Artykuł metodologiczny

Wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach pęcherza moczowego za pomocą fluorescencji 16S rRNA Hybrydyzacja in situ

DOI:

10.3791/60458

⸱

18 października 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Texas at Dallas, 2Department of Urology, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół służy do bezstronnego wykrywania bakterii związanych z tkankami w biopsjach pacjentów za pomocą hybrydyzacji in situ 16S rRNA i mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja interakcji bakterii z powierzchniami i tkankami błony śluzowej gospodarza może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów patogenezy. Podczas gdy wizualizacja patogenów bakteryjnych w zwierzęcych modelach infekcji może opierać się na szczepach bakteryjnych zaprojektowanych do ekspresji białek fluorescencyjnych, takich jak GFP, wizualizacja bakterii w błonie śluzowej biopsji lub tkanki uzyskanej od pacjentów wymaga bezstronnej metody. W tym miejscu opisujemy skuteczną metodę wykrywania bakterii związanych z tkankami w biopsjach u ludzi. Metoda ta wykorzystuje fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) z fluorescencyjnie znakowaną uniwersalną sondą oligonukleotydową dla 16S rRNA do znakowania bakterii związanych z tkankami w skrawkach biopsji pęcherza moczowego pobranych od pacjentów cierpiących na nawracające infekcje dróg moczowych. Dzięki zastosowaniu uniwersalnej sondy 16S rRNA bakterie mogą być wykrywane bez wcześniejszej wiedzy na temat gatunków, rodzajów lub cech biochemicznych, takich jak lipopolisacharyd (LPS), które byłyby wymagane do wykrycia przez eksperymenty immunofluorescencyjne. Opisujemy kompletny protokół dla 16S rRNA FISH od fiksacji biopsji do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być dostosowany do stosowania w prawie każdym typie tkanki i stanowi potężne narzędzie do bezstronnej wizualizacji klinicznie istotnych interakcji bakteria-gospodarz w tkance pacjenta. Ponadto, korzystając z sond specyficznych dla gatunku lub rodzaju, protokół ten można dostosować do wykrywania określonych patogenów bakteryjnych w tkance pacjenta.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drogi moczowe, składające się z cewki moczowej, pęcherza moczowego, moczowodów i nerek, są stale narażone na działanie bakterii tworzących mikrobiom układu moczowego, jak również atakujących uropatogenów, takich jak uropatogenny E. coli (UPEC), z przewodu pokarmowego1,2. Warstwa uwodnionego śluzu składająca się z glikozaminoglikanów i nieprzepuszczalna blaszka glikozylowanych białek uroplakiny wyrażonych na powierzchni komórek powierzchownych tworzy barierę, która rutynowo chroni nabłonek pęcherza moczowego przed inwazją przylegających bakterii3,4. Podczas infekcji dróg moczowych (ZUM) bariery te są naruszane lub niszczone, co ułatwia przyczepianie się do nabłonka pęcherza moczowego i inwazję na niego przez bakterie uropatogenne5,6. Prace na modelach mysich ujawniły, że wiele bakterii uropatogennych, w tym UPEC, Klebsiella pneumoniae i Enterococcus faecalis, może tworzyć replikacyjne społeczności wewnątrzkomórkowe (IBC) w cytoplazmie komórek powierzchownych i spoczynkowych rezerwuarach wewnątrzkomórkowych (QIR) w przejściowych komórkach nabłonkowych7,8,9. Chociaż UPEC został zidentyfikowany w zrzuconych komórkach nabłonka od pacjentów z ZUM, interakcja uropatogenów z błoną śluzową pęcherza moczowego u ludzi nie była wcześniej wizualizowana10.

Dostosowaliśmy powszechną technikę, fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), do wykrywania bakterii w błonie śluzowej biopsji pęcherza moczowego uzyskanych od pacjentek po menopauzie poddawanych cystoskopii z elektrofulguracją zapalenia włośnicy (CEFT) do zaawansowanego leczenia nawracających infekcji moczowych opornych na antybiotyki11. Używając uniwersalnej sondy do 16S rRNA, byliśmy w stanie obiektywnie wykryć gatunki bakterii związane z błoną śluzową pęcherza moczowego u pacjentów z nawracającymi ZUM i określić ich położenie w ścianie pęcherza moczowego12. Uniwersalna sonda nukleotydowa 16S rRNA została wcześniej zaprojektowana do celowania w konserwatywny region bakteryjnego 16S rRNA13, który odpowiada pozycjom 388-355 rRNA E. coli 16s. Sekwencje 16S rRNA i sondy mieszającej zostały wcześniej zatwierdzone i opublikowane do użytku w przewodzie pokarmowym myszy < sup class="xref">14,15. Sekwencje i właściwości sond opisano w tabeli 1. Niezbędne jest użycie dwóch sekwencyjnych sekcji w tym protokole, jednej dla sondy 16S rRNA i jednej dla sondy mieszającej, aby móc odróżnić sygnał prawdziwy od tła, ponieważ nabłonek pęcherza moczowego, kolagen i elastyna wykazują autofluorescencję16. W tym protokole 16S rRNA i sondy szyfrujące zostały zaprojektowane z fluorescencyjnymi znacznikami Alexa Fluor 488 zarówno na końcach 3', jak i 5' za pośrednictwem wiązań estrowych N-hydroksysukcynimidu (NHS) w celu zwiększenia sygnału fluorescencyjnego.

Chociaż ten protokół został opracowany do stosowania na biopsjach ludzkiego pęcherza moczowego, może być łatwo zaadaptowany do użycia na skrawkach zatopionych w parafinie z dowolnej tkanki, w której przypuszcza się, że znajdują się bakterie. W przeciwieństwie do eksperymentów immunohistochemicznych, które są ukierunkowane na określone antygeny (np. lipopolisacharyd) na powierzchni bakterii, ta metoda nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat antygenów wyrażanych przez bakterie związane z tkanką10,17. Zastosowanie uniwersalnej sondy 16S rRNA pozwala na bezstronne wykrycie wszystkich gatunków bakterii w próbce, ale nie pozwala na określenie ich tożsamości. Aby określić identyfikację wykrytych bakterii, należy użyć sond 16S lub 23S rRNA specyficznych dla gatunku lub rodzaju. Protokół ten nie wykryje również patogenów grzybiczych, takich jak Candida albicans, związanych z tkanką gospodarza. Do wykrywania patogenów grzybiczych należy użyć sond 28S lub 18S rRNA18.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badania został zatwierdzony i przestrzegał wytycznych Instytucjonalnych Komitetów Bezpieczeństwa Biologicznego i Bezpieczeństwa Chemicznego UT Dallas i UT Southwestern Medical Center. Zastosowanie biopsji od ludzi w tym protokole zostało zatwierdzone i było zgodne z wytycznymi Instytucjonalnych Komisji Rewizyjnych UT Dallas i UT Southwestern Medical Center. Wszystkie osoby zaangażowane w pobieranie i przetwarzanie biopsji przechodzą aktualne szkolenie w zakresie ochrony osób (HSP) i HIPPA.

1. Przygotowanie tkanek do utrwalania i zatapiania parafiny

UWAGA: Biopsje zostały pobrane od kobiet, które wyraziły na to zgodę, przechodząc cystoskopię z elektro-fulguracją zapalenia włośnicy w celu zaawansowanego leczenia nawracających infekcji dróg moczowych (rUTI). rUTI definiuje się jako 3 ZUM w okresie 12 miesięcy. Pobranie biopsji przeprowadzono na sali operacyjnej, gdy pacjent był pod narkozą po uzyskaniu świadomej zgody pacjenta zgodnie z protokołem UTSW IRB STU 082010-016. Wszystkie próbki zostały zakodowane i pozbawione elementów pozwalających na identyfikację przed eksperymentami.

  1. Pobrać biopsję z zimnego kubka (~1 mm3) z pęcherza moczowego za pomocą kleszczy urologicznych za pomocą elastycznego cystoskopu i natychmiast umieścić w sterylnym kriowisie o pojemności 2 ml zawierającym 1,5 ml paraformaldehydu (PFA) o stężeniu 4% v/v (PFA) przygotowanym w 1x sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).
    UWAGA: 4% PFA w 1x PBS można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.
  2. Utrwalić biopsję przez 6 godzin w temperaturze pokojowej lub przez 16-24 godziny w temperaturze 4 °C.
    nuta: Czas utrwalenia należy obliczyć na podstawie wielkości próbki tkanki i należy unikać nadmiernego utrwalenia. Nie zaleca się stosowania aldehydu glutarowego jako utrwalacza, ponieważ wprowadza on autofluorescencję.
  3. W wysterylizowanym kapturze lub komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń utrwalacz przez pipetowanie i zastąp 1,5 ml sterylnego 1x PBS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc lub natychmiast przeprowadzić obróbkę tkanek i zatapianie parafiny19.
  4. Za pomocą wysterylizowanego mikrotomu należy pokroić bloki tkanek o grubości 5 μm i przykleić skrawki tkanki parafinowej do naładowanych szkiełek mikroskopowych. W przypadku protokołu 16S rRNA FISH wymagane będą co najmniej dwa preparaty na biopsję.
    nuta: Tkanka biopsyjna powinna być ułożona w przekroju poprzecznym względem płaszczyzny cięcia, aby zapewnić wizualizację warstw urotelialnych we wszystkich sekcjach. Należy również zauważyć, że grubość przekroju powinna być zoptymalizowana pod kątem wykrywania społeczności bakteryjnych. W przypadku zakażeń, w których bakterie rezydujące w tkankach są bardzo rzadkie (np. <1 bakterii rezydujących w tkance na 1000 komórek ssaków, może być wymagane wykonanie cieńszych skrawków lub pobranie próbek z wielu odcinków seryjnych).

2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ za pomocą uniwersalnych sond 16S rRNA

UWAGA: Wymagane są dwa preparaty na biopsję. Jedna szkiełko jest potrzebne do uniwersalnej sondy 16S rRNA i jedno szkiełko do sondy kontrolnej z sekwencją zaszyfrowaną. Jest to ważne dla odróżnienia sygnału rzeczywistego od sygnału tła podczas mikroskopii, ponieważ nabłonek pęcherza moczowego jest autofluorescencyjny w wielu kanałach. Oprócz sondy szyfrującej, zablokowanie 0,1% Sudan Black B przed zamontowaniem może zmniejszyć autofluorescencję tła nieodłącznie związaną z klasą tissue20.

  1. Przygotowanie odczynników i dygestorium
    1. Wyczyść pusty wyciąg (lub odpowiednio zamontowaną komorę bezpieczeństwa biologicznego) 70% etanolem.
    2. Przygotować bufor hybrydyzacyjny składający się z 0,9 M chlorku sodu (NaCl), 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w 10 ml sterylnie przefiltrowanej wody.
      nuta: Sterylnie przefiltrowaną wodę można przygotować, przepuszczając autoklawowaną wodę destylowaną przez filtr 0,22 μM. Bufor hybrydyzacyjny może być przechowywany w temperaturze pokojowej, ale SDS może wytrącać się z roztworu. Jeśli SDS wytrąci się, przed użyciem podgrzej roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
    3. Przygotuj co najmniej 100 ml 95% i 90% etanolu w sterylnie przefiltrowanej wodzie w umytych, autoklawowanych butelkach.
    4. Rozpuścić znakowane fluorescencyjnie liofilizowane sondy w 10 mM buforze (pH 8,0) Tris-HCl (pH 8,0) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) przygotowanym w sterylizowanej przez filtr wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 100 μM. Przygotować rozcieńczenie 1 μM w buforze TE do użycia w tym protokole. Przechowuj zarówno skoncentrowane sondy 100 μM, jak i 1 μM przygotowane sondy w temperaturze -20 °C, chronione przed światłem.
      nuta: Nie rozpuszczaj sond znakowanych fluorescencyjnie w wodzie. Buforowanie jest wymagane, aby zapobiec hydrolizie wiązania estrowego NHS sprzężonego fluoroforu z sondą nukleotydową.
    5. Umyj pięć słoików Coplin 70% etanolem, pozostaw do wyschnięcia, oznacz w następujący sposób: ksyleny I, ksyleny II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O i napełnij 100 ml odpowiedniego roztworu. Pomoże to uniknąć nieporozumień w późniejszych krokach.
  2. Depatynizacja i rehydratacja tkanek
    1. W kapturze umieść dwa szkiełka na biopsję w pionowym stojaku na szkiełka.
    2. Umieść pionowy stojak na suwaki w słoiku z ksylenami I Coplin (zawierającym 100 ml ksylenów) na 10 minut.
    3. Wyjmij stojak na suwaki z ksylenów I i osusz spód na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar ksylenów. Włożyć do słoika xylenes II Coplin na 10 min.
      nuta: Nigdy nie pracuj z ksylenami poza certyfikowanym wyciągiem.
    4. Ponownie uwodnić odparafinowane skrawki tkanek w kolejnych płukaniach etanolem (95% i 90%) przez 10 minut każde w odpowiednio oznaczonych słoikach z kopliny.
      nuta: Na tym etapie ogrzej bufor hybrydyzacyjny do temperatury 50-56 °C w łaźni wodnej
    5. Wyjmij ruszt szkiełkowy z mycia 90% etanolem, osusz spód na ręcznikach papierowych, aby usunąć nadmiar etanolu i umieść w słoiku ddH2O Coplin zawierającym 100 ml wysterylizowanego przez filtr ddH2O na 10 minut.
    6. Czekając na przemycie ddH2O, rozcieńczyć sondy do 10 nM w buforze hybrydyzacyjnym, aby utworzyć roztwór barwiący. Przygotować 150 μl roztworu barwiącego na szkiełko.
      nuta: Chroń roztwór barwiący przed światłem, owijając probówki folią aluminiową i przechowując w szufladzie. Podczas pracy z sondami oznaczonymi fluorescencyjnie na blacie stołu, rozważ wyłączenie świateł górnych, jeśli to możliwe. Sondy rozcieńczone w buforze hybrydyzacyjnym nie powinny być ponownie używane.
  3. Hybrydyzacja i barwienie przeciwstawne
    1. Przygotuj komorę nawilżającą dla każdej sondy, umieszczając namoczoną, pogniecioną Kimwipe i sterylną wodę w zbiorniku pudełka na końcówki P1000. Umieść wkład z uchwytem końcówki na górze - w tym miejscu będą znajdować się szkiełka.
      nuta: Ważne jest, aby użyć komory nawilżającej, aby zapobiec wysychaniu skrawków biopsji podczas hybrydyzacji. Należy zauważyć, że dostępne na rynku komory nawilżacza są zaprojektowane tak, aby utrzymywać stabilną, wilgotną atmosferę. Jednak opisana tutaj technika w wystarczającym stopniu kontroluje wilgotność przy znacznie niższych kosztach.
    2. Wyjmij szkiełka ze stojaka na slajdy i połóż na świeżym ręczniku papierowym (chusteczką do góry). Użyj Kimwiste, aby wysuszyć szkiełko. Uważaj, aby delikatnie przetrzeć w pobliżu (nie na) sekcji biopsji, aby odprowadzić wodę. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obwódkę wokół sekcji biopsji i umieść szkiełko stroną z tkanką do góry w komorze nawilżającej.
      nuta: Pracuj szybko, aby tkanki nie wyschły przed hybrydyzacją.
    3. Umieścić komorę nawilżania w inkubatorze ustawionym na 50 °C. Odpipetować 50-150 μl roztworu barwiącego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby prostokąt utworzony przez hydrofobową obwódkę wokół tkanki został wypełniony. Uważaj, aby nie dodać zbyt dużo roztworu, aby nie przelać hydrofobowej granicy. Delikatnie zamknij pudełko.
    4. Inkubować przez noc (~16 h) w temperaturze 50 °C w ciemności. Jeśli inkubator ma okno, przykryj je folią aluminiową, aby stworzyć ciemne otoczenie.
      nuta: Temperatura hybrydyzacji niższa od temperatury topnienia sondy FISH jest wymagana dla niezawodnego sygnału. 50 °C to optymalna temperatura dla uniwersalnej sondy 16S rRNA, ale może nie być optymalna dla innych sond.
    5. Następnego ranka przygotuj co najmniej 500 ml buforu do płukania składającego się z 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) w ddH2O i przefiltruj do sterylnej butelki z próżniowym filtrem górnym. Podgrzać do 50-56 °C w łaźni wodnej.
    6. Wyjmij szkiełka z komór nawilżających i ostrożnie usuń pozostały roztwór hybrydyzacyjny za pomocą Kimwipe. Umieść szkiełka w pionowym stojaku do barwienia.
    7. Umieść ruszt do barwienia w nieprzezroczystym słoiku Coplin zawierającym 100 ml wstępnie podgrzanego buforu do mycia na 10 minut. Jeśli słoiki Coplin nie są nieprzezroczyste (np. szkło), umieść je w ciemności podczas etapów inkubacji - być może pod pudełkiem lub w szufladzie.
    8. Powtórz krok mycia dwukrotnie ze świeżym buforem do mycia w nowych słoikach Coplin.
    9. Na etapach płukania należy przygotować barwnik przeciwbarwny, rozcieńczając roztwór podstawowy Hoechst 33342 1:1 000 w roztworze do płukania. Do tej samej probówki dodaj aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa-555 (WGA) do końcowego stężenia 5 μg/ml i Alexa-555 falloidynę do końcowego stężenia 33 nM. Przechowywać w ciemności, aż będzie gotowy do użycia.
      nuta: Hoechst, Alexa-555 WGA i Alexa-555 Phalloidin oznaczają odpowiednio DNA, mucynę/uroplakiny i aktynę i mogą być przechowywane przez długi czas w ciemności zgodnie z instrukcjami producenta. Etykiety fluorescencyjne stosowane do sond i przeciwbarwień można dostosować do zestawów filtrów dostępnych dla mikroskopu, który ma być używany.
    10. Wyjmij szkiełka z ostatniego prania i delikatnie odchodź nadmiar bufora do mycia za pomocą Kimwipe. Umieść szkiełka chusteczką do góry na ręczniku papierowym i dodaj 50-150 μl barwnika przeciwdziałającego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby hydrofobowa granica była wypełniona, ale nie przelewała się. Przykryj do czterech szkiełek pokrywką cryoboxu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Umieść boki z powrotem w stojaku do barwienia i umyj jeszcze dwukrotnie w słoikach Coplin ze świeżym buforem do mycia, przez 10 minut każdy.
    12. Po ostatnim praniu dokładnie osusz szkiełka i połóż chusteczkę do góry na ręczniku papierowym pod pokrywą krioboxu. Wyciśnij jedną kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na chusteczkę. Delikatnie umieść na wierzchu szkiełko nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze (zależy to od wielkości biopsji). Delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki, ponieważ będą one zakłócać obrazowanie, i pozwól szkiełkom z okładką utwardzić się przez noc w ciemności.
    13. Następnego dnia uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego do szkiełka cienką warstwą bezbarwnego lakieru do paznokci. Pozostawić do wyschnięcia na 10 minut w ciemności, a następnie przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do mikroskopii konfokalnej.

3. Wizualizacja 16S rRNA FISH za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Dla tego protokołu, najlepsze wyniki osiąga się za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywami 63x i 100x. Wymagane są odpowiednie zestawy filtrów do wizualizacji fluorescencji Hoechst, Alexa-488 i Alexa-555. Jednak standardowa mikroskopia fluorescencyjna może być użyta, jeśli mikroskop konfokalny jest niedostępny. Ten protokół dotyczy laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.

  1. Włącz mikroskop konfokalny i oprogramowanie komputerowe powiązane z mikroskopem zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Załaduj szkiełko i wizualizuj za pomocą obiektywu 10x w kanale niebieskim (DAPI/Hoechst). Ustaw ostrość ostrożnie, aż jądra będą widoczne.
  3. Po ustawieniu ostrości zmień obiektyw na duże powiększenie (63x lub 100x). Dodać olej na wierzch szkiełka nakrywkowego. Ponownie ustaw ostrość za pomocą nowego obiektywu, upewniając się, że soczewka obiektywu ma kontakt z olejem podczas ustawiania ostrości.
    nuta: Używaj tylko precyzyjnego ustawiania ostrości przy dużym powiększeniu (63x lub 100x). Olej powinien być używany tylko do obiektywu olejowego.
  4. Szybko oceń każdy slajd przez okular w zielonym kanale (eGFP/Alexa-488), aby określić, które slajdy są FISH dodatnie, a które FISH ujemne.
    nuta: Najlepiej jest, jeśli ta wstępna ocena/punktacja jest wykonywana w ciemno przez oddzielną osobę, aby zmniejszyć błąd systematyczny.
  5. Aby zobrazować barwione biopsje, zacznij od dodatniego slajdu FISH i przejdź do trybu wizualizacji komputerowej. Wybierz kanały 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Ustaw otwór otworkowy przy użyciu kanału o najdłuższej długości fali, w tym przypadku 555. Znajdź właściwą płaszczyznę ogniskową do wizualizacji oznakowanych bakterii w kanale 488. Nie zmieniając płaszczyzny ogniskowej, ustaw wzmocnienie, moc lasera i przesunięcie dla każdego kanału tak, aby sygnał nie był nasycony, a tło nie było nadmiernie korygowane. Uzyskaj obraz we wszystkich trzech kanałach.
    nuta: Użyj tych samych ustawień dla kanału 488, aby wyświetlić obraz każdego slajdu w eksperymencie. Moc lasera może wymagać regulacji w kanałach 405 i 555, jeśli optymalna płaszczyzna ogniskowej do wizualizacji bakterii zmienia się między polami.
  6. Powtarzaj na dodatkowych polach, aż uzyskasz obrazy całej powierzchni nabłonka.
    nuta: Być może będziesz musiał nieznacznie zmienić płaszczyznę ogniskowej, aby uwidocznić znakowane bakterie w różnych polach, ale nigdy nie zmieniaj wzmocnienia, mocy lasera ani przesunięcia dla kanału 488 między polami. W przypadku pracy na mikroskopie konfokalnym przydatne może być uchwycenie stosu Z, aby można było przeanalizować trójwymiarową lokalizację bakterii w tkance.
  7. Przetwarzaj obrazy i określaj ilościowo znakowane bakterie w tkance lub z nią związane za pomocą ImageJ lub podobnego oprogramowania. Zalecane jest minimalne przetwarzanie obrazów (np. dzielenie/łączenie kanałów i konwertowanie na pliki obrazów), chociaż w razie potrzeby można wykonać korekcję tła. Wszystkie poprawki lub inne zmiany powinny pozostać spójne między obrazami.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zoptymalizowany pod kątem bezstronnego wykrywania bakterii związanych z błoną śluzową pęcherza moczowego w biopsjach pęcherza z parafiną. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne mikrofotografie konfokalne z eksperymentu z użyciem tego protokołu na odcinkach biopsji pęcherza moczowego uzyskanych od kobiet z nawracającymi infekcjami dróg moczowych. Dwie sekcje szeregowe zostały zhybrydyzowane z uniwersalnymi sondami 16S rRNA (górne panele) lub mieszającymi (dolne panele). Wykonano obrazy z tego samego obszaru tkanki, a bakterie (kolor zielony) są wyraźnie widoczne w tkance zhybrydyzowanej z sondami 16S rRNA, a nie z sondą mieszającą. Rysunek 2 przedstawia fałszywie pozytywny wynik. Sygnał odpowiadający autofluorescencyjnemu kolagenowi lub elastynie jest wykrywany w kanałach 405 i 488 zarówno w sekcjach biopsji 16S rRNA, jak i hybrydyzowanych sondami mieszającymi, co podkreśla znaczenie zawsze używania kontroli sondy szyfrującej.

pkt.
SondykolejnośćTmFluoroforPowiązania
Uniwersalny 16S rRNA 5'-GCTGCCTCCC
GTAGGAGT-3'		54,9Alexa-488 (5' i 3')Ester NHS
Wyścig5'-ACTCCTACGG
GAGGCAGC-3'		nieAlexa-488 (5' i 3')Ester NHS

Tabela 1: Sekwencje i charakterystyka sondy FISH. Tm oznacza temperaturę topnienia, a NHS to skrót od N-hydroksysukcynimidu.

figure-results-1
Rycina 1: Reprezentatywne mikrofotografie konfokalne FISH uniwersalnego 16S rRNA i sondy mieszającej w biopsji ludzkiego pęcherza moczowego. Aktyna i mucyna są oznaczone na czerwono, jądra komórkowe są oznaczone na niebiesko, a bakterie na zielono. Bakterie związane z tkankami są wykrywane tylko za pomocą sondy 16SrRNA, a nie za pomocą mieszanki. Zdjęcia wykonane w powiększeniu 63x. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywne mikrofotografie konfokalne fałszywie dodatniej zielonej autofluorescencji w biopsji ludzkiego pęcherza moczowego. Aktyna i mucyna są oznaczone na czerwono, jądra komórkowe na niebiesko, a bakterie i składniki autofluorescencyjne macierzy zewnątrzkomórkowej (np. kolagen i elastyna) są oznaczone na zielono. Zieloną fluorescencję obserwuje się zarówno w przypadku 16S rRNA, jak i sond mieszających, co wskazuje na fałszywie dodatni wynik. Zdjęcia są wykonywane w powiększeniu 63x. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy protokół wykrywania bakterii związanych z tkankami w biopsjach ludzkiego pęcherza moczowego za pomocą 16S rRNA FlSH. Protokół ten można łatwo dostosować do biopsji pobranych z innych tkanek, takich jak przewód pokarmowy lub skóra, i można go rozszerzyć na tkanki pobrane z różnych organizmów modelowych ssaków. Opisany tutaj protokół może być również dostosowany do stosowania technik wielokrotnego utrwalania (np. formalina, etanol, metakarna) i przygotowania tkanek (np. zatopionych w parafinie lub żywicy oraz tkanek kriokonserwowanych). Podwójnie znakowana uniwersalna sonda 16S rRNA pozwala na bezstronne wykrywanie wszystkich gatunków bakterii obecnych w tkance i może dostarczyć cennych informacji na temat tego, w jaki sposób patogeny i mikrobiota oddziałują przestrzennie z powierzchniami błony śluzowej w stanie choroby i zdrowia. Korzystając z zasobów takich jak probeBase, PhylOPDb lub narzędzie PROBE_DESIGN pakietu oprogramowania ARB do wyboru lub projektowania sond 16S lub 23S rRNA specyficznych dla gatunków lub rodzajów, protokół ten można dostosować do wykrywania określonych gatunków lub rodzajów bakterii w tkance 15,21,22. Ważnym kierunkiem rozwoju tej metody jest multipleksowanie przy użyciu sond specyficznych dla gatunku lub rodzaju, znakowanych różnymi, dyskretnymi fluoroforami w celu oceny różnorodności mikrobiologicznej w błonie śluzowej pęcherza moczowego.

Podstawowym ograniczeniem tej metody do stosowania na próbkach ludzkich jest dostępność tkanki poddanej biopsji. Do uzyskania biopsji wymagana jest zgoda Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej i świadoma zgoda pacjenta, a bezpośrednia współpraca z klinicystą wykonującym zabieg jest niezbędna do optymalnego pobrania próbki i dostępu do metadanych pacjenta. Sam zabieg CEFT niszczy nabłonek pęcherza moczowego, więc byliśmy w stanie uzasadnić biopsję tych obszarów przed zabiegiem. Do tego protokołu wymagany jest wyciąg wyciągowy lub odpowiednio wyposażona komora bezpieczeństwa biologicznego ze względu na zastosowanie toksycznych ksylenów na etapie deparafinowania i konieczność utrzymania sterylnego środowiska przez cały czas trwania procedury. Do tego protokołu wymagany jest mikroskop fluorescencyjny, najlepiej konfokalny, z obiektywem 63x lub 100x i odpowiednimi zestawami filtrów do wizualizacji Hoechst, Alexa-555 i Alexa-488. Reprezentatywne wyniki przedstawione na rysunku 1 zostały zobrazowane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Podobne laserowe mikroskopy skaningowe powinny dawać porównywalne obrazy. Protokół ten jest ograniczony ze względu na jego zdolność do wykrywania tylko bakterii związanych z tkankami, a nie na przykład grzybów. Do identyfikacji patogenów grzybiczych w tkance 18 należy użyć sond specyficznych dla rRNA grzyba18S lub 28S.

Kluczowe kroki tego protokołu obejmują utrzymanie sterylnego środowiska przez cały czas trwania procedury i zapewnienie, że tkanka nie wysycha między etapami hybrydyzacji i barwienia. Jeśli tkanka wyschnie podczas zabiegu, sygnał może zostać stłumiony lub tkanka może spaść z szkiełka podczas etapu mycia. Bardzo ważne jest również, aby zawsze używać dwóch sekcji szeregowych dla tego protokołu - jednej dla sondy 16S rRNA i jednej dla sondy szyfrującej. Bez tej kontroli odróżnienie wyników fałszywie dodatnich może być bardzo trudne, a uzyskane dane mogą nie być przydatne lub pouczające. Jeżeli protokół ten jest dostosowywany do użytku z sondą inną niż uniwersalna sonda 16S rRNA, należy zwrócić uwagę na wybór odpowiedniej temperatury hybrydyzacji, o około 5 °C niższej niż przewidywana temperatura topnienia sondy. Aby utrzymać intensywność sygnału, tkanka nie może być wystawiona na działanie światła przez długi czas po dodaniu sondy i nie może być prześwietlona podczas mikroskopii. Wreszcie, podczas mikroskopii te same ustawienia dla kanału odpowiadającego fluoroforowi sprzężonemu z sondą FISH muszą być spójne między szkiełkami eksperymentalnymi (sonda 16S rRNA) i kontrolnymi (sonda mieszająca). Wizualizacja relacji przestrzennych bakterii na powierzchniach błony śluzowej tkanek pobranych od pacjenta ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia i zbudowania klinicznie istotnych hipotez na temat interakcji gospodarz-patogen leżących u podstaw choroby zakaźnej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Kim Orth i Marceli de Souza Santos za porady dotyczące protokołu oraz Amandzie Arute za wsparcie techniczne. Praca ta była częściowo wspierana przez Katedrę Biologii Systemowej Cecila H. i Idy Green prowadzoną przez K.P.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa-555 PhalloidinInvitrogenA34055Aktyna barwiąca
Alexa-555 Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA)InvitrogenW32464Barwienie Mucyny
Filtry górne do butelekFisher Scientific09-741-07Sterylizacja
Coplin JarSimportM900-12WDeparafinizacja/mycie
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-548-5M
Mikroskopia EtanolFisher Scientific04-355-224Rehydratacja
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodzianFisher ScientificS311-500TE
Matowe szkiełkaThermo Fisher Scientific12-550-343
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodnyInvitrogenH21492Barwienie Nucleus
Marker hydrofobowyVector LaboratoriesH-4000Bariera hydrofobowa
KimwipesFisher Scientific06-666-11
Olejek Immersol 518 FFisher Scientific12-624-66A
Paraformaldehyd (16%)Thermo ScientificTJ274997 Fixation
ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciuInvitrogenP36934Pożywka montażowa
Chlorek soduFisher ScientificBP358-10Bufor hybrydyzacyjny/PBS
Dodecylosiarczan soduFisher ScientificBP166-500Bufor hybrydyzacyjny
Fosforan sodu dwuzasadowy HepahydratFisher ScientificS373-500PBS
Fosforan sodu Monobasic MonohydratFisher ScientificS369-500PBS
StrzykawkaVWR75486-756Sterylizacja
Tris-HClFisher ScientificBP152-5TE/Bufor hybrydyzacyjny
KsylenFisher ChemicalX3P-1GALDeparafinizacja
0,22 i mu; m filtr strzykawkowyFisher Scientific09-754-29Sterylizacja
Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
  2. Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
  3. Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
  4. Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
  5. Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
  6. Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
  7. Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
  8. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
  9. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
  10. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329(2007).
  11. Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
  12. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
  13. Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
  14. Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
  15. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
  16. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  20. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  21. Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
  22. Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FISH 16S rRNAanaliza biopsji p cherza moczowegowykrywanie bakterii zwi zanych z tkankobrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnejuniwersalna sonda 16S rRNAprzygotowanie skrawk w biopsjiaplikacja barwnika kontrastowegotechnika hydrofobowej obw dkikontrola sond typu scramble

Powiązane artykuły