tym przypadku komórek hipokampa, są cennym modelem eksperymentalnym do badania wzrostu i funkcji neuronów, zapewniając wysoką izolację i dostępność komórek1,2,3. Ten typ hodowli jest często używany w neurobiologii, opracowywaniu leków i inżynierii tkankowej ze względu na dużą ilość informacji, które można zebrać, takich jak tempo wzrostu i żywotności, neurotoksyczność, wzrost i sieć neurytów, łączność synaptyczna i plastyczność, modyfikacje morfologiczne, organizacja i okablowanie neurytów itp.1,4,5,6, 7.

Pomimo znaczenia kultur, hodowane komórki są zazwyczaj zmuszane do wzrostu na szklanych szkiełkach nakrywkowych w dwuwymiarowej monowarstwie. Te rygorystyczne modyfikacje środowiskowe znacznie zmniejszają zdolność komórek nerwowych do przetrwania w czasie, ponieważ szklane szkiełka nakrywkowe są substratami niepielęgnującymi o niskiej sile adhezji, wykazującymi mniejszą zdolność do wspierania wzrostu komórek8,9,10,11.

Ponieważ hodowane komórki nerwowe są zmuszone do wzrostu w trudnych warunkach, podstawowym podejściem do zwiększenia ich przetrwania byłoby naśladowanie ich naturalnego środowiska tak bardzo, jak to możliwe12,13. Można to osiągnąć poprzez zastosowanie biomateriałów, które będą działać jak matryce i naśladować macierz zewnątrzkomórkową komórek, umożliwiając im tworzenie struktury przypominającej tkankę i pomagając w ich odżywianiu14.

Wykorzystanie biomateriałów jest obiecującym podejściem do ulepszania kultur komórkowych, ponieważ działają one jak biokompatybilne rusztowania, zapewniając stabilność mechaniczną i poprawiając różnorodność właściwości komórek, w tym adhezję, przeżycie, proliferację, migrację, morfogenezę i różnicowanie15,16,17. W celu poprawy warunków życia komórek in vitro stosuje się kilka rodzajów biomateriałów. Wśród nich są biopolimery, czyli składniki biologiczne, które zwykle są częścią macierzy zewnątrzkomórkowej komórek. Te biomateriały są najczęściej używane jako forma polimeryzowanych środków powlekających lub hydrożeli18,19,20. Z jednej strony, wspomniane powyżej matryce dają komórkom znajome środowisko 3D, w którym mogą rosnąć, zachęcają do ich przylegania do naczynia i zapewniają im mechaniczne wsparcie21,22. Z drugiej strony, ich spolimeryzowana forma i uwięzienie komórek w hydrożelach zaburza dostęp komórek do składników pielęgnacyjnych obecnych w pożywce wzrostowej, a także utrudnia śledzenie komórek metodami mikroskopowymi23.

Egzoszkielety koralowców to biologiczne matryce pochodzenia morskiego. Wykonane są z węglanu wapnia, mają stabilność mechaniczną i są biodegradowalne. Wcześniejsze badania wykorzystujące szkielet koralowca jako matrycę do hodowli komórek nerwowych w hodowli wykazały znacznie większą przyczepność w porównaniu ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi24,25. Ponadto komórki nerwowe wyhodowane na szkielecie koralowca wykazały zdolność do pobierania wapnia, z którego składa się szkielet, który chroni komórki nerwowe w warunkach niedoboru składników odżywczych26. Co więcej, szkielet koralowca jest wspierającą i pielęgnującą matrycą, która zwiększa przeżywalność komórek nerwowych, zachęca do tworzenia sieci neuronowych, podnosi szybkość połączeń synaptycznych i umożliwia tworzenie struktur podobnych do tkanek27,28. Ostatnie badania wykazały również, że topografia powierzchni macierzy szkieletu koralowca odgrywa kluczową rolę w dystrybucji i aktywacji komórek glejowych8,29. Szkielet koralowca jest również skuteczny jako matryca do hodowli innych typów komórek, takich jak osteocyty30,31, hepatocyty i kardiomiocyty w hodowli (dane niepublikowane).

Stąd szkielet koralowca jest obiecującą matrycą do hodowli komórek in vitro. Tak więc protokół szczegółowo opisany poniżej opisuje technikę hodowli komórek nerwowych na szkielecie koralowca w celu wytworzenia bardziej stabilnych i dobrze prosperujących kultur nerwowych niż te osiągnięte istniejącymi metodami. Protokół ten może być również przydatny do hodowli kardiomiocytów, hepatocytów i innych typów komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt w tym protokole zostało zatwierdzone przez Krajową Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania.

UWAGA: Szkielety koralowców z węglanu wapnia powinny być używane w krystalicznej formie aragonitu. Typy koralowców testowane do tej pory pod kątem kultur nerwowych to Porites Lutea, Stylophora Pylillata i Trachyphyllia Geoffroyi. Szkielety można kupić w całości lub na ziemi.

1. Czyszczenie fragmentów szkieletu koralowca

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane w kapturze chemicznym w temperaturze pokojowej, ponieważ opisane poniżej roztwory są niebezpieczne i mogą powodować oparzenia i podrażnienia.

  1. Za pomocą młotka rozbij szkielet koralowca i podziel go na 0,5–2 cm fragmenty. W celu rozpuszczenia pozostałości organicznych i nieorganicznych należy namoczyć fragmenty szkieletu koralowca w 10% roztworze podchlorynu sodu na 10 minut, a następnie przemyć raz wodą podwójnie destylowaną (DDW).
  2. Aby usunąć pozostałe pozostałości organiczne, namocz fragmenty w 1M roztworze NaOH na 5 minut, a następnie przemyj raz DDW. Kontynuuj usuwanie osadów organicznych, mocząc fragmenty w 30% roztworzeH2O2przez 10 min, a następnie przemyj fragmenty 3x DDW.
  3. Usuń jak najwięcej DDW i pozostaw fragmenty koralowca w kapturze do wyschnięcia (1–8 godzin).

2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych

  1. Przenieść szkiełka nakrywkowe na szklaną szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Dodaj 10 ml 95% etanolu przez 15 minut.
  2. Usuń etanol i umyj DDW 3x, odczekując 10 minut między każdym myciem. Umieść naczynie na wstępnie podgrzanej płycie grzewczej o temperaturze 80 °C, aż DDW odparuje. Podczas suszenia delikatnie wymieszaj szkiełka nakrywkowe w talerzu, aby nie sklejały się ze sobą.
  3. Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie.

3. Przygotowanie ziaren szkieletu koralowca

  1. Fragmenty szkieletu koralowca zmielić za pomocą moździerza i tłuczka (mielenie ręczne) aż do całkowitego rozpadu. Rezultatem jest mieszanina ziaren o rozmiarach od 20 μm do 200 μm.
  2. Alternatywnie mielej fragmenty szkieletu koralowca za pomocą szlifierki elektrycznej z prędkością 1,000 obr./min przez 30 s (długość ostrza = 6 cm; szerokość = 0,5 cm–1,0 cm). Uzyskany rozmiar ziarna jest podobny do zakresu wielkości wytwarzanego przez mielenie ręczne.

4. Oczyszczanie ziaren o określonym zakresie wielkości

UWAGA: Jeśli pożądana jest kontrola nad wielkością ziaren w matrycy, użyj następującej procedury oczyszczania ziarna opartej na filtracji.

  1. Przenieś ziarna na ręczne lub elektryczne sitko filtracyjne o wielkości 40 μm.
  2. Podziel ziarna na dwa określone zakresy, przesiewając ziarna przez sitko (w przypadku korzystania z sitka elektrycznego zalecane są następujące warunki: wstrząsanie = 600 amplitud/min, odbijanie = 6/s). W wyniku tej procedury uzyskuje się dwie grupy wielkości ziaren, jedną <40 μm, a drugą >40 μm.
    UWAGA: Te dwa rozmiary można określić za pomocą filtrów siatkowych o różnych oczkach. Jeśli pożądany jest bardziej ograniczony zakres, należy ponownie przesiać każdą grupę z kroku 4.2 przez sitka o różnych oczkach.
  3. Ziarna należy sterylizować w autoklawie.

5. Przygotowanie potraw pokrytych ziarnem koralowym lub szkiełek nakrywkowych

  1. Do powlekania kolb, płytek lub szalek Petriego
    UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać w sterylnych warunkach.
    1. Dodaj ziarna szkieletu koralowca do roztworu poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 20 μg/ml rozpuszczonego w roztworze Hanksa. Zalecane stężenie wynosi 5 mg/10 mg ziaren na 1 ml roztworu PDL.
    2. Wlać roztwór do kolb i szalek (około 2 ml/25cm2) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Ziarna opadają i przyczepiają się do dna.
    3. Następnego dnia umyj kolby i naczynia raz sterylnym DDW. Pozostaw kolby i naczynia do wyschnięcia w okapie.
      UWAGA: Zaleca się używanie świeżo pokrytych kolb i szalisków. Powlekane kolby i szalki mogą być używane do tygodnia po powlekaniu, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Jednak skuteczność matrycy może być zagrożona.
  2. Szkiełka nakrywkowe z powłoką (średnica 12 mm, grubość 0,17 mm)
    1. Dodaj ziarna szkieletu koralowca do DDW w dowolnym stężeniu. Typowe gęstości stosowane w komórkach nerwowych to 5 mg/ml i 10 mg/ml. Wlej 40 μl roztworu ziarnistego na środek szkiełka nakrywkowego (Rysunek 4).
    2. Umieścić szkiełka nakrywkowe na płycie grzewczej podgrzanej do temperatury 80 °C i poczekać na całkowite odparowanie (zwykle 15 minut). W tych warunkach ziarna przylegają do szkiełka nakrywkowego. Powlekane szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie. Przechowywać w sterylnych warunkach.
    3. Dzień przed posiewem umieść szkiełka nakrywkowe na pokrywce sterylnej płytki 24-dołkowej. Dodać 100 μl roztworu PDL o stężeniu 20 μg/ml do każdego szkiełka nakrywkowego. Użyj końcówki, aby upewnić się, że płyn pokrywa cały obszar ziarna i resztę powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    4. Przykryj pokrywkę dnem talerza. Owiń boki talerzy folią parafinową. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Następnego dnia umyj raz DDW i wysusz w kapturze.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie świeżo powlekanych szkiełek nakrywkowych.

6. Hodowla zdysocjowanych komórek hipokampa na szkiełkach nakrywkowych pokrytych ziarnami koralowców

UWAGA: Metoda hodowli komórek dysocjacyjnych w hipokampie została zmodyfikowana w stosunku do wcześniej opublikowanych procedur24,27. Przygotowanie kultury opisano dla czterech szczeniąt szczurów. Oczekiwany plon z każdego hipokampa wynosi 1–1,5 x 106 komórek.

  1. Instalacji
    1. Przygotuj pustą szalkę Petriego o średnicy 60 mm. Wlać 2 ml minimalnej pożywki (MEM) do szalki Petriego o średnicy 60 mm i wyłożyć na lód.
    2. Wlać 2 ml MEM do naczynia o średnicy 35 mm i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5–10% CO2 . Wlać 2 ml MEM do probówki o pojemności 15 ml i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    3. Wlać 1 ml pożywki pierwszego dnia do probówki o pojemności 15 ml i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5-10% CO2,
      UWAGA: Skład pożywki pierwszego dnia opisany jest w Tabeli Materiałów.
    4. Rozmrozić 200 μl 2,5% roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C.
    5. Przygotuj trzy szklane pipety Pasteura z głowicami o średnicy 0,5 mm, 0,75 mm i 1,0 mm za pomocą płomienia.
    6. Przygotuj odpowiednie narzędzia chirurgiczne: jedne duże nożyczki, dwie małe nożyczki, jedną dużą pęsetę, cztery małe pęsety i jeden skalpel.
    7. Przygotuj mikroskop stereoskopowy w kapturze.
  2. Używając dużych nożyczek, złóż w ofierze 0-3-dniowe młode szczura Sprague Dawley, oddzielając ich głowy od ciała na pustej szalce Petriego o średnicy 60 mm (krok 6.1.1). Pozbądź się ciał.
  3. Podnieś głowę, trzymając ją z ust dużą pęsetą. Przetnij skórę pokrywającą czaszkę małym nożyczkiem.
  4. Czystymi nożyczkami wejdź pod czaszkę (z boku móżdżku) i przetnij czaszkę w prawo i w lewo, aby umożliwić jej usunięcie. Za pomocą małej pęsety oderwij czaszkę od mózgu.
  5. Za pomocą czystej pęsety oddzielić mózg od głowy i umieścić go na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 2 ml zimnego MEM (patrz krok 6.1.2).
  6. Za pomocą dwóch małych pęset przeanalizuj hipokamp pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieść hipokampy do przygotowanej szalki o średnicy 35 mm (z kroku 6.1.2) zawierającej MEM.
    UWAGA: Kroki 6.3–6.6 należy powtórzyć dla każdego szczeniaka.
  7. Pokrój hipokamp na plastry o grubości około 1 mm za pomocą skalpela. Dodać 200 μl roztworu trypsyny (rozcieńczonego do końcowego stężenia 0,25%). Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C, 5–10% CO2 przez 30 min.
  8. Po inkubacji dodaj 2 ml zimnego MEM (krok 6.1.2) do naczynia, aby dezaktywować trypsynę. Przenieść trypsynizowaną tkankę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml pożywki pierwszego dnia podgrzanej do temperatury 37 °C (etap 6.1.3) za pomocą szklanej pipety Pasteura o największej średnicy (krok 6.1.5).
    UWAGA: Najlepszy stosunek podłoża do tkanki (v:v) do dalszego przetwarzania tkanki to 1 ml/8 hipokampów. W miarę możliwości należy unikać przenoszenia pożywki z tkanką.
  9. Rozcier tkankę, przepuszczając ją przez szklaną pipetę o największej średnicy 10–15 razy. Następnie powtórz ten proces za pomocą szklanej pipety o średnicy medium. Kontynuuj rozcieranie pipetą o najmniejszej średnicy. Unikaj bulgotania, aby zmniejszyć śmierć komórki.
  10. Pozwól pozostałym kawałkom tkanki zanurzyć się na 2–5 minut, a następnie przenieś supernatant do innej probówki o pojemności 15 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Preferowana gęstość komórek to 200 000–400 000 komórek/ml. Użyj pożywki pierwszego dnia do rozcieńczenia lub odwirowania w temperaturze 470 x g w celu zagęszczenia komórek.
  11. Zasiać 100 μl komórek na każdym szklanym szkiełku nakrywkowym. Podczas wysiewu upewnij się, że całe szkiełko nakrywkowe jest pokryte komórkami. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5–10% CO2 .
  12. Następnego dnia dodaj 500 μl pożywki wzrostu neuronów do studzienek.
    UWAGA: Skład pożywki wzrostu neuronów jest opisany w Tabeli Materiałów.
  13. Delikatnie przenieś każde szkiełko nakrywkowe do odpowiedniego dołka za pomocą pęsety, jednocześnie usuwając pożywkę pierwszego dnia, przechylając szkiełko nakrywkowe. Odessać pozostałe media z pokrywki.
  14. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5–10% CO2 . Unikaj wymiany pożywki przez cały czas inkubacji. Kultury można utrzymywać w tych warunkach do 1 miesiąca. Głównym problemem jest wilgotność. Dlatego upewnij się, że inkubator jest maksymalnie nawilżony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu przygotowania matrycy szkieletu koralowca, cały szkielet koralowca (Rysunek 1A) został rozbity na 0,5–2 cm fragmenty za pomocą młotka (Rysunek 1B) i dokładnie oczyszczony z pozostałości organicznych w trzech krokach (krok 1 w protokole) przy użyciu 10% roztworu podchlorynu, roztworu 1M NaOH i 30% roztworu H2O2 (Rysunek 1C). Fragmenty koralowców zostały dobrze oczyszczone, kiedy kolor szkieletu zmienił się z brązowego (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj technika opisuje sposób na poprawę utrzymania i funkcjonalności komórek nerwowych w hodowli. Osiąga się to poprzez przyleganie komórek do matrycy wykonanej z ziaren szkieletu koralowca, która odżywia komórki i wspomaga ich wzrost i aktywność. Zastosowanie tej techniki zwiększa zdolność modelu hodowli neuronowej do naśladowania środowiska komórek w mózgu.

Wprowadzenie matrycy jako substratu hodowlanego ma kilka zalet w porównaniu z innymi substratami stosowanymi w klasycznyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez program KAMIN izraelskiego Ministerstwa Handlu i Pracy oraz przez Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, US.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 24-dołkoweGreiner#60-662160
B-27Gibco#17504-044
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma#A4503
D – glukozaSigma#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)Sigma#D5796
Sito elektryczneAri Levy#3700
Serun z płodu bydlęcego (FBS)Przemysł biologiczny04-007-1A Pożywka
pierwszego dnia85.1% Minimum Essential Eagle' s medium (MEM), 11,5% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, 1,2% L-glutamina i 2,2% D-glukoza.
KolbyGreiner#60-69016025cm^2, Hodowla tkankowa traktowana
Fluoro-deoksy-urydynaSigma#F0503
Szkiełka nakrywkoweMenzel-Glaser#BNCB00120RA1
H2O2Romical#007130-72-19Niebezpieczna
mieszanka składników odżywczych F-12 szynkiSigma#N4888
Roztwór HANK'SSigma#H6648
Kwas kynureninowySigma#K3375
L - glutaminaSigma#G7513
Sitko ręczne (40µ m)VWR#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)Sigma#M2279
Moździerz i tłuczekDe-Groot4-P090
NaClO (podchloryn sodu)Sigma#425044Niebezpieczne
NaOHSigma#S8045Niebezpieczne
podłożewzrostu neuronów45% MEM, 40% modyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM), 10% mieszanka składników odżywczych szynka F-12, 0,25% (w/v) albumina surowicy bydlęcej (BSA), 0,75% D-glukoza, 0,25% L-glutamina, 0,5% suplement B-27, 0,1% kwas kynureninowy, 0,01% 70% urydyny i 30% fluoro-deoksyurydyna.
szalka PetriegoGreiner#60-628160, #60-627160odpowiednio 60mm, 35mm.
Poly D – LizynaSigma#P7280
Inteligentny młynek do zębinyKometaBio#GR101
TrypsynaGibco#15-090-046
UridineSigma#U3750
#

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32(2015).
  2. Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
  3. Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  4. Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
  5. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  6. Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
  7. Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
  8. Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
  9. Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
  10. Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
  11. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
  12. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
  13. Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
  14. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
  15. Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
  16. Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
  17. Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
  18. Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
  19. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  20. Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
  21. Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
  22. Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  23. George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
  24. Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
  25. Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
  26. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
  27. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
  28. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
  29. Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005(2019).
  30. Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
  31. Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
  32. Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  33. Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
  34. Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
  35. Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
  36. Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
  37. Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
  38. Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Coral Skeleton MatrixHippocampal Cell CultureNeural Cell DurabilityGrain Size OptimizationSterile Coating ProcedureTrypsin Dissociation MethodHemocytometer Cell CountingPhase Contrast MicroscopyGlial Fibrillary Acidic ProteinMicrotubule Associated Protein Two

Powiązane artykuły