Artykuł metodologiczny

Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60449

⸱

9 stycznia 2020

 ,  , 
1Biodynamics Research Center (BDR), RIKEN, 2Research Center, Misr International University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS), która jest w stanie osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki. Spektroskopia Ramana może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowej na leki, podczas gdy stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do ukierunkowanej i ilościowej analizy wychwytu i metabolizmu leków.

Streszczenie

Wiadomo, że komórki są z natury niejednorodne w swoich reakcjach na leki. Dlatego tak ważne jest, aby w badaniach nad odkrywaniem leków uwzględnić heterogeniczność pojedynczych komórek. Można to osiągnąć poprzez dokładny pomiar mnogości interakcji komórkowych między komórką a lekiem na poziomie pojedynczej komórki (tj. wychwytu leku, metabolizmu i efektu). W artykule opisano jednokomórkową platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS) do monitorowania zmian metabolicznych komórek w odpowiedzi na leki. Korzystając z tej platformy, zmiany metaboliczne w odpowiedzi na lek można zmierzyć za pomocą spektroskopii Ramana, podczas gdy lek i jego metabolit można określić ilościowo za pomocą spektrometrii mas w tej samej komórce. Wyniki sugerują, że możliwy jest dostęp do informacji na temat wychwytu, metabolizmu i odpowiedzi na leki na poziomie pojedynczej komórki.

Wprowadzenie

Komórki różnie reagują na zmiany w swoim mikrośrodowisku na poziomie pojedynczej komórki, zjawisko określane jako niejednorodność komórkowa1. Mimo to, obecne badania nad odkrywaniem leków opierają się na średnich pomiarach populacji komórek, które zaciemniają informacje o potencjalnych subpopulacjach, a także o odmianach pojedynczych komórek2. Ten brakujący dostęp do informacji może wyjaśniać, dlaczego niektóre komórki są bardziej podatne na leki, podczas gdy inne są oporne. Co ciekawe, brak informacji o reakcji pojedynczej komórki na lek jest możliwą przyczyną niepowodzenia badań klinicznych fazy II leków3. Dlatego, aby rozwiązać ten problem, interakcje komórkowe z lekiem (tj. wychwyt, metabolizm i odpowiedź) muszą być mierzone na poziomie pojedynczej komórki.

Aby to osiągnąć, zaprojektowaliśmy unikalny system, w którym żywe pojedyncze komórki są badane za pomocą bezznacznikowej spektroskopii Ramana, a następnie dalej charakteryzowane za pomocą spektrometrii mas4. Spektroskopia Ramana zapewnia molekularny odcisk palca stanu komórkowego, złożonego widma wynikającego z udziału wielu cząsteczek wewnątrz komórki. Pomimo tej złożoności można uznać, że ramanowskie odciski palców odzwierciedlają strukturę i metabolizm całej komórki5,6. Spektroskopia Ramana doskonale radzi sobie z pomiarem stanów komórkowych w sposób nieinwazyjny i stosunkowo wysokoprzepustowy, co czyni ją przydatną do badań przesiewowych i oceny odpowiedzi na leki na poziomie pojedynczej komórki.

Natomiast MS zapewnia wymaganą czułość i selektywność do pomiaru wychwytu leku na poziomie pojedynczej komórki. Ponieważ stwardnienie rozsiane jest destrukcyjne (próbka [komórka] jest zwykle zużywana podczas analizy), zintegrowanie jej z nieniszczącą, bezznacznikową spektroskopią Ramana może zapewnić wysoką przepustowość i czułość systemu. Ta połączona platforma jest w stanie dostarczyć więcej informacji na temat wchłaniania leków, metabolizmu i efektów na poziomie pojedynczej komórki.

Ten manuskrypt wyjaśnia protokół używany do badania interakcji komórkowych z lekami na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu kultur in vitro za pomocą zintegrowanej platformy Raman-MS. W tym celu jako model wykorzystuje się komórki raka wątrobowokomórkowego (HepG2) i tamoksyfen. Komórki HepG2 zostały wybrane, ponieważ pobierają tamoksyfen i metabolizują lek, a jednocześnie są dotknięte ze względu na jego działanie hepatotoksyczne. W tym manuskrypcie użyto dwóch stanów: komórki leczone lekami vs. komórki nieleczone (kontrola).

Protokół

1. Hodowla komórkowa

  1. Hodowla komórek będących przedmiotem zainteresowania w odpowiedniej pożywce hodowlanej. W celu uniknięcia zanieczyszczenia można dodać penicylinę i streptomycynę. W przypadku komórek HepG2, komórki hodowlane w pożywce zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 0,1% penicyliny-streptomycyny. Aby ułatwić pomiary spektroskopii Ramana, komórki można hodować na 0,1% pokrytym żelatyną naczyniu ze szklanym dnem lub szkiełkach kwarcowych.
  2. Inkubować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  3. Synchronizuj kultury komórkowe, aby osiągnąć 70% konfluencji.
  4. Subkultura komórek do naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm lub szkiełek kwarcowych przy użyciu tego samego podłoża przy gęstości wysiewu 0,7 x 106, a następnie inkubacja w temperaturze 37 °C przez 24 godziny
    UWAGA: Szalki lub szkiełka hodowlane mogą być wstępnie pokryte kolagenowym lub żelatynowym roztworem powlekającym o stosunku powierzchni hodowli 5 ug/cm2, aby umożliwić im utrwalenie, zapewniając ich przetrwanie podczas pomiaru.

2. Leczenie odwykowe

  1. Wyjąć kultury komórkowe z inkubatora i przemyć 2x wstępnie podgrzanym buforem PBS (37 °C).
    UWAGA: Optymalne jest usuwanie komórek do leczenia farmakologicznego przy zbieganiu 50%-60%.
  2. Podziel komórki na podgrupy leczone i nieleczone w 35-milimetrowych szalkach hodowlanych.
  3. Wymieszaj wybrany lek z pożywką hodowlaną. Na przykład tamoksyfen rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO) i wymieszać z pożywką hodowlaną, aby uzyskać końcową objętość 2 ml i stężenie tamoksyfenu 10 μM. Będzie to grupa leczona farmakologicznie.
  4. Wymieszać odpowiednią objętość rozpuszczalnika (DMSO) z pożywką jako kontrolę w celu zbadania działania DMSO. Będzie to grupa kontrolna.
  5. Inkubować obie grupy w 2 ml pożywki z dodatkiem dodatków przygotowanych w krokach 2.3-2.4 przez 24 godziny. Oczekiwana konfluencja po inkubacji powinna wynosić 70%-80%.

3. Obrazowanie spektralne Ramana i przetwarzanie spektralne

UWAGA: Chociaż systemy spektroskopii Ramana są dostępne na rynku, system spektroskopii Ramana używany tutaj to domowy mikroskop konfokalny ze skanowaniem liniowym, wcześniej opisany7,8. Krótko mówiąc, system ten jest wyposażony w laser na ciele stałym pompowany diodą o długości fali 532 nm. Światło lasera jest kształtowane w płaszczyznę za pomocą cylindrycznej soczewki, która umożliwia pomiar 400 widm podczas jednej ekspozycji. Widma Ramana zarejestrowano za pomocą chłodzonej kamery CCD zamontowanej na polichromatorze, który wykorzystuje siatkę 1200 rowków/mm, aby zmaksymalizować rozdzielczość spektralną obszaru odcisku palca (od 500 do 1 800 cm-1). Ten obszar widmowy zawiera wysoką gęstość częstotliwości specyficznych dla cząsteczek, które generują rozpraszanie Ramana. Stosowana jest również soczewka obiektywowa zanurzona w wodzie (NA = 0,95). Rozdzielczość przestrzenna tego układu wynosi ~300 nm, a rozdzielczość spektralna to 1 cm-1. Aby zapewnić przeżycie komórek podczas eksperymentu, stosuje się mikrokomorę przymocowaną do zmotoryzowanego stolika mikroskopu.

  1. Przed pomiarami spektralnymi sprawdź ustawienie optyki. Otwór otworkowy o średnicy 50 μm może być użyty do sprawdzenia, czy otwór otworkowy i pozycja lasera są dokładnie zgodne. Wejdź w szczelinę spektrofotometru, gdy jest zwężona tak bardzo, jak to możliwe.
  2. Użyj etanolu do kalibracji spektrofotometru przed każdym eksperymentem. Aby to zrobić, umieść EtOH w naczyniu ze szklanym dnem, zmierz widmo przy danym natężeniu lasera (mierzonym na próbce) przez 1 s i powiąż pik ze znanymi długościami fal7.
  3. Zminimalizuj intensywność lasera na próbce do ~2,4 mW/μm2, aby komórki przetrwały ekspozycję na laser.
  4. Ustawić mikrokomorę na 5% CO2 i 37 °C.
  5. Gdy system mikroskopowy jest gotowy, wyjmij komórki z inkubatora i natychmiast przepłucz komórki 2x podgrzanym buforem PBS (37 °C), a następnie dodaj 2 ml podgrzanego PBS (37 °C) lub DMEM w celu ponownego zawieszenia komórek.
    UWAGI: Zarówno pożywki oparte na PBS, jak i FluoroBrite DMEM są wystarczającymi opcjami do pomiarów spektroskopii Ramana, ponieważ wytwarzają minimalny sygnał tła.
  6. Dodać 10 μl wody do soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie i delikatnie umieścić miskę ze szklanym dnem na stoliku mikroskopu.
  7. Zmierz każdą komórkę, ustawiając ostrość na linii lasera. Czas naświetlania wynoszący 15 s na komórkę jest tutaj wystarczający do uzyskania przekroju poprzecznego komórki z wyraźnym sygnałem Ramana. Lustro galwanowe pozwala na zeskanowanie jednej komórki lub grupy komórek w ciągu kilkudziesięciu minut.
    UWAGI: Wyższa rozdzielczość pełnego obrazowania spektralnego komórek wymaga więcej czasu i może prowadzić do fotouszkodzenia. W tym przypadku komórki mierzono za pomocą ekspozycji jednoliniowej, aby uzyskać przekrój każdej komórki. Takie podejście jest dobrym kompromisem w celu zwiększenia przepustowości i uzyskania informacji wystarczających do rozróżnienia komórek, przy jednoczesnym zapewnieniu żywotności komórek poprzez ograniczenie fotouszkodzeń.

4. Wstępne przetwarzanie danych spektralnych i analizy wielowymiarowe

UWAGA: Wstępne przetwarzanie jest niezbędnym krokiem przed dodatkową analizą w celu usunięcia niechcianych zmian technicznych w danych spektralnych. Ze względu na różnorodność metod i oprogramowania, nie można podać wyczerpującej listy, a w literaturze można znaleźć wiele pomocnych recenzji7,8. W tej sekcji pokrótce opisujemy podejście stosowane do analizy i interpretacji spektralnych danych ramanowskich uzyskanych z żywych pojedynczych komórek.

  1. Wyodrębnij i wstępnie przetwórz obrazy Ramana, aby usunąć możliwe zakłócenia promieniowania kosmicznego.
    UWAGA: Oś spektralna widm uzyskanych w różnych dniach/tygodniach/miesiącach może zawierać pewne różnice wynikające z niewielkich różnic technicznych podczas kalibracji przy użyciu etanolu. Będzie to miało duży wpływ na późniejsze analizy wielowymiarowe i porównania statystyczne. W przypadku, gdy eksperymenty są przeprowadzane w różnych tygodniach/miesiącach, spodziewane są niewielkie różnice optyczne. W takim przypadku dane muszą być interpolowane, aby skorygować ewentualne przesunięcia spektralne danych w eksperymentach. W tym przypadku stosowana jest interpolacja za pomocą splajnu sześciennego. Po tym kroku wszystkie osie widm powinny być wyrównane. Do późniejszej analizy brany jest pod uwagę zakres 500-1 800 cm-1.
  2. Wyodrębnij dane spektralne komórek i tła (brak komórek) z każdego obrazu za pomocą domowego algorytmu. Odejmij sygnał tła od sygnału komórki. Następnie uśrednij widma pozostałych pikseli, które powinny odpowiadać pojedynczej komórce. Poniższe kroki są wykonywane przy użyciu widm 2D komórek.
  3. Wykonaj korektę linii bazowej przy użyciu klasy ModPoly9 lub dowolnego innego algorytmu, który oszacował jako wystarczająco pasujący. Przytnij zakres widmowy do 600-1,700 cm-1, aby wybrać obszar odcisku palca i upewnić się, że nie ma niepożądanych efektów krawędzi widm z powodu złego dopasowania wielomianu.
  4. Wykonaj krok normalizacji, taki jak normalizacja wektora (intensywność dla każdej liczby falowej jest dzielona przez globalną normę l2 lub maksymalną pojedynczą wartość widma), aby znormalizować intensywność widma10, chociaż można rozważyć inne normalizacje.
  5. Przygotuj zestaw danych z odpowiednią etykietą dla każdej klasy/warunku.
    UWAGA: Porównawcze analizy spektralne mogą być perforowane w celu zbadania charakteru możliwych różnic między klasą/warunkami komórek (np. poprzez odjęcie średniego widma grupy kontrolnej innym grupom w celu zidentyfikowania obszarów zainteresowania [takich jak potencjalne biomarkery]). Można również wykonać obliczenia wyników ANOVA i Fishera10.
  6. Aby zidentyfikować komórki poddane działaniu substancji i niepoddane działaniu substancji na podstawie cech spektralnych, można zastosować analizy wielowymiarowe. Znormalizowane dane spektralne powinny być używane jako zestaw danych treningowych, a nieznany zestaw danych (bez etykiety) z eksperymentu replikowanego powinien być używany jako dane testowe, jeśli to możliwe.
    UWAGA: Analiza dyskryminacyjna przeprowadzana na niektórych wektorach analizy składowych głównych (PCA-DA10), projekcja na wyniki utajone, a następnie analiza dyskryminacyjna (PLS-DA) oraz maszyny wektorów nośnych (SVM)11 są modelami często używanymi w terenie, a każdy z nich przedstawia inne rozważania statystyczne. W związku z tym należy przeprowadzić wstępne przetwarzanie danych.
  7. Korzystaj z uczenia maszynowego, które pasuje do celów eksperymentu. W tym przypadku projekcja na model struktury utajonej (PLS) jest budowana przy użyciu spektralnego obszaru odcisku palca widm Ramana (600-1,710 cm-1)11,12. W razie potrzeby wyśrodkuj dane średnio. Do krzyżowej walidacji modelu można zastosować różne techniki.
    UWAGA: W tym przypadku stosowana jest walidacja krzyżowa żaluzji weneckiej z 10 podziałami. Złożoność modelu (liczba komponentów lub zmienna utajona) powinna być testowana tak, aby najlepszy model minimalizował wartość błędu średniokwadratowego (RMSE). Okazało się, że trzy wektory utajone (LV) zapewniają najlepszą dyskryminację w naszym zbiorze danych.
  8. Określ, które piki widmowe Ramana przyczyniają się do dyskryminacji komórek (np. poprzez wykreślenie wyniku o zmiennym znaczeniu w projekcji [VIP] dla każdej liczby falowej Ramana lub wielkości współczynnika regresji).
    UWAGI: Wynik VIP zmiennej jest obliczany jako ważona suma kwadratów korelacji między składnikami PLS-DA a oryginalną zmienną. Szczegóły dotyczące algorytmu punktacji PLS i VIP można znaleźć w literaturze11,12.

5. Konfiguracja i procedury próbkowania z pojedynczej komórki

  1. Zamocuj system pobierania próbek komórek na mikroskopie Ramana, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Podłącz mikromanipulator 3D do szklanego uchwytu kapilary, który jest przymocowany do pustej strzykawki w celu odsysania próbki poprzez zastosowanie podciśnienia (Rysunek 1).
  2. Ustaw mikroskop na pole o dużym powiększeniu (40x), aby obserwować końcówkę szklanej kapilary i upewnić się, że nie jest uszkodzona. Kontroluj położenie szklanej kapilary za pomocą mikromanipulatora (osie x, y, z). Upewnij się, że końcówka kapilary jest wyśrodkowana w polu view, a następnie przesuń kapilatę w górę na osi z, aby później uzyskać wolny odstęp dla szalki hodowlanej.
    UWAGA: Mikropróbkowanie komórek jest wykonywane przez szklaną kapilarnę dla komórek o średnicy 10-15 μm. Zalecana jest kapilara o wielkości otworu ~5 μm. Jeśli rozmiar otworu jest zbyt mały, końcówka kapilary zostanie zatkana przez ogniwo, a jeśli jest zbyt duża, czułość późniejszych pomiarów MS może być zagrożona.
  3. Umieść płytkę/szalkę z próbką na stoliku mikroskopu, wyreguluj powiększenie i ostrość, wybierz komórkę docelową na szalce siatkowej i przesuń ją do środka view. Następnie ostrożnie opuść szklaną kapilarnę za pomocą mikromanipulatora (oś z), aż końcówka znajdzie się w ostrości.
    UWAGA: Pamiętaj, aby nie przesuwać kapilary w osiach x i y, dopóki kapila nie będzie ostra.
  4. Pod obserwacją mikroskopową dotknij docelowej pojedynczej komórki końcówką kapilarną, a następnie zacznij wywierać podciśnienie za pomocą strzykawki, aby uwięzić komórkę wewnątrz końcówki kapilarnej. Nagraj tę procedurę, robiąc zdjęcie lub nagrywając film, aby w razie potrzeby dokładnie sprawdzić czas i miejsce zasysania komórki.
  5. Przesuń kapilę w górę na osi z. Następnie odłącz kapilarnę od uchwytu kapilary za pomocą kleszczy, przygotowując się do analizy stwardnienia rozsianego.

6. Pomiary spektrometrii mas

  1. Skalibrować dokładność masy przyrządu MS zgodnie z zaleceniami producenta. Po kalibracji upewnij się, że błąd masy nie jest większy niż 3 ppm.
  2. Zoptymalizuj przyrząd MS do parametrów, które najlepiej pasują do interesującego analitu.
    UWAGA: W przypadku analizy tamoksyfenu i 4-OHT parametry przyrządu są ustawione na następujące: temperatura kapilary na wlocie: 400 °C, napięcie natrysku: 1500 V, cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC): 5.00E+06, poziom RF soczewki S: 90%, zakres SIM: 347-397 m/z, maksymalny czas wstrzykiwania karty SIM: 200 ms, rozdzielczość karty SIM: 140 000 FWHM, zakres MS/MS: 50-400 m/z, cel MS/MS AGC: 2,00E+05, maksymalny czas wtrysku MS/MS: 100 ms, rozdzielczość MS/MS: 17 500 FWHM, okno izolacji MS/MS: 1 m/z, znormalizowana energia zderzenia MS/MS (NCE): 35.
  3. Skonfiguruj metodę automatycznego wykrywania o czasie trwania 5 minut dla trybu SIM w celu uzyskania względnej oceny ilościowej oraz inną metodę MS/MS w celu pozytywnej identyfikacji leku i jego metabolitu. Parametry metody akwizycji powinny być ustawione na zoptymalizowane wartości wymienione w kroku 6.2.
  4. Przygotować rozpuszczalnik jonizacyjny pod wyciągiem. Skład rozpuszczalnika zależy od interesującego analitu. W tym przypadku zastosowany rozpuszczalnik organiczny składa się z 80% MeOH, 10% DMSO i 0,1% kwasu mrówkowego.
  5. Przed pomiarami zmieszać odpowiedni wzorzec wewnętrzny z rozpuszczalnikiem organicznym. W tym eksperymencie 5,31 nM d5-tamoksyfenu jest używane jako wzorzec wewnętrzny.
  6. Aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich, należy odessać pożywkę otaczającą komórki traktowane lekiem za pomocą kapilary o wielkości otworu 1 μm ze stałą obserwacją mikroskopową, aby uniknąć pobierania próbek z jakichkolwiek części komórkowych.
  7. Dodać 2 μl rozpuszczalnika jonizacyjnego do szerokiego końca kapilary zawierającej podłoże za pomocą pipety przymocowanej do końcówek ładowarki. Następnie przeanalizować próbkowane pożywki za pomocą MS, sprawdzić obecność interesującego analitu (zwykle nie powinien być wykrywalny).
  8. Dodać 2 μl rozpuszczalnika jonizacyjnego do kapilary zawierającej komórkę, przymocować kapilar do adaptera nano-elektrorozpylania (nano-ESI) podłączonego do odpowiedniego spektrometru mas i uruchomić metodę automatycznej akwizycji.

7. Przetwarzanie i analiza danych spektrometrii mas

UWAGA: Do przeprowadzenia analizy danych można użyć dowolnego odpowiedniego oprogramowania. Jeśli jednak badacze chcą przeprowadzić analizę danych przy użyciu oprogramowania, które nie jest dostarczane przez dostawcę MS, wówczas surowe dane powinny zostać najpierw przekonwertowane z zastrzeżonego formatu dostawcy na format otwarty lub jako plik tekstowy (co zostało zrobione tutaj).

  1. Znormalizować dane, dzieląc obszar piku analitu będącego przedmiotem zainteresowania przez obszar wzorca wewnętrznego z tego samego skanowania MS. Następnie log przekształć współczynniki szczytów, aby zmniejszyć skośność.
  2. Wykreśl znormalizowaną intensywność leku lub jego metabolitu jako wykres pudełkowy lub krzywą gęstości, aby zobrazować rozkład w pojedynczych komórkach. W tym przypadku używane jest oprogramowanie statystyczne R wraz z pakietem ggplot2.
  3. Obliczyć stosunek metabolizowanego leku do niezmetabolizowanego leku, dzieląc obfitość metabolitu leku przez ilość niezmetabolizowanej cząsteczki rodzicielskiej w każdej komórce (tj. odpowiednio 4-OHT i tamoksyfenu.
    UWAGA: Można badać korelację między zmianami określonych pików Ramana będących przedmiotem zainteresowania a zmianami pików SM leku lub jego metabolitów. Jest to dodatek do możliwej korelacji między samym lekiem a jego metabolitem w pojedynczych komórkach. Można to zrobić, obliczając współczynnik korelacji Pearsona za pomocą testu dwustronnego. Należy również rozważyć bardziej zaawansowane podejścia integracyjne.

Wyniki

Analiza interakcji leków (wchłaniania, metabolizmu i efektów) na poziomie pojedynczych komórek jest niezbędna do wykrycia ukrytych lub opornych na leki subpopulacji, a także do zrozumienia wpływu heterogeniczności komórkowej. W niniejszym protokole wykorzystano dwie komplementarne techniki do pomiaru wspomnianych interakcji w pojedynczych komórkach: spektroskopię Ramanowską oraz MS. Spektrometria Ramanowska pozwala na szybką identyfikację komórek pod wpływem leków w oparciu o spektralne biomarkery odpowiedzi na lek. MS jest wykorzystywana do monitorowania wchłaniania i metabolizmu leku w sposób selektywny i półilościowy. Komórki były najpierw przesiewane za pomocą spektroskopii Ramanowskiej, a następnie pobierane indywidualnie do analizy metodą MS.

Porównawcza analiza średniego widma dla każdego stanu (z lekiem i bez leku) przedstawiona jest na Rysunku 2. Uśrednione widma dwóch stanów wyraźnie różnią się w kilku pikach, które zostały wcześniej zidentyfikowane i przypisane do konkretnych związków molekularnych2. W szczególności silne różnice występują w pikach przy 1000 cm- (przypisanych do związków aromatycznych, takich jak fenyloalanina i tyrozyna). Istotność różnic statystycznych powinna zostać oceniona za pomocą dalszych analiz wielowymiarowych.

Zbiór danych wykorzystano następnie do wytrenowania modelu PLS (kroki 4.5-4.8) mającego na celu rozróżnienie dwóch wariantów traktowania komórek (z lekiem: n = 290, bez leku: n = 115). Zdolność prognostyczna w klasyfikacji komórek hodowanych w obecności tamoksyfenu osiągnęła 100% czułości i 72% swoistości w danych testowych (nieznanych dla modelu wytrenowanego z walidacją krzyżową). Czułość jest miarą wyników prawdziwie dodatnich, które zostały poprawnie zidentyfikowane przez model, natomiast swoistość jest miarą rzeczywistych wyników ujemnych zidentyfikowanych przez model. Alternatywne modele, takie jak SVM, LDA i sieci neuronowe, mogą dawać podobne lub lepsze wyniki, choć w niniejszym badaniu nie przeprowadzono kompleksowego porównania.

Na podstawie modelu PLS obliczono wartości VIP, które reprezentują znaczenie długości fal (przesunięć ramanowskich) w rozróżnianiu warunków eksperymentalnych (Rysunek 3). Co istotne, najwyższe piki profilów VIP odpowiadały piki ramanowskim, dla których zaobserwowano wyraźne różnice między dwiema grupami traktowanymi. Potwierdziło to specyficzne różnice molekularne między komórkami traktowanymi a nietraktowanymi. W konsekwencji badacze mogą zidentyfikować potencjalne biomarkery spektralne, które odzwierciedlają odpowiedź pojedynczych komórek na leczenie farmakologiczne. Biomarkery te mogą być poddane dalszym badaniom w celu weryfikacji ich znaczenia biologicznego oraz możliwości generalizacji wyników w różnych warunkach i liniach komórkowych.

System spektrometrii mas pojedynczych żywych komórek (LSC-MS) pozwolił na wykrycie zarówno leku, jak i jego metabolitów w pojedynczych, traktowanych lekiem komórkach HepG2, które wcześniej poddano pomiarom za pomocą spektroskopii Ramanowskiej. Ponadto zastosowano tandemową spektrometrię mas (MS/MS) w celu potwierdzenia struktury obu cząsteczek. Po pozytywnej identyfikacji zmierzono względną zawartość leku oraz jego metabolitów w każdej komórce i porównano je z pikami tła w komórkach nietraktowanych. Zaobserwowano silną zmienność zawartości tamoksyfenu, a zjawisko to było jeszcze bardziej wyraźne w przypadku jego metabolitu, 4-OHT (Rysunek 4). Zbadano również zależność między zawartością tamoksyfenu a jego metabolitami, wykazując istotną dodatnią korelację między nimi (r = 0,54, p = 0,0001, n = 31).

Układ mikroskopowy ze stereomikroskopem i trójwymiarowym mikromanipulatorem do precyzyjnej manipulacji próbkami w badaniach.
Rycina 1: System do pobierania pojedynczych komórek zamontowany na stoliku mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres spektroskopii Ramanowskiej, intensywność w funkcji przesunięcia, porównanie efektów działania leku, analiza spektroskopowa.
Rysunek 2: Uśrednione widmo komórek leczonych lekiem (z tamoksyfenem: n = 295) oraz komórek nieleczonych (bez tamoksyfenu: n = 115). Pików Ramanowskich można zidentyfikować na podstawie literatury. Większość silnych różnic spektralnych jest istotna statystycznie (ANOVA, p ≤ 0.5), jak opisano wcześniej4. Rysunek ten został zmodyfikowany z wcześniejszej publikacji4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres spektroskopii Ramanowskiej; wynik VIP względem przesunięcia Ramanowskiego; piki białek i lipidów, analiza spektralna.
Rysunek 3: Wyniki VIP wyekstrahowane z predykcyjnego modelu PLS. Wyniki VIP odzwierciedlają długości fal, które przyczyniają się do rozróżnienia dwóch klas w modelu. Większość pików odpowiada konkretnym cząsteczkom, które są obserwowane jako biomarkery spektralne efektów działania leków w komórkach poddanych leczeniu. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie wcześniejszej publikacji4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres pudełkowy porównujący wpływ traktowania na znormalizowaną obfitość w próbkach biologicznych.
Rysunek 4: Rozkład obfitości tamoksyfenu i jego metabolitu. Rozkład obfitości tamoksyfenu oraz jego metabolitu, 4-OHT (mierzonej na poziomie pojedynczych komórek) w porównaniu do pików endogennych w komórkach nietraktowanych (kontrola). Rysunek ten został zmodyfikowany z wcześniejszej publikacji4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym manuskrypcie wybrano prosty przypadek, w którym komórki HepG2 były narażone (lub nie) na tamoksyfen. Wykazano zdolność systemu spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do monitorowania wpływu tamoksyfenu na komórki. Spektroskopia Ramana pozwoliła na identyfikację potencjalnych biomarkerów, które odzwierciedlały ogólną reakcję pojedynczych komórek na ekspozycję na lek. Zaobserwowano pewną niejednorodność między pojedynczymi komórkami, co sugeruje, że niektóre komórki nie reagowały na ekspozycję na lek. Z drugiej strony, LSC-MS był w stanie przeprowadzić ukierunkowaną analizę leku i jego metabolitu na poziomie pojedynczej komórki, w której zaobserwowano wysoki stopień niejednorodności leku i obfitości jego metabolitów. Ta heterogeniczność pomaga wyjaśnić, dlaczego niektóre komórki są dotknięte lekiem, podczas gdy inne pozornie nie, pomimo komórek pochodzących z rzekomo jednolitejpopulacji12.

Wśród szczególnych aspektów tej techniki, które wymagają uwagi, ważna jest ocena jakości ustawienia mikroskopu i przetwarzania sygnału w celu zapewnienia odtwarzalności danych. Jeśli wstępne przetwarzanie widm jest wykonywane ostrożnie, zmiany sygnału powinny być maksymalizowane przy lokalnym maksimum każdego piku. Natomiast linia bazowa i krawędź widm powinny pokrywać się między badanymi warunkami komórkowymi. Innym ważnym aspektem jest model wielowymiarowy wykorzystywany do badania różnic między terapiami. Należy dokładnie ocenić modele i parametry modelu, aby zapewnić precyzyjną i dokładną analizę. Jedną z zalet modelu PLS, w przeciwieństwie do sieci neuronowych, jest to, że umożliwia on dostęp do wag związanych z każdą długością fali (przesunięcia Ramana), które najlepiej odróżniają warunki testowane przez model.

Pomimo tego, że spektroskopia Ramana skutecznie rozróżnia odpowiedź na lek, należy podkreślić, że zastosowanie tej techniki jest ograniczone w celu zapewnienia interpretacji biologicznej. Wynika to głównie ze złożoności sygnału spektralnego, który obejmuje mieszaninę tysięcy cząsteczek. W związku z tym konieczne są dalsze badania, aby ocenić systematyczne zmiany między intensywnościami widmowymi Ramana a zmianami stężeń leków. Również podobne badania innych linii komórkowych są wymagane w celu oceny uogólnienia biomarkerów spektralnych związanych z tamoksyfenem.

Ponadto interesujące może być wykonanie pomiarów żywych tkanek w celu oceny farmakodynamiki i zbadania, w jaki sposób leki przenikają i przepływają w każdej komórce. Ponadto należy zauważyć, że etap pobierania próbek w LSC-MS jest w dużym stopniu zależny od umiejętności operatora. Parametry takie jak rozdzielczość przestrzenna, położenie komórki wewnątrz kapilary po pobraniu próbek i siła przepustowości są całkowicie zależne od operatora, co ogranicza zastosowanie LSC-MS na dużą skalę. Chociaż zautomatyzowane systemy pobierania próbek mogą złagodzić ten problem. Ponadto, podczas gdy LSC-MS doskonale radzi sobie z próbkowaniem przylegających lub pływających komórek w ich natywnych stanach, gorzej radzi sobie z próbkowaniem komórek osadzonych w skrawkach tkanki. Wynika to z tendencji końcówki kapilarnej do pobierania próbek do pękania, jeśli gęstość próbki jest wysoka. Dlatego inne podejście, takie jak pojedyncza sonda, może być bardziej odpowiednie w takich przypadkach14,15.

Ponieważ użyte tutaj komórki są próbkowane w warunkach otoczenia przy minimalnym przygotowaniu próbki, LSC-MS można łatwo zintegrować z innymi technologiami, o czym świadczy jego integracja z Ramanem w tym protokole. Inna podobna integracja z holografią 3D pozwoliła na osiągnięcie bezwzględnej kwantyfikacji metabolitów komórkowych na poziomie subkomórkowym16. Ponadto integracja z cytometrią przepływową pozwoliła na odkrycie biomarkerów metabolicznych w pojedynczych krążących komórkach nowotworowych pacjentów z rakiem nerwiakazarodkowego 17,18.

W przyszłości, ze względu na niedawne rosnące zainteresowanie łączeniem zestawów danych z modalności obrazowania19, interesujące może być również badanie systematycznych zmian między sygnałami Ramana a wynikami spektrometrii mas (a także innymi metodami omicznymi) przy użyciu integracyjnych podejść obliczeniowych. Co ciekawe, znaleźliśmy już kilka słabych, ale istotnych korelacji liniowych między intensywnością pików Ramana identyfikowanych za pomocą wyników VIP a obfitością tamoksyfenu lub jego metabolitu na poziomie pojedynczej komórki, jak zidentyfikowano za pomocą MS4. Dane te mogą sugerować związek metaboliczny między profilami SM a widmami Ramana oraz możliwość przewidywania tych wartości.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Toshio Yanagidzie za wsparcie i wewnętrzne fundusze RIKEN przypisane dr Arno Germondowi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% penicylina-streptomycynaNacalai Tesque09367-34
35mm szklana dolna naczynie siatkowaMatsunami
4-Hydroxy Tamoksyfen standardSigma-Aldrich94873
532 nm pompowany diodą laser na ciele stałymVentus, Laser Quantum
BIOS-L101T-S zmotoryzowany stolik mikroskopowyOptoSigma
Kapilary do pobierania próbek z powłoką celomiczną CT-2HUMANIX
d5-Tamoksyfen standardCambridge Isotope Laboratories
Dimetylosulfotlenek LC-MS klasyNacalai TesqueD8418
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's mediumSigma-AldrichD5796
Eppendorf GELoaderkiEppendorf
płodowa surowica bydlęcaLaboratoria hyklonówSH3006603
FluoroBrite DMEMThermo Fisher Scientific
Kwas mrówkowy LC-MS klasySigma-Aldrich33015
Linia komórkowa HepG2 (RCB1886)Centrum banku komórek RIKENRCB1886
Inkubator MC0-19A1CSanyo Electric Co.MC0-19A1C
Metanol LC-MS klasySigma-Aldrich1060352500
MMO-203 3-D MikromanipulatorNarshigeMMO-203
NA:0,95, UPL40 zanurzenie w wodzie Soczewka obiektywu OlympusAdapter Olympus
Nanoflex nano-ESIThermo Fisher ScientificES071
Inkubator nastawniczyibidi
Rozwiązanie kalibracyjne Pierce LTQ Velos ESIThermo Fisher Scientific88323
PIXIS BR400 chłodzona kamera CCDPrinceton Instruments
Q-Exactive OrbitrapThermo Fisher Scientific
Rozwiązanie do powlekania kolagenem ze szczurzego ogonaCell Applications Inc.
Tamoksyfen standardSigma-Aldrich85256

Bibliografia

  1. Altschuler, S. J., et al. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  2. Ali, A., et al. Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. , (2019).
  3. Bunnage, M., et al. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
  4. Ali, A., et al. Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (4), 2710-2718 (2019).
  5. Wu, H., et al. In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3809-3814 (2011).
  6. Okada, M., et al. Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 28-32 (2012).
  7. Palonpon, A. F., et al. Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells. Nature Protocols. 8 (4), 677-692 (2013).
  8. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nature Protocols. 11 (4), 664-687 (2016).
  9. Mark, H., Workman, J. Jr Chemomtrics in Spectroscopy. , Second Edition, Academic Press. (2018).
  10. Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra. Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).
  11. Germond, A., et al. Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli. Communications Biology. 1, 85(2018).
  12. Wold, S., et al. Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry. Encyclopedia of Computational Chemistry. , (2002).
  13. Chong, I. G., Jun, C. H. Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).
  14. Inde, Z., Dixon, S. J. The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1), 99-114 (2018).
  15. Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Analytical chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  16. Rao, W., et al. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), e53911(2016).
  17. Ali, A., et al. Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (2), 125-127 (2016).
  18. Abouleila, Y., et al. Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells. Cancer Science. 110, 697-706 (2018).
  19. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  20. Ryabchykov, O., et al. Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples. Frontiers in Chemistry. 6, 257(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektroskopia Ramana pojedynczych komórekanaliza poboru lekumonitorowanie metabolizmu komórkowegoleczenie tamoksyfenempobieranie pojedynczych komórekdetekcja sygnału Ramanowskiegoilościowe oznaczanie metabolitówbadanie heterogeniczności komórkowejanaliza odpowiedzi na lek
Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.