Strumienie węgla w kriosferze są jeszcze prawie nie oszacowane, ale są kluczowe dla zmian klimatycznych. Prezentujemy nowatorskie prototypowe urządzenie, które rejestruje potencjał fototroficzny w środowiskach nadraglacyjnych w oparciu o technologię emisji fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.), oferując dane o wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej w warunkach in situ.
Artykuł metodologiczny
Emisja fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Globalne ocieplenie wpływa na społeczności mikrobiologiczne w różnych ekosystemach, zwłaszcza w siedliskach kriosferycznych. Jednak niewiele wiadomo na temat strumieni węgla za pośrednictwem mikroorganizmów w ekstremalnych warunkach. W związku z tym metodologia pobierania próbek opisana w bardzo niewielu dostępnych badaniach implikuje dwa główne problemy: A) dane o wysokiej rozdzielczości wymagają dużej liczby próbek, co jest trudne do uzyskania w odległych obszarach; B) nieuniknione manipulacje próbkami, takie jak cięcie, piłowanie i topienie rdzeni lodowych, które prowadzą do niezrozumienia warunków in situ. W niniejszej pracy przedstawiono prototypowe urządzenie, które nie wymaga ani przygotowania próbki, ani jej zniszczenia. Urządzenie może być wykorzystywane do pomiarów in situ o wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej w ekosystemach lądowych i lodowych i opiera się na technice misji L.I.F.E. (Laser-I nduced Fluorescence E). Fotoautotroficzne zbiorowiska nadraglacjalne można zidentyfikować poprzez wykrycie sygnatur L.I.F.E. w fotopigmentach. Wykazano kalibrację przyrządu L.I.F.E. dla pochodnych porfiryny:chlorofilu a (chl a) (wzbudzenielaserowe 405 nm) i B-fikoerytryny (B-PE) (wzbudzenie laserowe 532 nm). W celu walidacji tej metodologii, dane L.I.F.E. zostały ratyfikowane za pomocą konwencjonalnej metody oznaczaniailościowego chl a, która obejmowała ekstrakcję pigmentu, a następnie spektroskopię absorpcyjną. Przydatność prototypu w terenie została sprawdzona w ekstremalnych środowiskach polarnych. Dalsze badania na siedliskach ziemskich odbywały się podczas symulacji analogowych Marsa na marokańskim pustyni oraz na austriackim lodowcu skalnym. Instrument L.I.F.E. umożliwia skanowanie dużych obszarów o wysokiej rozdzielczości przy akceptowalnej logistyce operacyjnej i przyczynia się do lepszego zrozumienia potencjału ekologicznego zbiorowisk supraglacjalnych w kontekście globalnych zmian.
Wprowadzenie
Kriosfera obejmuje lód morski, lodowce, wysokogórskie jeziora, obszary pokryte śniegiem, lód jeziorny, strumienie wód roztopowych oraz wieloletnią zmarzlinę. Obszary te pokrywają około 11% lądów Ziemi1,2 i są otoczone atmosferą, tworząc rozpoznawalne środowisko kriosferyczne. Niedawne badania wskazują, że rozległe obszary kriosfery szybko się cofają3,4. Antarktyka5,6, Alpy7, Arktyka8 oraz inne regiony wykazują ujemny bilans masy lodu. Cofanie się czapek lodowych i lodowców prowadzi do wyczerpywania największego rezerwuaru słodkiej wody na Ziemi. W niektórych obszarach regresja lodowców jest nieodwracalna5.
Przez długi czas ekosystemy lodowe były uważane za środowiska sterylne. Jednak pomimo surowych warunków, obecność aktywnego życia w kriosferze ziemskiej jest oczywista9,10,11,12,13,14,15. Ze względu na trend masowych strat lodu w wyniku topnienia, kriosfera przechodzi zmiany w aktywności biologicznej, co wpływa na siedliska sąsiadujące. Aby zrozumieć te częściowo nieodwracalne zmiany, potrzebujemy metod badania aktywności biologicznej w lodzie w warunkach in situ z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.
W środowiskach supraglacjalnych życie można znaleźć w dziurach krio konitowych, pokrywach śnieżnych, wodach roztopowych, strumieniach oraz na odsłoniętych powierzchniach lodu. Jednak najbardziej oczywistymi siedliskami supraglacjalnymi są dziury krio konitowe. Występują one globalnie w środowiskach zlodowaciałych i zostały po raz pierwszy opisane przez szwedzkiego odkrywcę Adolfa Erika Nordenskjolda podczas wyprawy na Grenlandię w latach 70. XIX wieku16,17. Nazwa pochodzi z greckich słów „kryos” (zimno) i „konia” (pył). Ciemne szczątki organiczne i nieorganiczne pochodzenia eolicznego osadzają się na powierzchni lodu i lokalnie obniżają albedo. Promieniowanie słoneczne sprzyja wtopieniu się tych szczątków w głębsze warstwy lodu, tworząc cylindryczne niecki z osadem (krio konitem) na dnie9. Dziury krio konitowe zajmują od 0,1 do 10% stref ablacji lodowcowej11.
Społeczności krio konitów składają się z wirusów, grzybów, bakterii, sinic, mikroalg i pierwotniaków. W zależności od regionu można w nich również znaleźć organizmy z grupy Metazoa, takie jak rotifery, nicienie, widłonogi, niesiory i larwy owadów. Edwards i inni18 opisują otwory krio konitowe jako „lodowate punkty zapalne” (ice-cold hotspots). Wykazali oni również obecność w otworach krio konitowych genów funkcjonalnych odpowiedzialnych za cykle N, Fe, S i P. Te ekosystemy miniaturowych jezior oddychają i prowadzą fotosyntezę z szybkością charakterystyczną dla znacznie cieplejszych i bogatszych w składniki odżywcze siedlisk11. Wyniki te podkreślają istotną rolę sekwestracji mikrobiologicznej w środowiskach supraglacjalnych. Oprócz żyjących społeczności w otworach krio konitowych, gołe powierzchnie lodu są zasiedlone przez algi lodowe. Ich fizjologia jest dobrze przebadana19, jednak ich rozkład przestrzenny nie został jeszcze oceniony20. Ich obecność w środowiskach supraglacjalnych zmniejsza albedo, a tym samym przyspiesza topnienie, co prowadzi do wymywania substancji odżywczych i ich dopływu do siedlisk położonych niżej9. Wzrost temperatury, a w konsekwencji większa dostępność wody w stanie ciekłym, wpływa na netto produktywność ekosystemu w tych lodowych środowiskach.
W środowiskach supraglacjalnych organizmy aktywności fotosyntetycznej przekształcają nieorganiczny węgiel i azot w organiczne źródła dostępne dla mikrobiologicznej sieci troficznej21,22. Do tej pory przeprowadzono niewiele badań szacujących strumienie węgla supraglacjalnego11,20,23. Rozbieżności w proponowanych wartościach strumieni węgla wynikają z niskiej rozdzielczości danych przestrzennych i czasowych. Ponadto dystrybucja przestrzenna społeczności supraglacjalnych poza otworami kriokonitowymi jest słabo oceniona. Cook i inni20 przewidzieli w swoich modelach, że ze względu na ogromną powierzchnię pokrycia, glony supraglacjalne wiążą do 11 razy więcej węgla niż współczesne otwory kriokonitowe. Wykrywanie społeczności glonów supraglacjalnych przy jednoczesnym zapewnieniu integralności próbek jest nadal utrudnione z powodu braku narzędzi do detekcji i kwantyfikacji in situ.
Ze względu na trudności logistyczne ekosystemy lodowe są badane rzadziej niż siedliska w obszarach umiarkowanych. Rozdzielczość danych zależy od liczby ocenionych próbek oraz od dostępności miejsc badań. Standardowe metody pobierania próbek, takie jak piłowanie, wiercenie rdzeni i późniejsze topnienie, wiążą się z manipulacją społecznością mikrobów. Na przykład ocena poziomu chlorofilua (chla) w stałych próbkach lodu jest niemożliwa przy użyciu standardowych metod bez znacznych zakłóceń. W związku z tym nieuniknione są zmiany temperatury wywołane topnieniem w badanych społecznościach mikrobów. Ze względu na termolabilność fotosystemu II oraz innych struktur komórkowych u psychrofili22, analizy laboratoryjne stopionych próbek lodu zawsze prowadzą do zafałszowania warunków in situ.
Nieniszczące pomiary in situ są jedynym racjonalnym sposobem na uzyskanie wiarygodnych danych. Cel ten można osiągnąć, stosując metody oparte na fluorescencji. Ze względu na ich funkcję zbierania światła, chla oraz B-fikocyjanina (B-PE) występują w organizmach przyczyniających się do cyklu węglowego w środowiskach supraglacjalnych, co udowodnili Anesio i inni11. Zatem cząsteczki fluorescencyjne te stanowią odpowiednie biomarkery do ilościowego określania przepływów węgla pośredniczonych przez mikroorganizmy w ekosystemach lodowych.
W niniejszym badaniu przedstawiamy opracowanie, kalibrację i zastosowanie nowatorskiego, nieinwazyjnego narzędzia do ilościowego oznaczania in situ cząsteczek chla oraz B-PE w ekosystemach lądowych i lodowych. Prototyp urządzenia opiera się na laserowo indukowanej emisji fluorescencyjnej, znanej również jako L.I.F.E. Instrument optyczny (Rycina 1) rejestruje sygnatury fluorescencyjnych biomarkerów po laserowym wzbudzeniu fluorescencji. Procedura ta jest nieniszcząca i może być przeprowadzana bezpośrednio w miejscu badań lub w laboratorium.
Rysunek 1: Prototyp L.I.F.E. Lewo: Zdjęcie urządzenia bez pokrywy ochronnej. Prawo: Schematyczny rysunek urządzenia. Masa całkowita = 5.4 kg (laser i optyka = 4.025 kg, laptop = 1.37 kg). Aluminiowa rama = 32.5 cm x 20.3 cm x 6.5 cm. Rura optyczna: 18.4 cm x 4 cm (średnica). CCD: sensor bluefox mv220g; F: filtry długoprzepustowe sterowane serwomechanizmem (450 nm i 550 nm); L: soczewki optyczne; M1: lustra; M2: lustro dichroiczne; MC: mikrokontroler; P: pryzmat; PBS: polaryzacyjny dzielnik wiązki; S: szczelina wykonana z regulowanych żylet. Pasek skali = 70 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Przenośny zestaw dwudługościowy waży 4,5 kg i jest używany na statywie w połączeniu z zewnętrznym komputerem. Konfiguracja w terenie jest szybka i łatwa. Instrument jest mocowany do statywu, a do urządzenia przytwierdzona zostaje tuba obiektywu wraz z kablem USB i kablem kamery. Zewnętrzny komputer jest podłączony do instrumentu za pomocą kabla USB. Nogi statywu są regulowane w taki sposób, aby tuba obiektywu była skierowana w stronę próbki i ją obejmowała. Następnie zielony laser o mocy 5 mW pada na próbkę po przejściu przez polaryzacyjny rozdzielacz wiązki, który kieruje światło spolaryzowane w stronę osi optycznej spektrometru. Próbka emituje światło fluorescencyjne, przedstawione na czerwono na Rysunku 1. Połowa skolimowanego światła przechodzi przez polaryzacyjny rozdzielacz wiązki i jest ogniskowana przez sterowany serwomechanizmem filtr długoprzepustowy, który usuwa sygnały laserowe. Następnie sygnał pada na szczelinę przysłony składającą się z dwóch regulowanych żyletek. Pryzmat rozdziela spektralnie cienką linię światła prostopadle do szczeliny przysłony, zanim sygnał zostanie zarejestrowany przez detektor. Procedura jest powtarzana z użyciem niebieskiego lasera. Surowe dane są automatycznie przesyłane do przenośnego komputera, który służy również do obsługi oprogramowania.
Instrument jest sterowany przez zewnętrzny komputer z wykorzystaniem środowiska LabVIEW, które synchronizuje wykonywanie zdjęć przez kamerę CCD, włączanie i wyłączanie laserów oraz obracanie koła filtrów długoprzepustowych. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) jest podzielony na trzy główne sekcje. Regulacja czasu ekspozycji odbywa się ręcznie. Chociaż korelacja między czasem ekspozycji a intensywnością sygnału jest liniowa (Rysunek 2B), maksymalny czas ekspozycji jest ograniczony do 10 s, ponieważ dłuższe czasy całkowania prowadzą do znacznego spadku stosunku sygnału do szumu. Pole komentarzy służy do opisu próbki (Rysunek 2A). W prawej sekcji obrazy surowe są wyświetlane natychmiast po zakończeniu pomiarów. Funkcja ta jest kluczowa dla bieżącej oceny danych w terenie (Rysunek 2C–E). Czerwone obszary wskazują prześwietlone piksele, czego można uniknąć poprzez skrócenie czasu ekspozycji.
Kolejny proces redukcji surowych danych jest oddzielony od procedury akwizycji obrazu i może zostać przeprowadzony w dowolnym momencie po jej zakończeniu.
Rycina 2: Graficzny interfejs użytkownika L.I.F.E. służący do akwizycji danych i ewaluacji danych surowych. (A) Oprogramowanie umożliwia ręczne wprowadzanie tekstu w opisach próbek. (B) Czas ekspozycji można dostosować przed wykonaniem pomiaru. (C−E) Obrazy surowe są wyświetlane po prawej stronie interfejsu. (E) Kolor czerwony wskazuje na nasycenie sensora. (F) Aktywacja przycisku RUN MEASUREMENT uruchamia proces akwizycji danych. W tablicy (G) wyświetlane są wszystkie polecenia wykonywane automatycznie podczas akwizycji danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Przykład surowego obrazu. Lewo: Surowe dane wzorca chla w roztworze acetonu, zarejestrowane za pomocą instrumentu L.I.F.E. Ze względu na właściwości optyczne urządzenia sygnał jest wyświetlany jako zakrzywiona linia. Prawo: Interpretacja surowego obrazu na piksel (px). Oś widmowa (rozdzielczość 5 nm/px) jest naniesiona względem osi przestrzennej (rozdzielczość 30 µm/px). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Surowe obrazy w 12-bitowej skali szarości wykazują komponent przestrzenny wynikający z jednowymiarowej szczeliny apertury oraz komponent spektralny wynikający z obecności pryzmatu przed detektorem CCD (Rycina 3). Ze względu na ograniczenia optyczne obrazy surowe są zniekształcone. W związku z tym muszą zostać przycięte i poddane korekcji geometrycznej (dewarpingowi) poprzez zastosowanie kodu rozpoznającego stopień zniekształcenia. Operację tę wykonuje się za pomocą kreatora oprogramowania (Rycina 4). Następnie przeprowadzana jest kalibracja długości fali za pomocą lasera 532 nm. Zielone światło jest generowane poprzez podwojenie częstotliwości podczerwonego lasera 1,064 nm. Obie długości fal mogą być wykrywane przez CCD, dzięki czemu pozycja spektralna każdego piksela w obrazach po korekcji geometrycznej może być obliczona automatycznie (Rycina 4).
Następnie obraz jest przycinany do określonego zakresu długości fal (550–1,000 nm dla pomiarów laserem zielonym oraz 400–1,000 nm dla pomiarów laserem niebieskim). Wartości szarości z każdego piksela w wybranej linii pikseli są zliczane i sumowane. Wartość szarości może mieścić się w zakresie 0–255. W efekcie każda linia pikseli odpowiada jednej liczbie. Dalsze instrukcje wyświetlane przez oprogramowanie prowadzą do wygenerowania wykresu, na którym liczby wartości szarości z każdej linii pikseli są naniesione względem współrzędnych przestrzennych. Pozwala to na jednoczesne ilościowe rozróżnienie przestrzenne chla oraz B-PE w próbce. Dodatkowo z wybranych linii pikseli można automatycznie wykreślić właściwości widmowe próbki.
Rysunek 4: Korekcja zniekształceń (dewarping) obrazów surowych. Lewo: Obraz surowy zarejestrowany za pomocą zielonego lasera. Nie zastosowano filtrów. Sygnały są wyświetlone dla 532 nm i 1 064 nm. Czas ekspozycji = 0,015 s. Środek: Przycięty sygnał 532 nm służy jako linia odniesienia do korekcji zniekształceń zestawu obrazów. Prawo: Obraz po korekcji zniekształceń pochodzący z surowego źródła obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Protokół
1. Kalibracja i walidacja
UWAGA: Do kalibracji pigmentów należy przygotować szeregi rozcieńczeń z roztworów zapasowych chla i B-PE. Roztwór zapasowy chla rozcieńcza się acetonem, a B-PE sterylną wodą destylowaną. W późniejszym etapie wymagane będą 15 mL każdego stopnia rozcieńczenia. Pigmenty należy chronić przed światłem, owijając je folią aluminiową. Do czasu użycia chla należy przechowywać w zamrażarce, a B-PE w lodówce. Szczegółowy protokół przygotowania szeregu rozcieńczeń znajduje się w sekcjach 1.1 dla chla oraz 1.2 dla B-PE. Poniżej opisano laboratoryjną kalibrację chla i B-PE do detekcji i oznaczania ilościowego pigmentów za pomocą instrumentu L.I.F.E. Wcześniejsza kalibracja24 została przeprowadzona z użyciem tych samych pigmentów, co w niniejszym badaniu.
- Szereg rozcieńczeń chlorofilua
- Rozpuścić 1 mg chla (oczyszczonego z alg A. nidulans) w acetonie w probówce o pojemności 50 mL, a następnie rozcieńczyć ten roztwór zapasowy chla acetonem do następujących stężeń końcowych: 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1 oraz 0,5 ng/mL.
- Przenieść po 15 mL każdego rozcieńczenia do probówek 50 mL i owinąć je folią aluminiową ze względu na światłoczułość. Przechowywać probówki w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu wykonania pomiarów kalibracyjnych.
UWAGA: W tym miejscu można przerwać procedurę. - Zmierzyć cechy absorpcji chla dla każdego rozcieńczenia w spektrofotometrze dwuwiązkowym w trzech powtórzeniach i obliczyć zawartość chla zgodnie z metodą Lorenzen25, która zostanie szczegółowo opisana w sekcji 2.2.2.
- Szereg rozcieńczeń PE
- Rozcieńczyć roztwór zapasowy B-PE o stężeniu 4 mg/mL sterylną filtrowaną wodą (pH = 7) do następujących stężeń końcowych: 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10 oraz 5 ng/mL B-PE. Przenieść po 15 mL każdego rozcieńczenia do probówki 50 mL i owinąć ją folią aluminiową. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
UWAGA: W tym miejscu można przerwać procedurę.
- Rozcieńczyć roztwór zapasowy B-PE o stężeniu 4 mg/mL sterylną filtrowaną wodą (pH = 7) do następujących stężeń końcowych: 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10 oraz 5 ng/mL B-PE. Przenieść po 15 mL każdego rozcieńczenia do probówki 50 mL i owinąć ją folią aluminiową. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
- Przygotowanie do kalibracji
- Zbudować stelaż zgodnie z Rysunkiem 5, aby utworzyć trzy platformy pomiarowe, z których każda jest o 1,5 cm wyższa od poprzedniej.
UWAGA: Stelaż i wysokość kolumny odgrywają istotną rolę w pomiarach, ponieważ powierzchnia cieczy powinna znajdować się w punkcie ogniskowym instrumentu L.I.F.E., jak wskazano na Rysunku 5. - Wlać 5 mL rozcieńczenia o najwyższym stężeniu do plastikowej fiolki poliscyntylacyjnej i umieścić ją w najwyższym punkcie stelaża. Zmierzyć intensywność fluorescencji.
- Umieścić fiolkę w środkowej pozycji stelaża i dodać kolejne 5 mL (całkowita objętość 10 mL). Zmierzyć intensywność fluorescencji. Powtórzyć procedurę w najniższej pozycji stelaża, dodając kolejne 5 mL (całkowita objętość 15 mL; całkowita wysokość kolumny 45 mm).
UWAGA: Dostosować czas ekspozycji dla każdego etapu rozcieńczania, aby zapobiec nasyceniu detektora (wartości szarości powyżej 255 w obrazach 12-bitowych) i zapewnić odpowiedni stosunek sygnału do szumu dla słabych sygnałów fluorescencji. - Powtórzyć kroki 1.3.2 i 1.3.3 dla wszystkich rozcieńczeń (kroki 1.1.1 i 1.2.1) chla oraz B-PE.
- Wgrać wygenerowane pliki danych do kreatora redukcji danych, aby automatycznie zliczyć i zsumować wartości szarości z każdej linii pikseli wzdłuż osi Y (rozkład przestrzenny).
UWAGA: Różne czasy ekspozycji są kompensowane automatycznie poprzez normalizację intensywności fluorescencji do czasu całkowania 1 s. - Obliczyć gęstość powierzchniową pigmentu za pomocą analizy regresji Poissona, wykorzystując znane stężenia z serii rozcieńczeń oraz obliczone znormalizowane intensywności fluorescencji. Następnie znormalizować wyniki zliczania fluorescencji z trzech różnych wysokości kolumn do poziomu 1,5 cm (5 mL), mnożąc wyniki z każdej wysokości kolumny przez odpowiedni czynnik (czynniki 1, 0,5 i 0,33 odpowiednio dla roztworów o objętości 5 mL, 10 mL i 15 mL).
- Zbudować stelaż zgodnie z Rysunkiem 5, aby utworzyć trzy platformy pomiarowe, z których każda jest o 1,5 cm wyższa od poprzedniej.
Rycina 5: Układ do kalibracji L.I.F.E. z chla i B-PE w warunkach laboratoryjnych.
(A) Tubus soczewkowy instrumentu. (B) Zielony laser do wzbudzenia B-PE. (C) Niebieski laser do wzbudzenia chla. (D) Fiolka scyntylacyjna. (E) Punkt ogniskowy instrumentu L.I.F.E. (F) Roztwór B-PE/woda lub chla/aceton o objętości 5 mL, 10 mL i 15 mL. (G) Dystanse utrzymujące powierzchnię każdego roztworu w płaszczyźnie ogniskowej dla trzech różnych objętości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Pobieranie i przetwarzanie próbek
- Zbiór śniegu i lodu
- Zebrać śnieg i lód supraglacjalny z lodowca do sterylnych worków polietylenowych i przechowywać w zamrożeniu do czasu dalszej obróbki.
UWAGA: W niniejszym badaniu próbki pobrano z Midtre Lovenbreen (MLB), lodowca politermalnego w pobliżu stacji badawczej Ny-Ålesund na wyspach Svalbard w wysokiej Arktyce (78°53’ N, 12°03’ E). - Pobrać próbki mat bakteryjnych z przedpola lodowca do sterylnych worków polietylenowych i przetransportować wszystkie próbki do laboratorium w celu dalszej obróbki.
- Powoli rozmrozić zamrożony materiał w ciemności w temperaturze 4 °C. Przesączyć próbki ciekłe przez filtry GF/F (średnica 47 mm) i zanotować objętość przefiltrowanej cieczy. Filtry przechowywać w zamrożeniu do czasu dalszej obróbki.
- Zebrać śnieg i lód supraglacjalny z lodowca do sterylnych worków polietylenowych i przechowywać w zamrożeniu do czasu dalszej obróbki.
- Pomiary chlorofilu a
- Za pomocą instrumentu L.I.F.E. zmierzyć filtr w czterech losowych obszarach, wykonując pomiary w trzech powtórzeniach z użyciem lasera zielonego i niebieskiego. Obliczyć całkowite stężenie pigmentu, mnożąc gęstość powierzchniową przez powierzchnię filtrowania oraz objętość przefiltrowanej cieczy. Znormalizować stężenie pigmentu (µg/L) do objętości 1 L.
- Ocenić zawartość chla na filtrach GF/F przy użyciu standardu laboratoryjnego zgodnie z protokołem Lorenzen25. W tym celu każdy z filtrów umieścić w probówce z 13 mL acetonu i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie wyjąć probówkę, umieścić ją w lodzie i poddać sonikacji przez 2 min przy mocy 50% w trybie ciągłym. Ścisnąć i wyjąć filtr z probówki.
- Podłączyć wężyk tygonowy do strzykawki i pobrać z probówki mieszaninę acetonu z ekstraktem chla. Zastąpić wężyk tygonowy uchwytem do filtra GF-5. Przenieść roztwór do kuwety kwarcowej.
- Po skalibrowaniu spektrometru absorbancji dla acetonu, umieścić kuwetę z próbką w spektrometrze i zmierzyć charakterystyki absorbancji w zakresie 400–750 nm. Następnie wyjąć kuwetę ze spektrometru i dodać do próbki 200 µL 2 M HCl. Ponownie przeprowadzić pomiar absorbancji w celu oznaczenia zawartości feofityny w próbce.
- Pomiar aktywności mikrobiologicznej za pomocą markerów znakowanych izotopowo oraz wpływ intensywności laserowej i czasu ekspozycji na tempo produkcji
OSTROŻNIE: Należy uważać na radioaktywność markerów (promieniowanie β). Używać fartucha laboratoryjnego, rękawic i gogli oraz pracować pod wyciągiem w licencjonowanym laboratorium izotopowym.- W celu oznaczenia produkcji bakteryjnej przenieść pięć alikwotów mat bakteryjnych do sterylnych worków polietylenowych. Inaktywować próbki kontrolne formaldehydem do końcowego stężenia 4%.
UWAGA: Trzy alikwoty są wykorzystywane do pomiaru poboru leucyny znakowanej 3H, a dwa alikwoty służą jako kontrole. - Naświetlać maty laserem niebieskim (405 nm, 5 mW) oraz laserem zielonym (532 nm, 5 mW) przez 10 s i 30 s każdorazowo. Powtórzyć procedurę z laserami o mocy 50 mW. Następnie inaktywować próbki, które nie były traktowane formaldehydem.
UWAGA: Jedna mata jest poddawana tylko jednej ekspozycji laserowej. Jako kontrole należy wykorzystać maty mikrobiologiczne niepoddane naświetlaniu. - Po zabiegu laserowym oszacować produkcję bakteryjną i pierwotną poprzez włączenie odpowiednio 3H-leucyny i NaH14CO3. Do pomiarów produkcji bakteryjnej użyć pięciu alikwotów na próbkę (20 mL) i dodać formalinę (końcowe stężenie 4%) do dwóch z powtórzeń, które służą jako kontrole abiotycznego włączenia markera. Dodać 3H-leucynę (40 nM) do wszystkich próbek w różnych wariantach i inkubować przez 4 h w warunkach in situ (0,1 °C). Przerwać reakcję poprzez dodanie formaliny do pozostałych żywych próbek.
- W przypadku produkcji bakteryjnej mat bakteryjnych, przenieść znakowane próbki do probówek kriogenicznych. Ekstrahować komórki kwasem trójchlorooctowym 5% i wirować przy 10 000 x g przez 5 min zgodnie z protokołami Kirchman26 i Bell27. Dodać ciecz scyntylacyjną i umieścić probówkę kriogeniczną w probówce poliscyntylacyjnej. Analizować próbki za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego i obliczyć tempo poboru.
UWAGA: Trzy alikwoty są wykorzystywane do pomiaru poboru leucyny znakowanej 3H, dwa alikwoty służą jako kontrole. - W celu oznaczenia produkcji pierwotnej przygotować pięć powtórzeń dla różnych wariantów (100 mL), dwa z nich zawinąć w folię aluminiową w celu symulacji próbek ciemnych i do wszystkich dodać NaH14CO3 (1 µCi). Inkubować przez 4 h w świetle otoczenia i temperaturze in situ (0,1 °C). Przerwać reakcję poprzez zaciemnienie pozostałych trzech powtórzeń i przefiltrować próbkę na filtry GF/F (średnica 25 mm).
- Dodać do filtrów 100 µL 2 N HCl, aby usunąć nadmiar węgla, i pozostawić do odparowania pod wyciągiem. Wysuszyć próbki na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C i umieścić je w probówkach poliscyntylacyjnych.
- Aby zmierzyć liczbę rozpadów promieniotwórczych na minutę (dpm) dla wszystkich wariantów produkcji pierwotnej i bakteryjnej, umieścić probówki kriogeniczne w probówkach poliscyntylacyjnych i dodać 5 mL koktajlu scyntylacyjnego. Zmierzyć dpm za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego i obliczyć tempo poboru.
- W celu oznaczenia produkcji bakteryjnej przenieść pięć alikwotów mat bakteryjnych do sterylnych worków polietylenowych. Inaktywować próbki kontrolne formaldehydem do końcowego stężenia 4%.
Wyniki
Kalibracja laboratoryjna dla B-PE
Sygnały odpowiedzi dla serii rozcieńczeń B-PE zmierzono za pomocą instrumentu L.I.F.E. w ciemni w temperaturze 20 °C (Rycina 6). Szybkość zliczania zależała zarówno od stężenia, jak i od wysokości słupa mierzonej próbki. Próbki B-PE o niskim stężeniu i niskiej wysokości słupa wykazywały silniejszą fluorescencję w porównaniu do próbek o tym samym stężeniu i większej wysokości słupa.
Rycina 6: Kalibracja laboratoryjna B-PE. Przedstawiono kalibrację zawartości B-PE i gęstości kolumny. Znormalizowane szybkości zliczeń obliczono dla wysokości kolumny 1,5 cm. Przedruk za zgodą28. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Do dopasowania końcowej linii kalibracyjnej wykorzystano regresję Poissona. Stwierdzono liniową korelację pomiędzy gęstością powierzchniową a wartościami odcieni szarości pikseli. Funkcja krzywej wynosiła y = 81,04x (Rysunek 7), co oznacza, że wartość odcienia szarości wynosząca 8 104 w próbce naświetlanej przez 1 s odpowiadała gęstości powierzchniowej 100 ng/cm2 B-PE. Kalibracja chla została przeprowadzona w analogiczny sposób. Funkcja wynosiła y = 8,94x.
Rycina 7: Końcowa krzywa kalibracyjna dla B-PE. Zliczenia wartości szarości zostały znormalizowane do czasu ekspozycji 1 s i naniesione na wykres w funkcji gęstości powierzchni. Przedruk za zgodą28. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Zastosowanie w próbkach krio konitu ze Svalbardu oraz laboratoryjna walidacja danych
Średnie wartości pomiarów L.I.F.E. oraz pojedyncze pomiary tych samych próbek uzyskane poprzez konwencjonalną ekstrakcję za pomocą acetonu i następującą po niej analizę spektrofotometryczną przedstawiono na Rysunku 8.
Rycina 8: Walidacja danych z wykorzystaniem próbek naturalnych. Próbki (MLB) zostały uszeregowane według zawartości chla na podstawie wyników z laboratoryjnego spektrofotometru (wartości pojedyncze) i porównane z danymi fluorescencji chla zmierzonymi w czterech losowych obszarach na filtr. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe pomiarów L.I.F.E. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Zawartość chla w zakresie od 48 µg/L do 67 µg/L została niedoszacowana, natomiast niższa zawartość chla w zakresie od 0,7 µg/L do 7 µg/L została przeszacowana przez prototyp L.I.F.E. Odchylenia standardowe pomiarów L.I.F.E. były niskie.
Porównanie danych widmowych z pomiarów in situ ze standardami laboratoryjnymi
Widma Chla były porównywalne pomiędzy próbkami krikonitu a tymi oczyszczonymi z alg A. nidulans. Piki fluorescencji we wszystkich próbkach znajdowały się w zakresie 700 nm–710 nm. Jednakże widma pochodzące z próbek krikonitu wykazywały wyższe sygnały szumów w zakresach 400 nm–650 nm oraz 800 nm–1,000 nm w porównaniu z widmami standardu pigmentu chla (Rysunek 9).
Rysunek 9: Interpretacja danych spektralnych. Pomiary czterech granulek krioKonitu (kolor niebieski) i standardowego roztworu pigmentu chla (kolor czerwony) po wzbudzeniu laserami 405 nm. Widma zarejestrowano 1 rok po pobraniu próbek. Próbki były przechowywane w zamrożeniu i nie były wystawione na działanie światła przed pomiarem. W wyniku problemów z kalibracją długości fali szczyt fluorescencji znajduje się w zakresie 700 nm–710 nm zamiast 680 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Zautomatyzowana analiza ziaren kriokonitu
W przykładzie zautomatyzowanej analizy otworu kriokonitowego (Rysunek 10) najwyższe gęstości powierzchniowe pigmentów zaobserwowano w linii pikseli 50. Widmo próbki po wzbudzeniu laserem 532 nm wykazało szczyt z odcięciem przy wartości szarości 255 w wyniku przesycenia sensora. Szczyt ten pochodził z zielonego lasera, a nie z sygnału fluorescencyjnego.
Rycina 10: Zautomatyzowana analiza danych pojedynczego ziarna krikonitu o średnicy 1 mm. Próbkę pobrano z lodowca Vestre Brøggerbreen (VBB) i zmierzono w ciągu 4 h od pobrania w ciemnym pomieszczeniu laboratoryjnym w obiekcie Stacji Arktycznej (GB) w Ny-Ålesund. Lewa kolumna przedstawia pomiary B-PE, a prawa kolumna reprezentuje dane dla chla. Surowe obrazy wyświetlane są na górze. Odpowiedzi fluorescencji indukowanej laserowo przedstawiono w kolorze szarym. Obszary czerwone wskazują odpowiedź pigmentów standardowych. Środkowa sekcja ilustruje rozmieszczenie przestrzenne docelowych pigmentów. Właściwości spektralne sygnału fluorescencji przedstawiono na dolnych obrazach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Wpływ wzbudzenia laserowego na produktywność mat bakteryjnych
Ani produktywność pierwotna, ani bakteryjna nie uległy zmianie po zwiększeniu mocy lasera i/lub czasu ekspozycji (Rycina 11). Nie stwierdzono istotnych różnic podczas zabiegów laserowych z zwiększoną mocą.
Rycina 11: Pomiary produktywności próbek ze Svalbardu. Maty bakteryjne poddano działaniu laserów zielonych i niebieskich o różnych intensywnościach i czasach ekspozycji. Dane są pokolorowane zgodnie z długością fali źródła laserowego (zielony i niebieski). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Kalibracja
Po normalizacji liczby fotonów do czasu ekspozycji 1 s stwierdzono liniową korelację między stężeniem pigmentu a intensywnością fluorescencji. Próbki o niskiej wysokości kolumny i niskim stężeniu pigmentów prowadziły do przeszacowania zawartości docelowych pigmentów w porównaniu do większych wysokości kolumn przy tym samym stężeniu pigmentu. Ponadto słabe sygnały fluorescencji wymagały długich czasów ekspozycji, aby uzyskać wystarczającą liczbę fotonów na detektorze. Jednak długie czasy integracji zwiększały również ilość światła rozproszonego na detektorze, co skutkowało spadkiem stosunku sygnału do szumu. W obecnej wersji oprogramowanie nie potrafi odróżnić szumu od sygnału podczas procesu redukcji danych. W związku z tym pomiary o niskiej intensywności fluorescencji prowadziły do przeszacowania zawartości pigmentu, ponieważ szum był liczony jako sygnał pochodzący od docelowych pigmentów. Co więcej, intensywności fluorescencji w bardziej stężonych roztworach pigmentów wykazywały większą zmienność niż w roztworach o niskim stężeniu. Efekt ten można wyjaśnić procesami absorpcji w roztworach pigmentów wykorzystanych do sporządzenia krzywej kalibracyjnej.
Walidacja danych dla oznaczania ilości chlorofilu a
Po przefiltrowaniu próbek lodu i śniegu, trójwymiarowe próbki wyglądały na filtr niemal jak preparaty dwuwymiarowe. Uzasadniało to bezpośrednie porównanie danych z L.I.F.E (gęstość powierzchniowa) oraz danych spektrofotometrycznych (pomiar objętościowy).
Zbiór danych (Rysunek 8) wskazał, że wysokie stężenie pigmentu prowadzi do niedoszacowania, podczas gdy niskie stężenie pigmentu prowadzi do przeszacowania wartości rzeczywistej. Efekt ten można wyjaśnić grubością placka filtracyjnego, a tym samym objętościowym charakterem próbki. Głębokość penetracji lasera zależała od gęstości optycznej i grubości preparatu. Wysokie zawartości pigmentu były niedoszacowane, ponieważ laser nie mógł wywołać fluorescencji pigmentu w głębszych warstwach. Jednak w cienkich plackach filtracyjnych rejestrowano niskie sygnały fluorescencji ze względu na niską gęstość powierzchniową pigmentów. Wyraźnie widać, że sam filtr wykazywał sygnały indukowane laserem po przejściu przez filtr długoprzepustowy 450 nm (Rysunek 12). Sygnał ten był błędnie liczony jako sygnał fluorescencji pochodzący od chla. Zatem cienkie i zbyt grube placki filtracyjne są trudne do pomiaru za pomocą instrumentu L.I.F.E.
Rycina 12: Sygnały fluorescencji z grubego (A) i cienkiego (B) placka filtracyjnego na filtrze GF/F. (A) Samozasłanianie zapobiega fluorescencji indukowanej laserem z głębszych warstw, co prowadzi do niedoszacowania rzeczywistego stężenia pigmentu. (B) Emisja fluorescencji z placka filtracyjnego z nałożonymi odbiciami filtra. (C) Surowe dane wykazują odbicie filtra (kolor szary). Właściwość widmowa wzorca fluorescencji chla otrzymanego w laboratorium jest przedstawiona na czerwono. Pasek skali = 45 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Ograniczenia prototypu L.I.F.E.
Podczas redukcji danych oprogramowanie zakodowane w MATLAB interpretowało surowe obrazy poprzez sumowanie linii pikseli w określonym zakresie długości fali. Obecna wersja oprogramowania nie odróżnia sygnałów pochodzenia organicznego od nieorganicznych. Obecność wielu sygnałów może prowadzić do przeszacowania rzeczywistej zawartości pigmentów. Długie czasy ekspozycji wynikające z niskiej intensywności fluorescencji prowadziły do obniżenia stosunku sygnału do szumu, co potęgowało opisany powyżej efekt (patrz Rysunek 8 i Rysunek 12).
Geoda przedstawiona na Ryc. 13 wykazuje czerwoną fluorescencję po naświetleniu światłem zielonym i niebieskim. Obecnie nie jest jasne, czy fluorescencja ta wynika z obecności minerałów, czy z cząsteczek opartych na porfirynach. W związku z tym nałożenie się sygnałów biologicznych i niebiologicznych może ograniczać zastosowanie tej metody i wymagać stworzenia bazy danych fluorescencji opracowanej specjalnie dla prototypu L.I.F.E.
Rycina 13: Fluorescencja minerałów z geody skalnej znalezionej w Ny-Ålesund. Skała została wzbudzona laserem 532 nm 50 mW (A) oraz laserem 405 nm 50 mW (B). Oba zdjęcia wykonano z zastosowaniem filtra polaryzacyjnego na obiektywie, co doprowadziło do zafałszowania rzeczywistych kolorów fluorescencji. (C) Obraz w prawdziwych kolorach wykonany bez użycia filtra polaryzacyjnego w warunkach światła dziennego. Pasek skali = 40 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Beutler i inni29 wyciągnęli wniosek, że charakterystyczne widma emisji cyjanobakterii w ekosystemach morskich zależą od warunków środowiskowych. Ponadto stan metaboliczny wpływa na właściwości fluorescencji u organizmów fototroficznych30. Instrument L.I.F.E może rozróżniać wzorce fluorescencji alg i cyjanobakterii, wykorzystując biblioteki bio-odcisków zawierające informacje spektralne próbki skorelowane z warunkami środowiskowymi.
W cząsteczkach chla zaadaptowanych do ciemności wszystkie centra reakcyjne są w pełni utlenione i dostępne dla fotochemii, a wydajność fluorescencji nie jest tłumiona31. W procedurze L.I.F.E. próbka jest najpierw wzbudzana laserem 532 nm (zielonym), a następnie laserem 405 nm (niebieskim). Podczas drugiego wzbudzenia laserem niebieskim chla może wykazywać zmniejszoną odpowiedź fluorescencyjną z powodu wcześniejszego wzbudzenia laserem zielonym. Chla pochłania energię przy długości fali 532 nm, pomimo oddalenia od maksimum swojej długości fali absorpcji32. Przed właściwym pomiarem chla przy 405 nm laser zielony może wywołać reakcje fotochemiczne, aktywując mechanizmy tłumienia w pigmentach docelowych. Ponadto wstępne naświetlanie morskich organizmów fototroficznych nie doprowadziło do zmiany krzywych normy widmowej w zakresie 450 nm–600 nm, podczas gdy odchylenie standardowe intensywności fluorescencji wzrosło o 25%29. W zależności od gatunku intensywności fluorescencji wzrosły nawet w odpowiedzi na wcześniejsze wzbudzenie. Zagadnienie to wymaga dalszych badań.
Zastosowanie
Przyrząd L.I.F.E. przetestowano w różnych siedliskach, ze szczególnym uwzględnieniem otworów krio konitowych. Laser został z powodzeniem zastosowany w siedliskach glebowych i biofilmach ze względu na brak światła otoczenia podczas pomiaru. Granule krio konitowe można było zmierzyć, gdy warstwy osadów blokowały światło z dołu otworu (Rysunek 14A,C). Cienkie osadowe otwory krio konitowe były przepuszczalne dla rozproszonego światła z dołu (Rysunek 14B). Światło rozproszone zakłóca pomiar. W związku z tym stężenie pigmentów na powierzchniach czystego lodu nie jest jeszcze mierzalne w warunkach światła dziennego. Obecnie trwają prace nad przetwarzaniem sygnałów, aby umożliwić działanie systemu w warunkach silnego światła otoczenia.
Rycina 14: Otwór kriokonitowy z wodą w stanie ciekłym na powierzchni. (A) Kriokonit na lodowcu z tubą soczewkową L.I.F.E. Pasek skali = 70 mm. (B) Warstwa osadu (czerwona) jest bardzo cienka. Światło rozproszone przenika przez warstwę kriokonitu. (C) Warstwa osadu jest wystarczająco gruba, aby zablokować światło rozproszone z dołu. Ten typ otworu kriokonitowego jest mierzalny za pomocą instrumentu L.I.F.E. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Podsumowując, nasz instrument L.I.F.E. wykrył organizmy fotoautotroficzne w siedliskach lądowych, takich jak gleby, maty bakteryjne, biofilmy oraz w dziurach krio konitowych na powierzchniach lodowców. Cząsteczkami docelowymi były chla oraz B-PE. Rozdzielczość przestrzenna wynosiła 30 µm/px. Granica wykrywalności dla chla wynosiła 250 pg/mL, a dla B-PE 2 ng/mL. Po kalibracji laboratoryjnej byliśmy w stanie określić ilość pigmentów w próbkach pobranych z miejsca naszych badań w Arktyce. Do zautomatyzowanego procesu redukcji danych zastosowaliśmy autorskie oprogramowanie. Wpływ obecności minerałów oraz zmieniających się warunków oświetleniowych podczas pomiarów wymaga dalszych badań.
Wraz z ociepleniem klimatu wzrost temperatur prowadzi do zwiększonej dostępności wody w stanie ciekłym, co skutkuje wyższą aktywnością biologiczną na lodowych powierzchniach o charakterze autotroficznym i heterotroficznym. Należy podjąć intensywne wysiłki w celu wykrycia organizmów heterotroficznych in situ, aby uzyskać pełny obraz aktywnego życia w kriosferze. Można by to przetestować przy użyciu innych pigmentów docelowych i odpowiednich długości fal wzbudzenia laserowego. Zatem L.I.F.E. stanowi odpowiedni system monitoringu, zapewniający wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną dla warunków supraglacjalnych w kontekście globalnych zmian, a także potencjalnych zastosowań astrobiologicznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują pułkownikowi (IL) J.N. Pritzkerowi, Fundacji Tawani, USA, austriackiemu Federalnemu Ministerstwu Nauki, Badań i Gospodarki (Sparkling Science SPA04_149 i SPA05_201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), Austriackiemu Forum Kosmicznemu (ÖWF), Romanowi Erlerowi z Hintertuxer Natur Eis Palast, Austriackiemu Federalnemu Leśnictwu i Kierownikowi Bazy Nickowi Coxowi ze Stacji Arktycznej w Ny Alesund (Svalbard). Jesteśmy również wdzięczni Sabrinie Obwegeser, Carinie Rofner i Fabianowi Drewesowi za ich pomoc podczas kręcenia filmu. Na koniec chcemy podziękować Jamesowi Bradleyowi za udzielenie głosu w towarzyszącym mu filmie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| aceton | Merck | 67-64-1 | |
| B-Fikoerytryna | Invirtrogen | P6305 | |
| Chlorofil standard | Sigma-Aldrich | C6144-1MG | |
| formalina | Filtry Merck | HT501128 | 36% |
| GF/C | Whatman | WHA1822025 | Średnica 25mm |
| HCl | Merck | H1758 | 36,5-38% |
| L.I.F.E. | Prototyp Uniwersytetu w Innsbrucku | zbudowany na żądanie | |
| LabView | National Instruments | Software, Laboratorium Virtual Instrumentation Engineering Workbench | |
| Leucyna, L-[4,5-3H], 1 mCi | Perkin Elmer | NET1166001MC | radioaktywny |
| Płynny koktajl scyntylacyjny Beckman Ready Use | Beckman | nie jest bardziej dostępny, można go skompensować przez Ultra Gold, licznik scyntylacyjny cieczy Packard | |
| Beckman | brak w magazynie | LSC 6000 IC | |
| NaH14CO3 (4 &mikro; Ci/ml) | DHI Dania | 4 μ Ci/ml, 1 ml | radioaktywne |
| filtry poliwęglanowe Osmonics | DHI Dania | PCTE | o średnicy 25mm, 0,2µ m wielkość porów |
| Fiolki poliscyntylacyjne | Perkin Elmer | WHA1825047 | 20 ml |
| probówki na próbki | Sigma Aldrich | T2318-500EA | Probówki wirówkowe Greiner, 50 ml |
| Spektrofotometr | Hitachi | NA | Model U2001, dowolny fotometr do spektroskopii absorpcyjnej mierzący przy 664 nm i 750 nm byłby odpowiedni |
| kwas trójchlorowy octowy (TCA) | Merck | T6399 | 100% |
| sonda ultradźwiękowa | nano lab | QS1T-2 |
Bibliografia
- Boyd, E. S., Skidmore, M., Mitchell, A. C., Bakermans, C., Peters, J. W. Methanogenesis in subglacial sediments. Environmental Microbiology Reports. 2, 685-692 (2010).
- Sattler, B., Puxbaum, H., Psenner, R. Bacterial growth in supercooled cloud droplets. Geophysical Research Letters. 28, 239-242 (2001).
- Good, P., et al. A review of recent developments in climate change science. Part I: Understanding of future change in the large-scale climate system. Progress in Physical Geography. 35, 281-296 (2011).
- Fountain, A. G., et al. The Disappearing Cryosphere: Impacts and Ecosystem Responses to Rapid Cryosphere Loss. BioScience. 62, 405-415 (2012).
- Rignot, E., Mouginot, J., Morlighem, M., Seroussi, H., Scheuchl, B. Widespread, rapid grounding line retreat of Pine Island, Thwaites, Smith, and Kohler glaciers, West Antarctica, from 1992 to 2011. Geophysical Research Letters. 41, 3502-3509 (2014).
- McMillan, M., et al. Increased ice losses from Antarctica detected by CryoSat-2. Geophysical Research Letters. 41, 3899-3905 (2014).
- Barletta, V. R., et al. Glacier shrinkage and modeled uplift of the Alps. Geophysical Research Letters. 33, 14307(2006).
- Nuth, C., et al. Decadal changes from a multi-temporal glacier inventory of Svalbard. The Cryosphere. 7, 1603-1621 (2013).
- Takeuchi, N., Kohshima, S., Seko, K. Structure, formation, and darkening process of albedo-reducing material (cryoconite) on a Himalayan glacier: A granular algal mat growing on the glacier. Arctic Antarctic and Alpine Research. 33, 115-122 (2001).
- Takeuchi, N. Optical characteristics of cryoconite (surface dust) on glaciers: the relationship between light absorbency and the property of organic matter contained in the cryoconite. Annals of Glaciology. 34, 409-414 (2002).
- Anesio, A. M., Hodson, A. J., Fritz, A., Psenner, R., Sattler, B. High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle. Global Change Biology. 15, 955-960 (2009).
- Anesio, A. M., et al. Carbon fluxes through bacterial communities on glacier surfaces. Annals of Glaciology. 51, 32-40 (2010).
- Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E): In Situ Nondestructive Detection of Microbial Life in the Ice Covers of Antarctic Lakes. Astrobiology. 9, 659-672 (2009).
- Murray, A. E., et al. Microbial life at -13 °C in the brine of an ice-sealed Antarctic lake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20626-20631 (2012).
- Edwards, A., et al. A distinctive fungal community inhabiting cryoconite holes on glaciers in Svalbard. Fungal Ecology. 6, 168-176 (2013).
- Miteva, V. Bacteria in Snow and Glacier Ice. Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology. Margesin, R., Schinner, F., Marx, J. C., Gerday, C. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin/Heidelberg, Germany. 31-50 (2008).
- Yallop, M. L., et al. Photophysiology and albedo-changing potential of the ice algal community on the surface of the Greenland ice sheet. The ISME Journal. 6, 2302-2313 (2012).
- Edwards, A., et al. A metagenomic snapshot of taxonomic and functional diversity in an alpine glacier cryoconite ecosystem. Environmental Research Letters. 8, 035003(2013).
- Remias, D., et al. Characterization of an UV-and VIS-absorbing, purpurogallin-derived secondary pigment new to algae and highly abundant in Mesotaenium berggrenii (Zygnematophyceae, Chlorophyta), an extremophyte living on glaciers. FEMS Microbiology Ecology. 79, 638-648 (2012).
- Cook, J., et al. An improved estimate of microbially mediated carbon fluxes from the Greenland ice sheet. Journal of Glaciology. 58, 1098-1108 (2012).
- Mueller, D. R., Vincent, W. F., Pollard, W. H., Fritsen, C. H. Glacial cryoconite ecosystems: a bipolar comparison of algal communities and habitats. Nova Hedwigia Beiheft. 123, 173-198 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Huner, N. P. A. Adaptation and Acclimation of Photosynthetic Microorganisms to Permanently Cold Environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, 222-252 (2006).
- Hodson, A., et al. The cryoconite ecosystem on the Greenland ice sheet. Annals of Glaciology. 51, 123-129 (2010).
- Tilg, M., et al. L.I.F.E.: laser induced fluorescence emission, a non-invasive tool to detect photosynthetic pigments in glacial ecosystems. Proceedings SPIE. 8152, Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology XIV, 81520I. , (2011).
- Lorenzen, C. J. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations. Limnology & Oceanography. 12, 343-346 (1967).
- Kirchman, D. Measuring bacterial biomass production and growth rates from leucine incorporation in natural aquatic environments. Methods in Microbiology. , 227-238 (2001).
- Bell, R. T. Estimating production of heterotrophic bacterioplankton via incorporation of tritiated thymidine. Handbook of methods in aquatic microbial ecology. Edited by. Kemp, P. F., Cole, J. J., Sherr, B. F., Sherr, E. B. , CRC press. Boca Raton, FL. 495-503 (1993).
- Groemer, G., et al. Field trial of a dual-wavelength fluorescent emission (L.I.F.E.) instrument and the Magma White rover during the MARS2013 Mars analog mission. Astrobiology. 14, 391-405 (2014).
- Beutler, M. Spectral fluorescence of chlorophyll and phycobilins as an in situ tool of phytoplankton analysis-models, algorithms and instruments. , Christian-Albrechts Universität Kiel. Doctoral dissertation (2003).
- Krogmann, K. D. Discoveries in Oxygenic Photosynthesis (1727-2003): A Perspective. Photosynthesis Research. 80, 15-57 (2004).
- Corrêa, D. S., et al. Reverse saturable absorption in chlorophyll A solutions. Journal of Applied Physics B. 74, 559-561 (2002).
- Kaňa, R., et al. The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).
Przedruki i uprawnienia
