Artykuł metodologiczny

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

DOI:

10.3791/60451

⸱

31 października 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Plant Sciences, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh, 3Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyjanobakterie to zróżnicowana grupa prokariotycznych organizmów fotosyntetyzujących, które mogą być genetycznie modyfikowane w celu odnawialnej produkcji użytecznych towarów przemysłowych. Ostatnie postępy w biologii syntetycznej doprowadziły do opracowania kilku zestawów narzędzi do klonowania, takich jak CyanoGate, ustandaryzowany modułowy system klonowania do budowy wektorów plazmidowych w celu późniejszej transformacji lub małżeńskiego transferu w sinice. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę składania wektora samoreplikującego się (np. przenoszenia kasety ekspresji markera fluorescencyjnego) i małżeńskiego transferu wektora do szczepów sinic Synechocystis sp. PCC 6803 lub Synechococcus elongatus UTEX 2973. Ponadto opisujemy, jak scharakteryzować działanie części genetycznej (np. promotora) za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyjanobakterie to bakterie autotroficzne, które mogą być wykorzystywane do biosyntezy szerokiej gamy naturalnych i heterologicznych produktów przemiany materii o wysokiej wartości1,2,3,4,5,6. Nadal trzeba pokonać kilka przeszkód, aby zwiększyć ich opłacalność komercyjną, w szczególności stosunkowo niskie plony w porównaniu z heterotroficznymi bioplatformami (np. Escherichia coli i drożdże)7. Niedawne rozszerzenie dostępnych narzędzi inżynierii genetycznej i przyjęcie paradygmatu biologii syntetycznej w badaniach nad sinicami pomaga przezwyciężyć takie wyzwania i dalej rozwijać sinice jako wydajne biofabryki8,9,10.

Główne podejścia do wprowadzania DNA do cyjanobakterii to transformacja, koniugacja i elektroporacja. Wektory przenoszone do cyjanobakterii w wyniku transformacji lub elektroporacji są wektorami "samobójczymi" (tj. wektorami integracyjnymi, które ułatwiają rekombinację homologiczną), podczas gdy wektory samoreplikujące się mogą być przenoszone do cyjanobakterii przez transformację, koniugację lub elektroporację. W pierwszym przypadku dostępny jest protokół dla gatunków modeli inżynieryjnych podatnych na naturalną transformację11. Niedawno opracowano modułowy zestaw narzędzi do klonowania (MoClo) dla cyjanobakterii o nazwie CyanoGate, który wykorzystuje ustandaryzowaną metodę składania wektorów Golden Gate do inżynierii przy użyciu naturalnej transformacji, elektroporacji lub koniugacji12.

techniki montażu typu Golden Gate stały się w ostatnich latach coraz bardziej popularne, a standardy montażu i biblioteki części są teraz dostępne dla różnych organizmów13,14,15,16,17. Golden Gate wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS (np. BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI i AarI) oraz zestaw akceptorów i unikalnych nawisów, aby ułatwić kierunkowe hierarchiczne składanie wielu sekwencji w reakcji składania "jednego garnka". Enzymy restrykcyjne typu IIS rozpoznają unikalną asymetryczną sekwencję i przecinają określoną odległość od swoich miejsc rozpoznawania, aby wygenerować naprzemienne, "lepkie zakończenie" (zwykle zwis 4 nukleotydów [NT]), które można następnie wykorzystać do napędzania uporządkowanych reakcji składania DNA15,18. Ułatwiło to opracowanie dużych bibliotek modułowych części poziomu 0 (np. promotorów, otwartych ramek odczytu i terminatorów) zdefiniowanych przez wspólną składnię, taką jak PhytoBricks standard19. Części poziomu 0 mogą być następnie łatwo składane w kasety ekspresji poziomu 1, po czym bardziej złożone zespoły wyższego rzędu (np. konstrukcje ekspresji wielogenowej) mogą być budowane w wybranym wektorze akceptorowym12,15. Kluczową zaletą technik montażu typu Golden Gate jest ich zdolność do automatyzacji w obiektach o wysokiej przepustowości, takich jak odlewnie DNA20,21, co może pozwolić na testowanie złożonych projektów eksperymentalnych, które nie mogą być łatwo osiągnięte przy użyciu pracy ręcznej.

CyanoGate opiera się na sprawdzonym systemie Plant MoClo class12,15. Aby włączyć nową część do CyanoGate, sekwencja części musi najpierw zostać udomowiona, tj. "nielegalne" strony rozpoznawania BsaI i BpiI muszą zostać usunięte. W przypadku kodowania części dla otwartej ramki odczytu (tj. sekwencji kodującej, CDS), miejsca rozpoznawania mogą zostać zakłócone przez generowanie synonimicznych mutacji w sekwencji (tj. zmiana kodonu na alternatywę, która koduje tę samą resztę aminokwasową). Można to osiągnąć za pomocą różnych podejść, począwszy od syntezy DNA, a skończywszy na strategiach opartych na amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), takich jak Gibson assembly22. W zależności od używanego gospodarza wyrażenia, należy zachować ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia rzadkich kodonów, które mogłyby hamować wydajność translacji23. Usuwanie miejsc rozpoznawania w sekwencjach promotora i terminatora jest zazwyczaj bardziej ryzykownym przedsięwzięciem, ponieważ modyfikacje mogą wpłynąć na funkcję, a część może nie działać zgodnie z oczekiwaniami. Na przykład zmiany w przypuszczalnych miejscach wiązania czynnika transkrypcyjnego lub miejscu wiązania rybosomów w promotorze mogą zmienić siłę i reakcję na indukcję/represję. Podobnie, modyfikacje kluczowych cech strukturalnych terminatora (np. rdzenia bogatego w GC, pętli i ogona poli-U) mogą zmienić wydajność terminacji i wpłynąć na ekspresję genów24,25. Chociaż dostępnych jest kilka zasobów internetowych do przewidywania aktywności sekwencji promotora i terminatora oraz informowania, czy proponowana mutacja wpłynie na wydajność26,27, narzędzia te są często słabymi predyktorami wydajności w cyjanobacteria28,29,30.. W związku z tym nadal zaleca się charakterystykę in vivo zmodyfikowanych części w celu potwierdzenia aktywności. Aby pomóc w klonowaniu opornych sekwencji, CyanoGate zawiera wektor akceptora klonowania o niskiej kopii oparty na wektorze BioBrick pSB4K512,16,31. Ponadto w Edinburgh Genome Foundry dostępny jest portal "Zaprojektuj i zbuduj", który pomaga w projektowaniu wektorów (dab.genomefoundry.org). Wreszcie, co najważniejsze, CyanoGate zawiera dwa projekty wektorów akceptorowych poziomu T (odpowiednik wektorów akceptorowych poziomu 2)15 do wprowadzania DNA do cyjanobakterii za pomocą wektorów samobójczych lub wektorów o szerokim zakresie gospodarzy zdolnych do samoreplikacji w kilku gatunkach sinic32,33,34.

Tutaj skupimy się na opisaniu protokołu generowania samoreplikujących się wektorów poziomu T oraz genetycznej modyfikacji Synechocystis PCC 6803 i Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 i S. elongatus UTEX 2973 dalej) poprzez koniugację (znaną również jako kojarzenie trójrodzicielskie). Małżeński transfer DNA między komórkami bakteryjnymi jest dobrze opisanym procesem i był wcześniej stosowany do inżynierii gatunków sinic, w szczególności tych, które nie są naturalnie kompetentne, takich jak S. elongatus UTEX 297335,36,37,38,39,40,41. W skrócie, kultury cyjanobakterii są inkubowane ze szczepem E. coli, który przenosi wektor, który ma zostać przeniesiony (wektor "cargo") i wektory (albo w tym samym szczepie E. coli, albo w dodatkowych szczepach), aby umożliwić koniugację wektorów ("mobilizator" i "pomocniczy"). Aby doszło do transferu małżeńskiego, wymagane są cztery kluczowe warunki: 1) bezpośredni kontakt między komórkami biorącymi udział w transferze DNA, 2) wektor ładunkowy musi być zgodny z systemem koniugacji (tj. musi zawierać odpowiednie pochodzenie transferu (oriT), znane również jako miejsce bom (podstawa mobilności)), 3) białko nacinające DNA (np. kodowane przez gen mob), które nacina DNA w oreniT aby zainicjować jednoniciowy transfer DNA do cyjanobakterii musi być obecny i wyrażony przez wektory ładunkowe lub pomocnicze, oraz 4) przenoszone DNA nie może zostać zniszczone w biorcy cyjanobakterii (tj. musi być odporne na degradację, na przykład przez restrykcyjną aktywność endonukleazy)35,42. Aby wektor ładunku przetrwał, początek replikacji musi być zgodny z cyjanobakterią biorcy, aby umożliwić samoreplikację i proliferację do komórek potomnych po podziale. Aby pomóc w warunkach 3 i 4, kilka wektorów pomocniczych jest dostępnych za pośrednictwem Addgene i innych komercyjnych źródeł, które kodują mob, a także kilka metylaz w celu ochrony przed natywnymi endonukleazami w gospodarzu cyanobacterium43. W tym protokole koniugacja była ułatwiona przez szczep MC1061 E. coli przenoszący wektory mobilizatora i pomocnika pRK24 (www.addgeneorg/51950) i pRL528 (www.addgene.org/58495). Należy zachować ostrożność przy wyborze wektorów, które mają być używane do transferu małżeńskiego. Na przykład w zestawie CyanoGate samoreplikujący się wektor ładunku pPMQAK1-T koduje białko Mob 12. Jednak pSEVA421-T nie 44, i jako taki, mob musi być wyrażony z odpowiedniego wektora pomocniczego. Stosowane wektory powinny być również odpowiednie dla organizmu zwalczanego. Na przykład sprawny transfer małżeński w Anabaena sp. PCC 7120 wymaga wektora pomocniczego, który chroni wektor mobilizatora przed trawieniem (np. pRL623, który koduje trzy metylazy: AvaiM, Eco47iiM i Ecot22iM)45,46.

W tym protokole dodatkowo opisujemy, jak scharakteryzować działanie części (tj. promotorów) za pomocą markera fluorescencyjnego za pomocą czytnika płytek lub cytometru przepływowego. Cytometry przepływowe są w stanie mierzyć fluorescencję na podstawie pojedynczej komórki dla dużej populacji. Co więcej, cytometry przepływowe pozwalają użytkownikom "bramkować" pozyskane dane i usuwać szumy tła (np. z cząstek stałych w kulturze lub zanieczyszczeń). W przeciwieństwie do tego, czytniki płytek uzyskują zagregowany pomiar fluorescencji danej objętości hodowli, zwykle w kilku powtórzonych studzienkach. Do najważniejszych zalet czytników płytek w porównaniu z cytometrami należy niższy koszt, większa dostępność i zazwyczaj brak konieczności stosowania specjalistycznego oprogramowania do dalszych analiz danych. Głównymi wadami czytników płytek są stosunkowo niższa czułość w porównaniu z cytometrami oraz potencjalne problemy z gęstością optyczną mierzonych kultur. Do celów analiz porównawczych próbki z czytnika płytkowego muszą być znormalizowane dla każdej studzienki (np. do pomiaru gęstości hodowli, zwykle przyjmowanej jako absorbancja przy gęstości optycznej przy 750 nm [OD750]), co może prowadzić do niedokładności w przypadku próbek, które są zbyt gęste i/lub źle wymieszane (np. gdy są podatne na agregację lub flokulację).

Jako przegląd, tutaj szczegółowo pokazujemy zasady generowania części poziomu 0, a następnie hierarchicznego montażu za pomocą zestawu CyanoGate i klonowania do wektora odpowiedniego do transferu małżeńskiego. Następnie demonstrujemy proces transferu małżeńskiego, selekcję aksenowych szczepów transkoniugacyjnych wykazujących ekspresję markera fluorescencyjnego, a następnie pozyskiwanie danych fluorescencyjnych za pomocą cytometru przepływowego lub czytnika płytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Montaż wektorów za pomocą zestawów narzędzi Plant MoClo i CyanoGate

UWAGA: Przed przystąpieniem do montażu wektorów, zdecydowanie zaleca się, aby użytkownicy zapoznali się ze strukturami poziomów wektorów systemów Plant i CyanoGate MoClo 12,15.

  1. Budowa części poziomu 0
    UWAGA: Części poziomu 0 mogą być syntetyzowane jako kompletne wektory lub jako sekwencje liniowe do montażu z akceptorami poziomu 0 (np. gBlocks, IDT). Alternatywnie, sekwencje mogą być amplifikowane z matrycy źródłowej (np. wektora lub oczyszczonego genomowego DNA). Tutaj opisano, jak wygenerować nową część poziomu 0 z produktu ze wzmacniaczem. Przegląd procesu montażu Golden Gate od poziomu 0 do poziomu T jest pokazany w Rysunek 1.
    1. Zaprojektuj podkłady.
      1. Zdecyduj, który moduł poziomu 0 chcesz zmontować i zidentyfikuj odpowiednie zwisy 5′ i 3′ (Tabela 1)12,15. Sprawdź sekwencję DNA do sklonowania pod kątem obecności miejsc restrykcyjnych BpiI lub BsaI.
        UWAGA: Sekwencja zawierająca jedno z tych miejsc musi zostać udomowiona poprzez modyfikację jednego lub więcej NT w sekwencji miejsca ograniczenia. Strategia tego celu za pomocą zestawu Golden Gate jest opisana w Rysunek 2.
      2. Aby amplifikować sekwencję DNA, zaprojektuj odpowiednią parę starterów do przodu i do tyłu. Dla startera do przodu wybierz 18−30 pz komplementarne do końca 5′ sekwencji matrycy DNA. Dla startera odwrotnego wybierz 18−30 pz odwrotny komplementarny do końca 3′ sekwencji matrycy DNA.
        UWAGA: Startery o temperaturach topnienia (Tm) 58−62 °C zazwyczaj dają najbardziej spójne wyniki amplifikacji (Rysunek 1A).
      3. Do końca 5′ startera do przodu dodaj następujące elementy: 1) losowy ciąg 4−6 NT na końcu 5′ miejsca BpiI, 2) miejsce ograniczenia BpiI (GAAGAC), 3) dwa losowe NT i 4) zwis 5′ wybrany w kroku 1.1.1.1. Do końca 5′ odwróconego startera dodać następujące elementy: 1) losowy ciąg 4−6 NT na końcu 5′ miejsca BpiI, 2) miejsce ograniczenia BpiI (GAAGAC), 3) dwa losowe NT i 4) zwis 3′ wybrany w kroku 1.1.1.1. Po sfinalizowaniu zamów pary starterów.
        UWAGA: Zobacz Rysunek 1A dla przykładu pary starterów do przodu i do tyłu.
    2. Amplifikuj sekwencję DNA z genomowego DNA.
      1. Wyodrębnić genomowe DNA zgodnie z opisem w sekcji 5. Amplifikuj produkty metodą PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności (tabela materiałów).
        UWAGA: Jako przykład ustaw reakcje PCR (20−50 μL) zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj ~100 ng genomowego DNA na reakcję. Stosować program cykli termicznych składający się z początkowego etapu denaturacji w temperaturze 98 °C przez 30 s, po którym następuje nie więcej niż 25 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 10 s, wyżarzania startera w temperaturze 58 °C przez 15 s i przedłużania produktu w temperaturze 72 °C przez 30 s (ten ostatni należy modyfikować w zależności od wielkości użytego produktu/rodzaju polimerazy DNA), a następnie końcowy etap przedłużania w temperaturze 72 °C przez 2 minuty.
      2. Jeżeli produkt PCR ma zostać oczyszczony w żelu, należy przeprowadzić całą reakcję PCR na żelu agarozowym, jak opisano w punkcie 6. Odetnij interesujący Cię pasek z żelu agarozowego i oczyść go za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów).
      3. Alternatywnie do kroku 1.1.2.2, jeśli produkt PCR ma być stosowany bez oczyszczania żelu, należy sprawdzić rozmiar prążka, przeprowadzając podwielokrotność próbki reakcji PCR (~5 μl) na żelu agarozowym. Jeśli żel wykazuje tylko odpowiednie prążki i nie ma śladów dimerów starterów, oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (tabela materiałów).
      4. Eluować oczyszczone DNA w niewielkiej objętości wody dejonizowanej (np. 10 μL) w celu uzyskania wysokiego stężenia DNA (zwykle wystarcza >zwykle wystarcza 20 ng/μL).
    3. Złóż amplifikowany produkt DNA (lub produkty, patrz Rysunek 2) na poziomie 0. Przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 20 μl z BpiI (Rysunek 1B) i skonfigurować program termocyklera zgodnie z opisem w Tabeli 2. Przejść do transformacji E. coli, używając 5 μl zmontowanej mieszaniny reakcyjnej poziomu 0 (jak opisano w sekcji 2).
  2. Budowa zespołów poziomu 1
    1. Zdecyduj, które części poziomu 0 mają zostać zmontowane (Rysunek 1C i Tabela 1). Wybierz odpowiedni akceptor poziomu 1 vector15.
      UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby wiedzieć, jaki będzie ostateczny projekt wektora na poziomie T, ponieważ będzie to miało wpływ na wybór wektora akceptora poziomu 1. Wektor akceptora poziomu 1 pozycji 1 (do przodu) (pICH47732) może być używany jako domyślny, jeśli celem jest posiadanie pojedynczego zestawu poziomu 1 (np. kasety ekspresji genów) na poziomie T. Jednakże, jeżeli dwa lub więcej zespołów poziomu 1 ma być zamontowanych na poziomie T, należy wziąć pod uwagę położenie i kierunek każdego zespołu poziomu 1. W wektorze akceptora poziomu T można złożyć maksymalnie siedem zestawów poziomu 1 przy użyciu wektorów akceptora poziomu 1 z odpowiednimi pozycjami12.
    2. Zmontuj części poziomu 0 na poziomie 1. Przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 20 μl z BsaI i skonfigurować program termocyklera zgodnie z opisem w tabeli 2. Przejść do transformacji E. coli, używając 5 μl zmontowanej mieszaniny reakcyjnej poziomu 1 (jak opisano w sekcji 2).
  3. Budowa zespołów poziomu T
    1. Zdecyduj, które zestawy poziomu 1 mają zostać zmontowane (Rysunek 1D). Wybierz odpowiedni wektor akceptora poziomu T.
      UWAGA: pUC19A-T (oporność na ampicylinę) i pUC19S-T (oporność na spektynomycynę) są wektorami całkującymi o wysokiej liczbie kopii, które nie są zdolne do replikacji w cyjanobakteriach i są używane głównie do integracji genomowej (tj. knock-in lub knock-out genów) poprzez rekombinację homologiczną12. Dostarczanie wektorów integracyjnych może przebiegać poprzez naturalną transformację w podatne gatunki sinic11. pPMQAK1-T jest wektorem replikacyjnym o szerokim zakresie żywicieli, który jest dostarczany przez transfer małżeński (sekcja 3).
    2. Wybierz odpowiednie ogniwo końcowe, aby podlikulować koniec 3′ końcowego zespołu poziomu 1 do poziomu T backbone15.
      UWAGA: Wymagane ogniwo końcowe ma ten sam numer, co pozycja końcowej części. Na przykład wektor poziomu T z tylko jedną częścią poziomu 1 pozycji 1 (do przodu lub do tyłu) będzie wymagał łącznika końcowego 1 (pICH50872) do podwiązania do szkieletu poziomu T.
    3. Zmontuj jeden lub więcej zespołów poziomu 1 na poziomie T. Przygotuj mieszaninę reakcyjną z BpiI i wymaganym wektorem End-Link i skonfiguruj program termocyklera zgodnie z opisem w Tabeli 2. Przejść do transformacji E. coli, używając 5 μl zmontowanej mieszaniny reakcyjnej poziomu T (jak opisano w sekcji 2).

2. Transformacja E. coli i oczyszczanie wektorów

  1. Transformacja E. coli (dzień 1)
    1. Rozmrozić podwielokrotność (~25 μl) chemicznie kompetentnych komórek E. coli (tabela materiałów) i delikatnie pipetować do probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie. Dodać 5 μl mieszanki montażowej (poziom 0, 1 lub T) i inkubować probówkę na lodzie przez kolejne 30-60 minut.
    2. Komórki szoku termicznego poprzez inkubację probówki w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C przez 30 s, a następnie umieszczenie probówki z powrotem na lodzie na 2 minuty. Dodać do probówki super optymalny bulion o temperaturze pokojowej (RT) z pożywką do tłumienia katabolitu (S.O.C.) (250 μL). Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy prędkości 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
    3. Umieścić 40 μl kultury na płytce agarowej LB zawierającej odpowiednie końcowe stężenie antybiotyków (100 μg/ml dla pentahydratu dichlorowodorku spektynomycyny [poziom 0], 100 μg/ml disodu karbenicyliny [poziom 1] lub 50 μg/ml siarczanu kanamycyny [poziom T]), 1 mM izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 40 μg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu (X-Gal) do badań przesiewowych na niebiesko-biały. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Ilość posiażdżonej kultury może być zróżnicowana w zależności od wydajności komórek kompetentnych dla E. coli i reakcji ligacji. Płytkę należy podawać większą objętość, jeśli po całonocnej inkubacji zaobserwuje się <10 kolonii.
  2. Selekcja białych kolonii i przygotowanie płynnych kultur (dzień 2)
    UWAGA: W zależności od wydajności reakcji składania i późniejszej transformacji, płytki agarowe LB mogą nie zawierać żadnych kolonii, niebieskich lub białych (Rysunek 3). Niebieskie kolonie wskazują na wektory akceptorowe, które nie zostały poddane restrykcjom (tj. funkcjonalna kopia lacZ jest nadal obecna). Białe kolonie wskazują, że kaseta z wyrażeniem lacZ została utracona i zastąpiona częścią/zespołem.
    1. Opcjonalnie sprawdź, czy białe kolonie zawierają oczekiwany wektor, wykonując PCR zgodnie z opisem w sekcji 7.
    2. Pobrać pojedyncze białe kolonie (lub kolonie zweryfikowane metodą PCR) za pomocą końcówki o pojemności 10 μl i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę LB (5 ml) i odpowiednie stężenia antybiotyku (krok 2.1.3). Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez noc przy prędkości 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
  3. Oczyszczanie wektorów plazmidowych (dzień 3)
    1. Opcjonalnie należy przygotować zapas glicerolu z nocnej kultury E. coli do długotrwałego krioprzechowywania wektorów. Dodać 500 μl kultury bakteryjnej do 500 μl 50% (v/v) glicerolu w odpowiedniej probówce o pojemności 1,5−2,0 ml do krioprzechowywania w temperaturze -80 °C. Wymieszać delikatnie, odwracając 5−10x. Próbki należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    2. Odwirować kultury w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml przy 3 000 x g przez 5-10 min. Wyrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Oczyść wektor za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu (tabela materiałów). Elutuj oczyszczony wektor w 35 μl wody dejonizowanej.
      UWAGA: Użyj mniejszych objętości elucji, aby jeszcze bardziej zwiększyć stężenie wektora. Ten sam eluent można dwukrotnie przepuścić przez kolumnę oczyszczającą w celu zwiększenia plonów.
    3. Zmierzyć stężenie wektora w eluencie za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
      UWAGA: Wektory o wysokiej liczbie kopii u E. coli, takie jak pUC19, zwykle dają wydajność 50-300 ng / μL. Wektory o niskiej liczbie kopii, takie jak pPMQAK1-T, zwykle dają wydajność 15-60 ng / μL.
  4. Walidacja wektorowa
    UWAGA: Wektory można zweryfikować poprzez trawienie restrykcyjne (krok 2.4.1) i/lub sekwencjonowanie (krok 2.4.2).
    1. Ogranicz 0,5−1 μg wektora za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego (enzymów) restrykcyjnego i sprawdź oczekiwane rozmiary pasm, jak opisano w sekcji 6 (Rysunek 4).
      UWAGA: Nieprawidłowe rozmiary pasm zazwyczaj wskazują na błędne złożenie, w którym to przypadku można przesiać więcej białych kolonii lub powtórzyć montaż. BsaI i BpiI mogą być używane do sprawdzania poprawności rozmiaru płytki odpowiednio dla zespołów poziomu 0 i poziomu 1. BsaI lub BpiI mogą być stosowane w połączeniu z dodatkowym, kompatybilnym enzymem restrykcyjnym, który tnie we wstawce i/lub szkielecie wektora, tworząc wyraźny zestaw dobrze oddzielonych prążków po trawieniu.
    2. Sekwencjonować wektor za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu odpowiedniego startera przed zmontowanym regionem przy użyciu komercyjnego urządzenia do sekwencjonowania (Tabela 3).
      UWAGA: Wszystkie nowe części poziomu 0 powinny być sekwencjonowane w celu potwierdzenia oczekiwanej tożsamości sekwencji. Walidacja sekwencji wektorów poziomu 1 i T nie jest zwykle wymagana, jeśli składa się z wcześniej zsekwencjonowanych części poziomu 0.

3. Generowanie mutantów przez koniugację

UWAGA: Tutaj opisany jest protokół małżeńskiego transferu samoreplikującego się wektora ładunku do Synechocystis PCC 6803 lub S. elongatus UTEX 297311,47. Protokół ten ma zastosowanie do innych gatunków modelowych (np. S. elongatus PCC 7942 i Synechococcus sp. PCC 7002). Wszystkie prace z sinicami (i związanymi z nimi preparatami buforowymi) powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.

  1. Wzrost kultury sinic (dzień 1)
    1. Przygotować pożywkę BG11 zgodnie z Lea-Smith et al.11, a płytki agarowe z LB-BG11 i BG11+Kan50 (sekcja 8).
    2. Utworzyć świeżą hodowlę Synechocystis PCC 6803 lub S. elongatus UTEX 2973, zaszczepiając stożkową kolbę o pojemności 100 ml ze świeżą pożywką BG11 (50 ml) komórkami pochodzącymi z aksenicznej płytki agarowej BG11. Hodować kultury Synechocystis PCC 6803 w temperaturze 30 °C, 100 μmol fotonów m-2 s-1 przy 100 obr./min i hodować S. elongatus UTEX 2973 w temperaturze 40 °C, fotony 300 μmol m-2 s-1 przy 100 obr./min. Uprawiaj kultury do OD750 = 0,5−1,5 (zwykle 1−2 dni).
      UWAGA: Kultury S. elongatus UTEX 2973 mogą być uprawiane w temperaturze 40 °C przy dużym natężeniu światła (np. 2000 μmol fotonów m-2 s-1)48.
  2. Wzrost pomocniczych i towarowych szczepów E. coli (dzień 2)
    1. Zaszczepić pożywkę LB zawierającą ampicylinę (stężenie końcowe 100 μg/ml) i chloramfenikol (stężenie końcowe 25 μg/ml) szczepem MC1061 E. coli zawierającym wektory pRK24 i pRL528 (tj. szczepem pomocniczym) i rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc przy 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem. Wyhoduj wystarczającą ilość kultury szczepu pomocniczego, zakładając, że wymagana jest 1 ml kultury na koniugację.
    2. Zaszczepić pożywkę LB (5 ml) zawierającą odpowiednie antybiotyki kulturą E. coli przenoszącą wektor ładunkowy (tj. wektor poziomu T). Hodować kulturę w temperaturze 37 °C przez noc przy 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
  3. Przeniesienie małżeńskie (krycie trojga rodziców) (dzień 3)
    1. Przygotuj pomocnika E. coli i szczepy ładunkowe. Odwirować przez noc kultury bakterii E. coli i ładunku w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego.
    2. Umyj granulkę, dodając świeżą pożywkę LB bez antybiotyków. Użyj tej samej objętości, co początkowa kultura. Zawiesić osad, delikatnie pipetując w górę i w dół. Nie wiruj kultury. Powtórz ten krok 3 razy, aby usunąć resztki antybiotyków z nocnej hodowli.
    3. Odwirować ponownie zawieszoną kulturę (jak w kroku 3.3.1), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w połowie objętości pożywki LB początkowej objętości kultury (np. 2,5 ml, jeśli kultura nocna wynosiła 5 ml). Połączyć 450 μl szczepu pomocniczego z 450 μl szczepu ładunkowego w probówce o pojemności 2 ml i odstawić (pozostawić w temperaturze pokojowej) do kroku 3.3.6.
    4. Przygotuj kulturę sinic. Do każdej reakcji koniugacji użyj 1 ml kultury sinic (OD750 = 0,5−1,5).
    5. Odwirować wymaganą całkowitą objętość kultury sinic przy sile 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Umyj osad, dodając świeże podłoże BG11 o tej samej objętości początkowej. Zawiesić osad, delikatnie pipetując w górę iw dół, nie mieszać kultury. Powtórz ten krok 3 razy i odłóż umytą kulturę na bok.
    6. Dodać porcję przemytej kultury cyjanobakterii (900 μl) do połączonych szczepów E. coli (pomocnik i ładunek) (900 μl) w probówce o pojemności 2 ml. Wymieszaj kultury, delikatnie pipetując w górę i w dół. Nie wirować. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w przypadku Synechocystis PCC 6803 lub 2 godziny w przypadku S. elongatus UTEX 2973.
    7. Odwirować mieszaninę przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 1,6 ml supernatantu. Zawiesić osad w pozostałym ~200 μl supernatantu. Umieścić jeden filtr membranowy 0,45 μm na płytce agarowej LB-BG11 bez antybiotyków (sekcja 8). Ostrożnie rozprowadzić 200 μl mieszaniny kultur bakterii E. coli i sinic na membranie za pomocą sterylnego rozsiewacza lub sterylnej zagiętej końcówki i uszczelnić płytkę folią parafinową.
    8. Inkubować płytkę LB-BG11 z membraną przez 24 godziny. Utrzymywać błony z kulturami Synechocystis PCC 6803 w temperaturze 30 °C, 100 μmol fotonów m-2 s-1. Utrzymuj błony z kulturami S. elongatus UTEX 2973 w temperaturze 40 °C w 150 μmol fotonach m-2 s-1.
  4. Przenoszenie membrany
    1. Po 24 godzinach ostrożnie przenieść membranę za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczy na świeżą płytkę agarową BG11 zawierającą odpowiednie antybiotyki (sekcja 8) w celu wyboru wektora ładunku. Uszczelnij płytkę folią parafinową.
    2. Inkubować płytkę agarową BG11 w odpowiednich warunkach wzrostu, jak opisano powyżej dla Synechocystis PCC 6803 lub S. elongatus UTEX 2973, aż do pojawienia się kolonii.
      UWAGA: Kolonie pojawiają się zwykle po 7−14 dniach w przypadku Synechocystis PCC 6803 i 3−7 dni w przypadku S. elongatus UTEX 2973.
  5. Wybór koniugantów
    UWAGA: Tylko kolonie sinic przenoszące wektor ładunku będą mogły rosnąć na membranie (Rysunek 5).
    1. Za pomocą sterylnej pętli termicznej wybierz co najmniej dwie pojedyncze kolonie z membrany i rozprowadź smugi na nowej płytce agarowej BG11 zawierającej odpowiednie antybiotyki (Rysunek 5C).
      UWAGA: Świeżo prążkowane kolonie mogą być nadal zanieczyszczone E. coli przeniesioną z koniugacji (tj. jeśli małe białe kolonie są widoczne na płytce), więc zwykle potrzebne są dwie lub trzy dodatkowe rundy ponownego nawarstwiania na świeże płytki agarowe BG11 w celu uzyskania aksenowej kultury sinic.
    2. Potwierdzić brak skażenia E. coli poprzez zaszczepienie smugi kultur sinic do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki LB i inkubacji w temperaturze 37 °C przez noc przy 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem. Po wystarczającym okresie wzrostu (~ 7 dni) wybierz poszczególne kolonie akseniczne, aby założyć płynne kultury do długotrwałego krioprzechowywania lub późniejszych eksperymentów.
  6. Kriomagazynowanie szczepów sinic
    1. Hodować płynną kulturę sinic w BG11 (zgodnie z opisem w sekcji 3.1) do OD750 = 1,5−3,0. Odwirować 10 ml kultury przez 10 minut przy 1 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml świeżej pożywki BG11.
    2. Dodaj 3,5 ml sterylizowanego w autoklawie 50% (v/v) glicerolu, aby uzyskać końcowe stężenie glicerolu ~20% (v/v)49. Takie podejście sprawdza się w przypadku Synechocystis PCC 6803. Alternatywnie, dodać 5 ml sterylizowanego filtrem BG11 zawierającego 16% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO), aby uzyskać końcowe stężenie DMSO ~8% (v/v)50. To podejście jest zalecane dla większości szczepów, w tym S. elongatus UTEX 2973.
      UWAGA: DMSO jest toksyczny i należy się z nim obchodzić z odpowiednią ochroną.
    3. Delikatnie wymieszać, odwracając 5−10x. Subaliquot ~1 ml kultury do oddzielnych probówek z nakrętką 1,5 ml kompatybilnych z kriomagazynem (tabela materiałów). Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu krioprzechowywania. Nie zamrażać w ciekłym azocie.
      UWAGA: Zalecane są co najmniej trzy zapasy na szczep.
    4. W celu odzyskania wyjmij probówkę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmroź kulturę w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C, delikatnie mieszając. Dodać rozmrożoną kulturę do 50 ml świeżej pożywki BG11 i wyhodować jako płynną kulturę (jak opisano w sekcji 3.1).
      UWAGA: Alternatywnie kulturę można pokryć smugami i wyhodować na świeżej płycie agarowej BG11. Kultury transgeniczne zawierające markery selekcyjne muszą być początkowo ożywione na płytkach agarowych BG11 bez antybiotyków, a następnie ponownie przesiane na płytki agarowe BG11 odpowiednimi antybiotykami.

4. Charakterystyka promotora

UWAGA: Tutaj opisano standardowe podejście do analizy siły części promotorowej poprzez pomiar poziomów ekspresji markera fluorescencyjnego (eYFP) po 72-godzinnym okresie wzrostu za pomocą czytnika płytek lub cytometru przepływowego12.

  1. Rozwój kultury
    1. Ustawić kultury nasienne, zaszczepiając 10 ml pożywki BG11 zawierającej odpowiednie antybiotyki pojedynczą kolonią transgenicznego szczepu sinic przenoszących kasetę ekspresji markera fluorescencyjnego. Należy również przygotować kultury nasion dla odpowiednich szczepów kontroli ujemnej (np. szczepu typu dzikiego i/lub szczepu transgenicznego posiadającego ten sam szkielet wektora, ale pozbawionego kasety ekspresji markera fluorescencyjnego).
      UWAGA: Zalecane są co najmniej cztery kontrpróby biologiczne.
    2. Hoduj kultury nasienne przez 48 godzin lub do momentu, gdy OD750 = 1−1,5 w warunkach wzrostu odpowiednich dla odmiany gatunku.
    3. Aby śledzić ekspresję promotora w czasie, najpierw zmierz OD750 w każdej kulturze nasion. Obliczyć wymagania dotyczące rozcieńczenia, aby doprowadzić każdą kulturę do początkowego OD750 = 0,2. Rozcieńczone próbki kultur doświadczalnych (całkowita objętość 2 ml) należy umieścić na płaskiej 24-dołkowej płytce (tabela materiałów).
    4. Inkubować płytkę w inkubatorze z wytrząsaniem z białymi diodami LED (tabela materiałów) w odpowiednich warunkach wzrostu. Zmierzyć gęstość wzrostu kultury (OD750) i wzmocnioną fluorescencję białka żółtej fluorescencji (eYFP) za pomocą czytnika płytek (sekcja 4.2) lub cytometru przepływowego (sekcja 4.3).
      UWAGA: Kultury Synechocystis PCC 6803 i S. elongatus UTEX 2973 można uprawiać jak w kroku 3.1.2. Zdecydowanie zaleca się, aby płytka była przechowywana w wysokiej wilgotności (95%), aby uniknąć parowania próbek hodowli.
  2. Czytnik płytek
    1. Krótko wymieszać kultury w płytce 24-dołkowej (krok 4.1.4) delikatnie pipetując. Przenieść podpróbkę każdej kultury na czarną płaską płytkę 96-dołkową (tabela materiałów). W razie potrzeby rozcieńczyć (100 μl końcowej objętości). Unikaj tworzenia się pęcherzyków, ponieważ może to zakłócić dokładność pomiaru.
      UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie pomiary były wykonywane na próbkach w zakresie OD750 0,2-1,0. Ponieważ gęstość kultur w 24-dołku będzie rosła z czasem, zaleca się następujące rozcieńczenia w oparciu o oczekiwany wzrost w standardowych warunkach wzrostu: bez rozcieńczania po 0 godzinach, 1:4 po 24 godzinach, 1:10 po 48 godzinach i 1:10 po 72 godzinach. Na przykład po 24 godzinach zbierz 25 μl kultury i wymieszaj z 75 μl pożywki BG11.
    2. Umieścić dwie ślepe studzienki w 96-dołkowej płytce (tj. 100 μl pożywki BG11). Umieścić 96-dołkową płytkę w czytniku płytek (tabela materiałów). Potrząsaj płytką przez 60 s przy 500 obr./min za pomocą wytrząsarki orbitalnej w czytniku płytek, aby wymieszać dołki.
      UWAGA: Kultury cyjanobakterii mogą agregować i/lub flokulować, więc dobre wymieszanie ma kluczowe znaczenie przed odczytem w celu uzyskania dokładnych pomiarów.
    3. Zmierz fluorescencję OD750 i eYFP przy długościach fal wzbudzenia/emisji przy 485 nm/520 nm.
    4. Odejmij średnią z pomiarów OD750 z dwóch ślepych studzienek od pomiaru OD750 dla każdej studzienki próbki zawierającej kulturę sinic.
    5. Znormalizować wartości fluorescencji każdej próbki hodowli, dzieląc pomiar fluorescencji eYFP (etap 4.2.3) przez skorygowaną wartość OD750 kultury (etap 4.2.4). Następnie odejmij średnią znormalizowaną wartość fluorescencji eYFP (fluorescencja eYFP/OD750) biologicznych kontrprób odpowiedniego szczepu kontroli ujemnej od szczepów transgenicznych przenoszących kasetę ekspresji eYFP.
      UWAGA: Sinice naturalnie fluoryzują ze względu na obecność pigmentów, takich jak chlorofil i fikobiliproteiny.
    6. Wykreśl wzrost kultury w czasie (Rysunek 6A) i średnie znormalizowane wartości fluorescencji eYFP każdej kultury eksperymentalnej w żądanych punktach czasowych (np. 72 godziny; Rysunek 6B).
  3. Cytometr przepływowy
    1. Wybierz kompatybilną płytkę do systemu obsługi cieczy cytometru przepływowego. Na przykład należy użyć okrągłodennej 96-dołkowej płytki (Tabela materiałów) z cytometrem przepływowym (Tabela materiałów) używanym w tym protokole.
    2. Krótko wymieszać kultury w płytce 24-dołkowej (krok 4.1.4) delikatnie pipetując. Rozcieńczyć kultury do OD750 = 0,1−0,2, aby uniknąć zablokowania dysz w układzie obsługi cieczy. Dodać odpowiednią objętość próbki hodowli do płytki 96-dołkowej i doprowadzić do końcowej objętości 250 μl za pomocą wysterylizowanego przez filtr 1x roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dołączyć ślepą próbę dla roztworu pożywki na płytce zawierającej 60 μl BG11 i 190 μl 1x PBS.
      UWAGA: Ta objętość jest zalecana w przypadku, gdy zachodzi potrzeba ponownego uruchomienia próbek. Objętości większe niż 250 μl nie są zalecane, ponieważ maksymalna objętość każdej studzienki wynosi 300 μl.
    3. Gdy cytometr przepływowy jest gotowy do użycia, umieścić 96-dołkową płytkę z próbkami kultur w stacji obsługi cieczy. Skonfiguruj protokół oprogramowania dla cytometru przepływowego, aby zbierać pomiary 10 000 pojedynczych zdarzeń (np. komórek). Zmierz fluorescencję eYFP o długościach fal wzbudzenia/emisji 488 nm/515−545 nm. Najpierw zmierz i sprawdź odczyt ze ślepej studzienki (Rysunek 7A), a następnie uruchom próbki.
    4. Bramka populacji komórek cyjanobakterii w zestawach danych rozproszenia do przodu i z boku, z wyłączeniem regionów wspólnych dla pustego odczytu (Rysunek 7B). Odejmij średnie wartości fluorescencji eYFP dla biologicznych kontrprób odpowiedniego szczepu kontroli ujemnej od szczepów transgenicznych przenoszących kasetę ekspresji eYFP (Rysunek 7C,D). Wykreślić średnią średnich wartości fluorescencji na komórkę dla każdej eksperymentalnej kultury w żądanych punktach czasowych (np. 72 godziny; Rysunek 7E).

5. Ekstrakcja genomowego DNA z cyjanobakterii

UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA (Tabela Materiałów).

  1. Hodować płynną kulturę sinic w BG11 (zgodnie z opisem w sekcji 3.1) do OD750 = 1,5−3,0. Odwirować 10 ml kultury o stężeniu 3 000 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant. Zamrozić osad przez inkubację probówek w temperaturze -20 °C przez 30 minut.
  2. Dodać 400 μl buforu do lizy (bufor AP1) i 400 μl roztworu rybonukleazy (RNazy A) oraz 50% (m/v) szklanych kulek (średnica 0,5 mm). Rozdrabniać próbki za pomocą młyna perełkowego (tabela materiałów) przy 30 Hz (tj. co odpowiada 1 800 oscylacjom/min) przez 6 minut.
  3. Obracać próbkę o masie 17 000 x g przez 5 minut, następnie ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki i wyrzucić osad. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).

6. Elektroforeza w żelu agarozowym

  1. Odleć 1% (w/v) żel agarozowy zawierający 0,02% (v/v) bromku etydyny. Załaduj próbki i odpowiednie odniesienie do drabinki DNA.
  2. Próbki należy badać przez 50 minut pod napięciem 125 V. Sprawdzić, czy na transiluminatorze ultrafioletowym (UV) nie ma separacji pasm.
    UWAGA: Czas pracy i procentową zawartość żelu agarozowego można modyfikować w celu dopasowania do oczekiwanego rozmiaru pasma. Na przykład wyższa zawartość żelu agarozowego i dłuższy czas działania mogą poprawić rozdzielczość pasma i separację produktów DNA <500 pz.

7. PCR kolonii

  1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR, używając standardowego zestawu (tabela materiałów) i odpowiedniej kombinacji starterów (np. starterów, które otaczają obszar montażu lub są specyficzne dla sekwencji w regionie montażu (tabela 3). Odpipetować 10 μl do probówki do PCR.
  2. Delikatnie dotknij wierzchu pojedynczej białej kolonii sterylną wykałaczką lub końcówką pipety o pojemności 10 μl i zaszczep probówkę PCR zawierającą mieszaninę reakcyjną PCR. Zwróć uwagę, aby oznaczyć kolonię i dopasować ją do określonej probówki PCR. Delikatnie wymieszaj mieszaninę reakcyjną, aby upewnić się, że komórki E. coli zostały zrzucone do roztworu.
  3. Amplifikuj produkty metodą PCR. Stosować program składający się z początkowego etapu denaturacji w 95 °C przez 60 s, 30 rund w temperaturze 95 °C przez 15 s, 58 °C przez 15 s (kilka stopni poniżej wartości Tm starterów), 72 °C przez 30 s (30 s/kb wkładki), a następnie końcowego etapu wydłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut.

8. Przygotowanie podłoża BG11 i płyt

  1. Przygotować roztwory podstawowe 100x pożywki BG11, żelaza (cytrynian amonu i żelaza), pierwiastków śladowych, fosforanu (K2HPO4), Na2CO3 i buforu TES zgodnie z Lea-Smith et al.11. Zapasy fosforanów w autoklawie i Na2CO3 . Użyj filtrów 0,2 μm do filtracji, sterylizacji buforu TES (pH 8,2) i roztworów podstawowychNaHCO3
    2. .
  2. Przygotować 1 l pożywki BG11. Wymieszaj 10 ml 100x BG11, 1 ml pierwiastków śladowych i 1 ml żelaza i autoklaw roztworu z 976 ml wody. Gdy roztwór ostygnie do RT, dodać 1 ml bulionu fosforanowego, 1 ml bulionu Na2CO3 i 10 ml NaHCO3 i dostosować do pH 7,6−7,8 z 1 M HCl.
  3. Płytki agarowe LB-BG11 (1,5% [w/v])
    1. Połącz 700 ml wody dejonizowanej i 15 g agaru w szklanej kolbie. Do drugiej kolby dodać 186 ml wody, 10 ml 100x BG11, 1 ml pierwiastków śladowych i 1 ml żelaza. Autoklaw obu roztworów.
    2. Gdy roztwory ostygną do około 60 °C, połącz je i dodaj 1 ml bulionu fosforanowego, 1 ml bulionu Na2CO3 , 10 ml bulionu NaHCO3 i 50 ml sterylnego podłoża LB, co powinno dać końcową objętość 1 l. Odlać szalki Petriego z 25 ml podłoża agarowego LB-BG11.
  4. Płytki agarowe BG11+Kan50 (1,5% [w/v])
    1. Połącz 700 ml wody dejonizowanej i 15 g agaru w szklanej kolbie. Do drugiej kolby dodać 3 g tiosiarczanu sodu (Na2S2O3), 226 ml wody, 10 ml 100 x bulionu BG11, 1 ml pierwiastków śladowych i 1 ml żelaza. Autoklaw obu roztworów.
    2. Gdy roztwory ostygną do około 60 °C, połączyć je i dodać 1 ml bulionu fosforanowego, 1 ml bulionu Na2CO3 , 10 ml bulionu TES i 10 ml zapasu NaHCO3, co powinno dać końcową objętość 1 l. Dodać siarczan kanamycyny do końcowego stężenia 50 μg/ml i odlać szalki Petriego z 35 ml pożywki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować przebieg procesu montażu Golden Gate, kaseta z wyrażeniami została złożona w wektorze akceptora poziomu 1 pozycji 1 (do przodu) (pICH47732) zawierającym następujące części poziomu 0: promotor operonu C-fikocyjaniny Pcpc560 (pC0.005), sekwencja kodująca dla eYFP (pC0.008) i podwójny terminator TrrnB (pC0.082)12. Po przekształceniu reakcji składania, udane zespoły zostały zidentyfikowane za pomocą standardowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montaż Golden Gate ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami montażu wektorowego, szczególnie pod względem skalowalności 20,21. Niemniej jednak, konfiguracja systemu Golden Gate w laboratorium wymaga czasu na zaznajomienie się z różnymi częściami i bibliotekami wektorów akceptorowych oraz ogólnymi procesami montażu. Staranne planowanie jest często potrzebne w przypadku bardziej złożonych zestawów lub podczas wykonywania dużej liczby złożonych zestawów równole...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Radzie ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC) PHYCONET Network in Industrial Biotechnology and Bioenergy (NIBB) oraz Centrum Innowacji Biotechnologii Przemysłowej (IBioIC) za wsparcie finansowe. GARG, AASO i AP potwierdzają wsparcie finansowe odpowiednio z programu doktoranckiego BBSRC EASTBIO CASE (numer grantu BB/M010996/1), programu doktoranckiego Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) oraz programu doktoranckiego IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP). Dziękujemy Conradowi Mullineaux (Queen Mary University of London) oraz Poulowi Ericowi Jensenowi i Julie Annemarie Zita Zedler (University of Copenhagen) za wkład i porady dotyczące wektora plazmidowego i protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd (X-gal)Thermo Fisher ScientificR0404Stosowany w 2.1.3.
Sól disodowa adenozyno-5′-trifosforanu (ATP)Sigma-AldrichA2383Stosowana w tabeli 2.
Agar (testowany mikrobiologicznie)Sigma-AldrichA1296-500gStosowany w 8.3.
AgarozaBiolineBIO-41026stosowany w 6.
Cytometr przepływowy Attune NxTThermo Fisher stosowany naukowow 4.3.1.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153stosowana w Tabeli 2.
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011Używany w tabeli 2.
BsaI (Eco31I)Thermo Fisher ScientificER0291Używany w Tabeli 2.
Karbenicylina disodowaVWR InternationalA1491.0005Stosowana w 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated 24-dołkowe płaskie płytkiSigma-AldrichCLS3527Stosowany w 4.1.3.
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Thermo Fisher ScientificBP231-100stosowany w 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit ZestawQiagen69104. Używany w 5.
Czytnik mikropłytek FLUOstar OmegaBMG Labtech-używany w 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK0503Zestaw do oczyszczania plazmidu. Użyte w kroku 2.3.2.
Koraliki szklane (średnica 0,5 mm)Produkty BioSpec11079105stosowane w 5.2.
GlicerolThermo Fisher Scientific10021083stosowany w 2.3.1, 3.6.2.
Izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Thermo Fisher Scientific10356553stosowany w 2.1.3.
Siarczan kanamycyny (Gibco)Thermo Fisher Scientific11815-024Stosowany w 2.1.3.
Filtry membranowe (0,45 μ m)MF-MilliporeHAWP025003.3.7
, 96-dołkowych, płaskodennych (studzienka kominowa) i mikro; CLEARGreiner Bio-One655096stosowany w 4.2.1.
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA MonarchNew England BiolabsT1020Sużywany w 1.1.2.2.
Zestaw do oczyszczania DNA Monarch PCR ZestawNew England BiolabsT1030. Używany w 1.1.2.3.
Inkubator Multitron Pro z diodami LEDInkubator InforsHT-Shakingz białymi światłami LED. Używany w 4.1.4.
Polimeraza DNA MyTaqBiolineBIO-21108stosowana w 7.1.
NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-Wstosowany w 2.3.3.
One Shot TOP10 chemicznie kompetentny E. coliThermo Fisher ScientificC404010Stosowany w 2.1.1.
Bufor fosforanowy, roztwór soli fizjologicznej (PBS) (koncentrat 10X)VWR InternationalK813Stosowany w 4.3.2.
Q5Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0491Szastosowana w 1.1.2.1.
Drabina DNA Quick-Load 1 kbNew England BiolabsN0468Sużyta na rysunku 4.
Probówki z nakrętką (1,5 ml)Starstedt72.692.210Stosowany w 3.6.3
Spektynomycyna dichlorowodorek pentahydratuVWR InternationalJ61820.06Stosowany w 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter okrągłodenne 96-dołkowe płytkiThermo Fisher Scientific612U96Stosowany w 4.3.1.
Ligaza DNA T4Thermo Fisher ScientificEL0011użyta w tabeli 2.
TissueLyser IIQiagen85300Młynek do kulek. Używany w 5.2.
do ekstrakcji DNA stosowany w mikropłytkach do oczyszczania DNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
  3. Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
  4. Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
  5. Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140(2017).
  6. Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
  7. Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
  8. Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
  9. Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
  10. Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
  11. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001(2016).
  12. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  13. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
  14. Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
  15. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  16. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  17. Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
  18. Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
  19. Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
  20. Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
  21. Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
  22. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  23. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
  24. Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
  25. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  26. Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
  27. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
  28. Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640(2016).
  29. Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
  30. Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34(2018).
  31. Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
  32. Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
  33. Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
  34. Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136(2014).
  35. Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
  36. Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
  37. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
  38. Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10(2013).
  39. Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
  40. Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
  41. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
  42. Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
  43. Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
  44. Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
  45. Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
  46. Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
  47. Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132(2015).
  48. Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
  49. Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
  50. Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , Wiley Blackwell. New York. 319-327 (2014).
  51. Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500(2014).
  52. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  53. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
  54. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828(2016).
  55. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Koniugacja cyjanobakteriizestaw narz dzi CyanoGatesk adanie wektora plazmidowegoSynechocystis PCC 6803Synechococcus elongatusanaliza cytometrycznapomiar na czytniku p ytekkojenie tr jsk adnikowesk adanie Golden Gate

Powiązane artykuły