Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów

Summary

Koralowce tworzą bioróżnorodne ekosystemy ważne zarówno dla ludzi, jak i organizmów morskich. Jednak nadal nie rozumiemy pełnego potencjału i funkcji wielu komórek koralowców. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany do izolacji, znakowania i rozdzielania populacji kamiennych komórek koralowców.

Abstract

Rafy koralowe są zagrożone z powodu antropogenicznych czynników stresogennych. Biologiczna reakcja koralowców na te stresory może zachodzić na poziomie komórkowym, ale mechanizmy nie są dobrze poznane. Aby zbadać reakcję koralowców na stresory, potrzebujemy narzędzi do analizy odpowiedzi komórkowych. W szczególności potrzebujemy narzędzi, które ułatwią stosowanie testów funkcjonalnych, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób populacje komórek reagują na stres. W obecnym badaniu używamy sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) do izolowania i oddzielania różnych populacji komórek w koralowcach kamiennych. Protokół ten obejmuje: (1) oddzielenie tkanek koralowców od szkieletu, (2) stworzenie zawiesiny pojedynczej komórki, (3) znakowanie komórek koralowców za pomocą różnych markerów cytometrii przepływowej oraz (4) strategie bramkowania i sortowania komórek. Metoda ta umożliwi naukowcom pracę na koralowcach na poziomie komórkowym w celu analizy, testów funkcjonalnych i badań ekspresji genów w różnych populacjach komórek.

Introduction

Rafy koralowe są jednym z najważniejszych ekosystemów na Ziemi. Ułatwiają one bioróżnorodność, zapewniając krytyczne siedliska dla ryb i bezkręgowców oraz mają kluczowe znaczenie dla utrzymania społeczności antropogenicznych, zapewniając żywność i środki do życia poprzez turystykę¹. Jako kluczowy budowniczy raf koralowych, zwierzę koralowe (gromada: Cnidaria) pomaga również społecznościom przybrzeżnym, tworząc duże struktury z węglanu wapnia, które łagodzą uszkodzenia spowodowane przez fale i sztormy².

Dorosłe koralowce to zwierzęta siedzące, które mają szeroki wachlarz endosymbiotycznych partnerów, w tym wirusy, archeony, bakterie, protisty, grzyby, a przede wszystkim członków rodziny bruzdnic glonów Symbiodiniaceae³. Zmiany w środowisku mogą powodować brak równowagi w tej społeczności, często prowadząc do wybuchów chorób i blaknięcia koralowców, w których symbiotyczne Symbiodiniaceae są wydalane z kolonii koralowców, eliminując w ten sposób główne źródło pożywienia koralowców. Oba te scenariusze często powodują śmierć koralowca host^4,5,6. Skutki stresorów wywołanych przez antropogeny, takich jak gwałtowne zmiany klimatyczne, przyspieszają masową śmierć koralowców, prowadząc do globalnego spadku raf koralowych⁷.

Ostatnio opracowano wiele różnych metod, które pomagają złagodzić utratę raf koralowych. Metody te obejmują sadzenie koralowców na istniejących rafach, krzyżowanie genetyczne przy użyciu genotypów tolerancyjnych termicznie oraz manipulację komórkową społecznościami mikrobiologicznymi i symbiotycznymi hostowanymi w koralowcu^8,9. Pomimo tych wysiłków, wiele pozostaje niewiadomych na temat różnorodności komórek koralowców i ich funkcji^10,11,12,13. Dogłębne zrozumienie różnorodności typów komórek koralowych i funkcji komórek jest konieczne, aby zrozumieć, jak organizm koralowca zachowuje się w normatywnych i stresujących warunkach. Wysiłki mające na celu maksymalizację wydajności odbudowy i konserwacji skorzystają na lepszym zrozumieniu, w jaki sposób różnorodność komórek i funkcja genów są ze sobą sprzężone.

Poprzednie prace nad różnorodnością i funkcją komórek koncentrowały się głównie na badaniach histologicznych i pobieraniu próbek RNA z całych tkanek^14,15,16,17. Aby uzyskać więcej szczegółów na temat funkcji określonych typów komórek w koralowcach, potrzebne są metody izolacji określonych populacji żywych komórek koralowców. Udało się to z powodzeniem osiągnąć w nieklasycznych organizmach modelowych za pomocą technologii cytometrii przepływowej sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)¹⁸. FACS wykorzystuje kombinację laserów dostrojonych do różnych długości fal do pomiaru różnych endogennych właściwości komórkowych na poziomie pojedynczej komórki, takich jak względna wielkość komórki, ziarnistość komórki i autofluorescencja. Dodatkowo komórki mogą być oznaczone fluorescencyjnie znakowanymi związkami w celu zmierzenia określonych, pożądanych właściwości^18,19.

Do tej pory zastosowanie cytometrii przepływowej do komórek koralowców polegało głównie na analizie symbiotycznych Symbiodiniaceae i innych populacji bakterii, wykorzystując ich silną, naturalną autofluorescencję^20,21,22. FACS został również wykorzystany do oszacowania wielkości genomu koralowców za pomocą sygnału fluorescencyjnego markera DNA w porównaniu z komórkami organizmu modelu referencyjnego^23,24. Efektywne zastosowanie FACS zapewnia trzy odrębne narzędzia, które są przydatne w badaniach biologii komórki: 1) morfologiczny i funkcjonalny opis pojedynczych komórek; 2) identyfikacja, separacja i izolacja określonych populacji komórek do dalszych badań; oraz 3) analiza testów funkcjonalnych na poziomie pojedynczej komórki.

Rozwój i zastosowanie różnych egzogennych markerów fluorescencyjnych do badania komórek koralowców pozostaje prawie niezbadane. Takie markery mogą obejmować znakowane białka, znakowane substraty dla enzymów lub reakcje fluorescencyjne na inne związki. Markery te można wykorzystać do identyfikacji typów komórek, które mają unikalne właściwości, takie jak podświetlanie komórek, które wytwarzają różne ilości określonej cechy przedziału komórkowego, takich jak lizosomy. Dodatkowym przykładem jest użycie fluorescencyjnie znakowanych kulek do funkcjonalnej identyfikacji komórek odpowiedzialnych za fagocytozę, czyli pochłonięcie docelowego patogenu²⁵. Populacje komórek aktywnych w odpowiedziach immunologicznych można łatwo zidentyfikować za pomocą FACS po wchłonięciu tych egzogennie nałożonych kulek. Podczas gdy tradycyjne metody histologiczne wymagają zachowanej tkanki i wielu godzin, aby przybliżyć odsetek komórek dodatnich do pochłonięcia przez kulki, test funkcjonalny oparty na FACS na pochłanianie patogenów można przeprowadzić stosunkowo szybko na izolowanych żywych komórkach. Oprócz badania specyficznych dla komórek reakcji na stres, technologia ta ma potencjał, aby wyjaśnić ekspresję specyficzną dla genów i rzucić światło na historię ewolucyjną i rozwojową typów komórek całkowicie unikalnych dla parzydełkowców, takich jak kalikoblasty i parzydełka.

Ostatnio przeprowadziliśmy intensywne badania przesiewowe ponad 30 markerów komórkowych, które doprowadziły do zidentyfikowania 24, które są zdolne do oznaczania komórek koralowców, z których 16 jest przydatnych do rozróżniania unikalnych populacji¹⁸, tworząc z nich klastry różnicowania (CD). Tutaj opisujemy proces izolacji komórek koralowców w Pocillopora damicornis od usunięcia komórek ze szkieletu węglanu wapnia do identyfikacji i izolacji określonych populacji komórek za pomocą FACS (ryc. 1).

Protocol

1. Dysocjacja tkanek od szkieletu koralowca za pomocą aerografu i kompresora

UWAGA: Wykonuj kroki na lodzie i chroń ręce rękawiczkami.

1. Zmontuj zestaw aerografu, podłączając sprężarkę powietrza, wąż i aerograf (Rysunek 2). Ustaw manometr w zakresie 276−483 kPa.
   UWAGA: Zalecana sprężarka i wąż powietrzny używane w tym badaniu zostały ustawione na maksymalne ciśnienie 393 kPa. Stosowanie poza tym zakresem 276-483 kPa może skutkować albo niewystarczającym usunięciem komórek ze szkieletu, albo pęknięciem błon komórkowych. Zakres ten może być różny dla każdego gatunku i może wymagać przeprowadzenia badania żywotności. Test żywotności można przeprowadzić z podzbiorem zawiesiny komórkowej za pomocą prostego hemocytometru i testu wykluczenia barwnika 4′,6-diamidino-2-fenyloindolowego (DAPI), uwidocznionego pod mikroskopem złożonym.
2. Przygotować 100 ml pożywki do barwienia komórek w autoklawowanym, sterylnym szklanym pojemniku, dodając 33 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; bez wapnia i magnezu) do końcowego stężenia 3,3x, 2 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS; ciepło inaktywowane w temperaturze 56 °C przez 30 min) do 2% całkowitej objętości i 2 ml 1 M buforu HEPES do końcowego stężenia 20 mM. Następnie uzupełnić w 100 ml sterylną wodą.
   UWAGA: Stężenie 3,3x PBS zostało wybrane tak, aby naśladować zasolenie wody morskiej, jak wykazano w Rosental et al.¹⁸. Stężenie to należy dostosować do gatunków występujących w innych środowiskach, aby naśladować ich zasolenie.
3. Przenieś 10 ml pożywki do barwienia komórek do butelki aerografu (oznaczonej "F" w Rysunek 2) i załóż pokrywę adaptera do złącza aerografu.
   UWAGA: Większe fragmenty i gatunki z grubszymi warstwami tkanek mogą wymagać większej ilości pożywki do odpowiedniego usunięcia tkanek.
4. W przypadku pokazanych tutaj rozgałęzionych gatunków koralowców, użyj noża do kości, aby przyciąć lub przeciąć fragment koralowca o długości około 3−5 cm lub powierzchni 4^cm2.
   UWAGA: Fragment musi być wolny od makroglonów i innych organizmów wielokomórkowych, ponieważ mogą one nie zostać usunięte z próbki znajdującej się za próbką i mogą zanieczyścić próbkę podczas procesów analizy i sortowania FACS. 1 cm fragment P. damicornis daje około 2−10 x 10⁶ komórek po przefiltrowaniu, wybarwieniu i umyciu.
5. Umieść fragment koralowca w plastikowej torbie do zbierania i użyj aerografu, aby rozpylić pożywkę do barwienia komórek na koralowiec ( Rysunek 2). Kontynuuj ten proces, aż większość szkieletu zostanie odsłonięta. Wyjmij pozostały szkielet z worka zbiorczego.

2. Dysocjacja komórek od tkanki koralowej

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki na lodzie i chroń ręce rękawiczkami.

1. Przefiltrować zawiesinę komórek przez nylonowe sitko komórkowe o pojemności 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
   UWAGA: Różne rozmiary oczek sitka komórkowego mogą być bardziej odpowiednie dla różnych gatunków. Jednak większe rozmiary mogą powodować niewystarczającą dysocjację tkanek z powodu przechodzenia zanieczyszczeń i grudek komórek.
   1. W przypadku próbek z grubszymi warstwami śluzu użyj wysterylizowanego tłoka plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i delikatnie zmiel go o filtr, aby rozbić grudki i pomóc komórkom przejść przez sitko. Przepłukać sitko i tłok pożywką do barwienia komórek do probówki wirówkowej.
2. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 450 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do barwienia komórek.

3. Barwienie komórek

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki na lodzie i chroń ręce rękawiczkami. Plamy przedstawione w tym protokole służą do celów reprezentacyjnych. Alternatywne barwienie będzie wymagało różnych stężeń i czasów inkubacji.

1. Przenieść 500 μl zawieszonych komórek do probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml i odłożyć na bok jako próbkę kontrolną. Nie dodawać plamy do tej podwielokrotności.
2. Do pozostałej zawiesiny komórek dodać 0,42 μl 12 mM barwnika żywotności DAPI (tabela materiałów), 1 μl barwnika 5 μM reaktywnych form tlenu (ROS) (tabela materiałów) i 0,1 μl barwienia lizosomem 0,2 μM (tabela materiałów). Dobrze odpipetować do wymieszania i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu.
   UWAGA: DAPI jest używany w tym przykładzie do pracy jako barwnik DNA i barwnik żywotności do różnicowego bramkowania martwych komórek na maszynie FACS. Zakłada się, że DAPI przenika do umierających komórek ze względu na integralność błony. Barwienie ROS emituje światło w zakresie 520 nm (kolor zielony), natomiast marker lizosomalny emituje światło o długości około 668 nm (kolor czerwony).
3. Osad 500 μl barwionych komórek przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 450 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl pożywki do barwienia komórek. Przenieść do nowej probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie.

4. Uruchomienie FACS

UWAGA: Kroki mogą się różnić w zależności od marki i modelu cytometru ze względu na różnice w laserach i kanałach. Do tego protokołu użyto cytometru z laserami o długości fali 405, 488, 535 i 640 nm. Filtry zawarte w tym protokole służą do celów reprezentacyjnych. Alternatywne barwienie komórek może wymagać innego zestawu filtrów i laserów.

1. Rozpocznij tworzenie nowego szablonu projektu w oprogramowaniu sortera i wybierz panel laserowy. Aby uzyskać reprezentowaną kombinację barwienia i naturalnej fluorescencji, wybierz wszystkie cztery lasery (405, 488, 535 i 640 nm).
2. Wybierz odpowiednie filtry dla każdego oczekiwanego koloru reprezentowanego w eksperymencie.
   1. Aby wykryć emisję DAPI i pomóc w oddzieleniu żywych i martwych komórek, użyj filtra o pasmie przepustowym (BP) 450/50 (zakres 425−475 nm), takiego jak filtr DAPI, Hoeschst lub Pacific Blue.
   2. Do wykrywania światła emitowanego przez zielony sygnał ROS należy użyć filtra o BP 530/30 (zakres długości fali 515-545 nm), takiego jak filtr izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) lub białka zielonej fluorescencji (GFP). Ten filtr zmierzy stężenie ROS w każdej komórce.
   3. Dodaj dodatkowy filtr o BP 670/30 (zakres 655−685 nm), taki jak filtr allofikocyjaninowy (APC) do wykrywania emisji plam lizosomalnych.
      UWAGA: Kanał APC pozwoli na pomiar aktywności fagocytarnej. Kanał ten będzie również wykrywał autofluorescencję generowaną przez symbiotyczne algi koralowe z rodziny Symbiodiniaceae. Sygnał ten można jednak oddzielić za pomocą dodatkowego kanału, który ma dłuższą długość fali niż filtr APC.
   4. Dołącz filtr o BP 780/60 (zakres 750-810 nm), taki jak najczęściej stosowany filtr fikoerytryny, cyjaniny (APC-Cy7), który wykrywa emisję autofluorescencji dalekiej czerwieni z Symbiodiniaceae i pomaga w izolacji komórek aposymbiotycznych.

5. Konfiguracja bramkowania FACS

UWAGA: Kroki mogą się różnić w zależności od marki i modelu cytometru oraz programu akwizycji sprzężonego z cytometrem.

1. Na ekranie eksperymentalnym projektu w oprogramowaniu do cytometrii utwórz wykres punktowy i wybierz rozproszenie do przodu (FCS) jako metrykę dla osi X i rozproszenie boczne (SSC) dla osi Y.
   UWAGA: FCS koreluje z rozmiarem komórki, a SSC koreluje z ziarnistością. Pozwoli to na usunięcie większości zanieczyszczeń, ponieważ większość z nich będzie mniejsza niż nienaruszone komórki.
2. Ustaw osie na skalę logarytmiczną lub dwuwykładniczą, ponieważ rozmiary komórek i stopień szczegółowości mogą różnić się o kilka rzędów wielkości (Rysunek 3A), szczególnie w koralowcach.

6. Analiza FACS i izolacja komórek

UWAGA: Kroki mogą się różnić w zależności od marki i modelu cytometru oraz sprzężonego programu akwizycji.

1. Umieścić kontrolę (tj. niebarwiony podzbiór komórek) w komorze próbki cytometru i rozpocząć proces odczytu. Gdy komputer zacznie odbierać dane z każdej komórki lub zdarzenia, na wykresie punktowym zaczną pojawiać się kropki. Aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pozostawione w komorach cytometru z poprzednich eksperymentów, odczekaj około 30 s przed rozpoczęciem analizy.
2. Na wykresie punktowym dostosuj napięcie lampy fotopowielacza (PMT), aby wyśrodkować punkty.
   UWAGA: Napięcie PMT służy do wzmacniania siły sygnału mierzonych fotonów; jeśli napięcie PMT jest zbyt słabe, odczytywanych zostanie mniej komórek, a jeśli napięcie PMT jest zbyt silne, ogniwa będą mierzone w pobliżu wartości maksymalnej, a różne typy ogniw będą nie do odróżnienia od siebie. Odpowiednie napięcie PMT zapewnia, że niezależnie rozróżnialne zdarzenia wypełnią wykres punktowy. Separacja zdarzeń jest łatwiejsza do wizualizacji dzięki rzutowaniu skal logarytmicznych lub dwuwykładniczych na wykresach punktowych FSC i SSC.
3. Rozpocznij nagrywanie wydarzeń. Aby zachować próbkę, wstrzymaj pobieranie danych po odczytaniu około 15 000 zdarzeń. W większości przypadków będzie to wystarczające do wizualizacji ogólnych wzorców populacji komórek. Rejestruj więcej zdarzeń podczas analizowania i izolowania małych, wyspecjalizowanych populacji komórek.
4. Na pierwszym wykresie FSC i SSC utwórz wybór lub bramkę komórek wokół znaku 10² i wyżej na osi X FSC. Wszystko, co znajduje się poniżej tego progu, jest prawdopodobnie szczątkami komórkowymi. Narysuj prostokątne bramki, co jest regularną opcją w programach do cytometrii przepływowej i jest dobre dla wyraźnych, wyraźnych populacji komórek. W przypadku populacji komórek, które przyjmują bardziej nieregularny kształt na wykresach punktowych, należy użyć opcji bramkowania wielokątnego.
   UWAGA: Minimalna wartość odcięcia 10² na przednim rozproszeniu powinna wybierać najmniejsze komórki koralowca, ale może pozwolić na zanieczyszczenie szczątków. Aby to zmienić, zwiększ dolną granicę bramkowania, aby była bardziej konserwatywna.
5. Utwórz nowy wykres punktowy przedstawiający filtr DAPI na osi X i filtr APC-Cy7 na osi Y. Aby to zrobić, wybierz bramkę dla nienaruszonych komórek utworzonych w kroku 6.4, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję utworzenia nowego wykresu punktowego. Dostosuj osie do skali logarytmicznej lub dwuwykładniczej.
   UWAGA: Kroki potrzebne do utworzenia nowej działki mogą się różnić w zależności od oprogramowania.
6. Teraz wyjmij próbkę kontrolną z komory cytometru i zastąp ją wybarwionymi komórkami. Odczekaj 30 sekund przed rozpoczęciem analizy i zapisaniem danych. Nagraj około 15 000 komórek przed wstrzymaniem.
   UWAGA: Odrębne populacje na górnym końcu skali APC-Cy7 to te z wysoką czerwoną autofluorescencją z Symbiodiniaceae. Do wizualizacji tych podziałów populacji nie jest potrzebna żadna plama, można je również obejrzeć na nagraniu próbki kontrolnej (Rysunek 3C). Wybierz dla populacji samych koralowców, te znajdujące się niżej na osi Y, w celu dalszego zróżnicowania.
7. Utwórz nowy wykres punktowy komórek aposymbiotycznych, aby zobrazować stężenia ROS (filtr FITC) i komórki dodatnie dla lizosomów (filtr APC), ponownie wykorzystując skale logarytmiczne lub dwuwykładnicze.
   UWAGA: Jeśli istnieje wiele odrębnych populacji komórek, które są aposymbiotyczne, każda z nich może być dalej rozróżniana na własnym wykresie punktowym (Rysunek 3C,D).
8. Porównaj barwioną grupę próbek z kontrolnym, niebarwionym podzbiorem, korzystając z pierwszego zapisu próbki kontrolnej lub ponownie wprowadzając i uruchamiając grupę kontrolną. Bramkowanie zdarzeń, które są unikatowe dla poplamionej grupy próbek.

7. Sortowanie i zbieranie FACS

UWAGA: Kroki mogą się różnić w zależności od marki i modelu cytometru oraz programu akwizycji sprzężonego z cytometrem.

1. Po wybraniu komórek wybranych do pobrania, umieść probówki do mikrowirówek (zawierające 250−500 μl pożywki do hodowli komórkowych lub buforu do lizy w zależności od liczby pobranych komórek i metody przechowywania) w komorze pobierania cytometru.
   UWAGA: Reprezentowany cytometr przepływowy jest w stanie sortować jednocześnie cztery różne populacje, a maszyna może być skonfigurowana do przechowywania różnych urządzeń zbierających, w tym różnych probówek wirówkowych i płytek 96-dołkowych.
2. Gdy cytometr zacznie odczytywać próbkę i minie odpowiednia ilość czasu na wypłukanie zanieczyszczeń, zacznij sortować żądane populacje i zbieraj od 20 000 komórek do kilku milionów.
   1. W przypadku ponad 500 000 komórek dostosuj objętość pożywki do hodowli komórkowych lub buforu do lizy oraz objętość urządzenia do pobierania.
   2. W przypadku badań in vitro należy przechowywać komórki na lodzie do czasu umieszczenia w inkubatorze lub wysterylizowanym środowisku.
   3. W przypadku badań molekularnych należy natychmiast rozpocząć proces izolacji DNA/RNA/białka lub błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji.
3. Za każdym razem, gdy używany jest nowy barwnik, gatunek lub sortownik, należy przeprowadzić kontrolę czystości populacji będącej przedmiotem zainteresowania, sortując co najmniej 20 000 komórek zainteresowania na 500 μl podłoża barwiącego, a następnie ponownie analizując posortowane komórki i potwierdzając, że komórki są odczytywane w bramce użytej do początkowego sortowania (Rysunek 4).

Results

Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół jest użyteczny, ponieważ ułatwia identyfikację i zbieranie żywych populacji komórek koralowców, które mogą być wykorzystane do analiz funkcjonalnych. Proces roboczy rozpoczął się od mechanicznego oddzielenia tkanek koralowców od leżącego pod spodem szkieletu z węglanu wapnia (Rysunek 1). Jest to jeden z najważniejszych początkowych kroków, ponieważ niewłaściwa technika powoduje wysoką śmiertelność komórek i może powodować powstawanie ...

Discussion

Protokół ten został zaadaptowany z Rosental et ^al.18 i opracowany do identyfikacji i izolacji komórek P. damicornis . Metodologia koncentruje się na procesie filtrowania próbek w celu usunięcia zanieczyszczeń, komórek niezdolnych do życia i komórek gospodarzy Symbiodiniaceae poprzez badanie czynników wewnętrznych komórek, w tym względnej wielkości komórki, względnej ziarnistości komórki, autofluorescencji komórek i obecności nienaruszonych błon komórkowych. Techniki te można zastosować do...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw aerografu i Sprężarka	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Series Zestaw aerografu syfonowego o pojedynczym działaniu z kompresorem Master TC-20 i Wąż powietrzny
BD FACSAria II	BD	644832
Obcinaki do kości	Bulk Reef Supply	205357	Oceans Wonders Coral Stony Bone
Cutter Cell Strainer	Corning	352340	40 um; BD Sokół; pakowane pojedynczo; sterylny; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2,5 mM w DMSO; Wzbudzenie / emisja: 485/520 nm
Worek zbiorczy	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6 "L x 4" W Standardowa torebka foliowa wielokrotnego użytku z zamknięciem na zamek błyskawiczny, przezroczysta; 2 mil Grubość
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg w H2O; Wzbudzenie / emisja: 358/461 nm
Surowica cielęca płodu	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Inaktywowana termicznie w 57 & stopniach; C przez 30 minut
Hemacytometr	Sigma-Aldrich	Z359629	Hemacytometr Bright-Line
Bufor HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM w DMSO; Absorpcja/emisja: Probówki do mikrowirówek 647/668 nm
	VWR	87003-294	1,7 ml
buforowanej soli fizjologicznej (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7,4; 10X
Probówki okrągłodenne	VWR	352063	5 mL Polipropylenowa strzykawka z okrągłym dnem
	BD	309628	1 mL BD Luer-Lok Strzykawka sterylna, poliwęglan jednorazowego użytku