Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

DOI:

10.3791/60462

⸱

8 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Szent István University, 2Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny jest tutaj szczegółowy protokół użycia zarodków danio pręgowanego Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych. Protokół obejmuje rozmnażanie ryb i leczenie zarodków, a także kładzie nacisk na wykrywanie, dokumentowanie i ocenę sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W środowisku jest wiele związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC), zwłaszcza substancji estrogenowych. Wykrycie tych substancji jest trudne ze względu na ich różnorodność chemiczną; W związku z tym stosuje się coraz więcej metod wykrywania efektów, takich jak organizmy biomonitorujące/bioindykujące wrażliwe na efekt estrogenowy. Te organizmy biomonitorujące obejmują kilka modeli ryb. Protokół ten obejmuje wykorzystanie linii transgenicznej Tg (vtg1: mCherry) danio pręgowanego jako organizmu do biomonitoringu, w tym rozmnażania ryb i leczenia zarodków, z naciskiem na wykrywanie, dokumentację i ocenę sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez EDC. Celem pracy jest wykazanie wykorzystania zarodków linii transgenicznej Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych. Praca ta dokumentuje zastosowanie transgenicznych zarodków danio pręgowanego Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych poprzez testowanie dwóch substancji estrogenowych, α- i β-zeralenolu. Opisany protokół jest jedynie podstawą do projektowania testów; Metoda badawcza może być zmieniana w zależności od punktów końcowych badania i próbek. Co więcej, można ją łączyć z innymi metodami testowania, ułatwiając w ten sposób przyszłe wykorzystanie linii transgenicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje znaczna liczba związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC), które należą do najbardziej niebezpiecznych substancji w naszym środowisku. Są to głównie związki estrogenne, które zanieczyszczają wodę z zasobów naturalnych. Różnorodność chemiczna substancji należących do tej grupy sprawia, że badanie na ich obecność jest trudne, ponieważ do ich wykrycia wymagane są różne metody analityczne. Na podstawie ich budowy chemicznej bardzo trudno jest określić, czy substancja jest rzeczywiście w stanie działać jak estrogen. Ponadto substancje te nigdy nie występują w czystej postaci w środowisku, więc na ich działanie mogą wpływać również inne związki1. Problem ten można rozwiązać za pomocą metod wykrywania efektów, takich jak użycie organizmów biomonitorujących/bioindykujących, które wykazują działanie estrogenowe2,3,4,5.

Ostatnio opracowano różne systemy testowe oparte na liniach komórkowych6 i drożdżach2,3 zostały opracowane do wykrywania efektów estrogenowych. Jednak na ogół są one w stanie wykryć tylko wiązanie substancji z receptorem estrogenowym2,3. Ponadto nie są w stanie modelować złożonych procesów fizjologicznych w organizmie ani wykrywać wrażliwych na hormony faz życia; W związku z tym często prowadzą do fałszywych wyników.

Wiadomo, że pewne geny reagują wrażliwie na estrogen w organizmach żywych7. Wykrywanie produktów genów za pomocą metod biologii molekularnej jest również możliwe na poziomie białka lub mRNA8,9, ale zwykle wiąże się to z uśmierceniem zwierząt. Przepisy dotyczące ochrony zwierząt stały się bardziej rygorystyczne i rośnie zapotrzebowanie na alternatywne systemy testowe, które minimalizują liczbę i cierpienie zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach lub zastępują model zwierzęcy innym systemem modelowym10. Wraz z odkryciem białek fluorescencyjnych i stworzeniem linii biomarkerów, technologie transgeniczne stanowią dobrą alternatywę11. Dzięki tym liniom aktywacja genu wrażliwego na estrogen może być testowana in vivo.

Wśród kręgowców potencjał ryb w ocenie ryzyka środowiskowego jest wyjątkowy. Mają wiele zalet w porównaniu z modelami ssaków: będąc organizmami wodnymi, są w stanie wchłaniać zanieczyszczenia przez całe ciało, produkują dużą liczbę potomstwa, a niektóre z ich gatunków charakteryzują się krótkim czasem pokoleniowym. Ich układ hormonalny i procesy fizjologiczne wykazują duże podobieństwa do innych kręgowców, a nawet do ssaków, w tym ludzi12.

Znanych jest również kilka genów do wykrywania efektów estrogenowych u ryb. Najważniejsze z nich to receptory estrogenowe aromatazy-b, choriogeniny-H i witellogeniny (vtg)7,13. Ostatnio stworzono również kilka linii biosensorów produkujących estrogen z modeli ryb używanych w laboratorium, takich jak danio pręgowany (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Główną zaletą danio pręgowanego w tworzeniu linii biosensorów jest przezroczyste ciało zarodków i larw, ponieważ fluorescencyjny sygnał reporterowy może być następnie łatwo badany in vivo bez poświęcania zwierzęcia10. Oprócz ochrony zwierząt jest to również cenna funkcja, ponieważ pozwala na badanie reakcji tego samego osobnika w różnych momentach zabiegu18.

Te eksperymenty wykorzystują transgeniczną linię do badania wirusa wintellogeniny dla transgenicznego danio pręgowanego15. Konstrukt transgenu używany do rozwoju Tg(vtg1:mCherry) ma długi (3,4 kbp) naturalny promotor witellogeniny-1. Receptor estrogenowy (ER) jest białkiem wzmacniającym aktywowanym przez ligandy, które jest przedstawicielem nadrodziny receptorów steroidowych / jądrowych. ER wiąże się ze specyficznymi sekwencjami DNA zwanymi elementami odpowiedzi estrogenowej (ERE) o wysokim powinowactwie i transaktywuje ekspresję genów w odpowiedzi na estradiol i inne substancje estrogenowe, więc im więcej ERE w promotorze, tym silniejsza odpowiedź19. W regionie promotorowym konstruktu transgenu Tg(vtg1:mCherry) znajduje się 17 miejsc ERE i oczekuje się, że będą naśladować ekspresję natywnego genu vtg 15. U dojrzałych płciowo samic występuje ciągła ekspresja sygnału fluorescencyjnego. Jednak u samców i zarodków ekspresja w wątrobie jest widoczna dopiero po leczeniu substancjami estrogenowymi (Ryc. 1).

figure-introduction-1
Ryc. 1: Czerwony sygnał fluorescencyjny w wątrobie transgenicznego dorosłego danio pręgowanego vtg1:mCherry i zarodków 5 dpf, po indukcji 17-ß-estradiolu (E2). U kobiet i mężczyzn leczonych E2 (czas ekspozycji 25 μg / l: 48 godzin) silna fluorescencja wątroby jest widoczna nawet przez pigmentowaną skórę. U nieleczonego samca (A) nie jest widoczny sygnał fluorescencyjny. Po indukcji E2 (czas ekspozycji 50 μg/l: 0-120 hpf) można również zaobserwować czerwony sygnał fluorescencyjny w wątrobie zarodków 5 dpf, który nie jest widoczny w zarodkach kontrolnych (B). Podczas gdy sygnał fluorescencyjny jest stale obecny u dorosłych samic, głównie samce i zarodki linii są odpowiednie do wykrywania efektów estrogenowych. (BF: jasne pole, mCherry: widok z czerwonym filtrem fluorescencyjnym, pojedyncze gładkie obrazy, podziałka A: 5 mm, podziałka B: 250 μm) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podobnie jak endogenna witellogenina, reporter mCherry ulega ekspresji tylko w wątrobie. Ponieważ witellogenina jest wytwarzana tylko w obecności estrogenu, w kontrolach nie ma sygnału fluorescencyjnego. Ponieważ wyrażenie znajduje się tylko w wątrobie, ocena wyników jest znacznie łatwiejsza15.

Czułość i użyteczność zarodków tej linii zostały zbadane na różnych mieszaninach związków estrogenowych, a także na próbkach środowiskowych15,20, a w większości przypadków udokumentowano zależności między dawką a odpowiedzią (Rysunek 2). Jednak w przypadku substancji wysoce toksycznych, głównie hepatotoksycznych (np. zearalenonu), w wątrobie leczonych zarodków może być widoczny tylko bardzo słaby sygnał fluorescencyjny, a maksymalna intensywność wywołanego sygnału fluorescencyjnego może zostać osiągnięta w bardzo małym zakresie stężeń, co utrudnia ustalenie zależności dawka-skutek20.

figure-introduction-2
Rycina 2: Diagram dawka-odpowiedź (A) i obrazy fluorescencyjne (mCherry) wątroby (B) narażonej na działanie 17-α-etynylostradiolu (EE2), w 5 dpf vtg1:mWiśnia. Wyniki są wyrażone jako zintegrowana gęstość wygenerowana na podstawie siły sygnału i wielkości dotkniętego obszaru (±SEM, n = 60). 100% odnosi się do obserwowanego maksimum. Intensywność sygnału fluorescencyjnego wzrastała stopniowo wraz ze stężeniem. Podziałka = 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W środowisku występuje kilka substancji estrogenowych, takich jak 17-β-estradiol (stężenie środowiskowe: 0,1-5,1 ng/L)21, 17-α-etynyloestradiol (stężenie środowiskowe: 0,16–0,2 μg/L)22, zearalenon (stężenie środowiskowe: 0,095–0,22 μg/L)23, bisfenol-A (stężenie w środowisku: 0,45–17,2 mg/L)24. Podczas testowania tych substancji w czystej aktywnej formie z pomocą transgenicznych zarodków mCherry, najniższe obserwowane stężenia efektu (LOEC) dla wykrywania znaków fluorescencyjnych wynosiły 100 ng/L dla 17-ß-estradiolu, 1 ng/L dla 17-α-etynylostradiolu, 100 ng/L dla zearalenonu i 1 mg/L dla bisfenolu-A (leczenie 96-120 hpf), który jest bardzo bliski lub mieści się w zakresie stężeń środowiskowych substancji15. Linia transgeniczna Tg (vtg1: mCherry) może pomóc w wykrywaniu estrogenności w próbkach ścieków po bezpośrednim narażeniu. Linia jest tak czuła, jak powszechnie stosowany test estrogenowy drożdży, test bioluminescencyjnego estrogenu drożdżowego (BLYES) 15. Za pomocą tej linii potwierdzono ochronne działanie beta-cyklodekstryn przed toksycznością wywołaną zearalenonem za pomocą mieszanin chemicznych20.

W niedawnym raporcie, zastosowanie linii transgenicznej in vivo zostało zademonstrowane z pomocą dwóch metabolitów estrogenowego zearalenonu (ZEA), α- i β-zearalenolu (α-ZOL i β-ZOL)25. Punkt odniesienia protokołu jest odpowiedni do badania estrogenowego wpływu kilku związków lub próbek środowiskowych na zarodki Tg(vtg1:mCherry).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół dla zwierząt został zatwierdzony zgodnie z węgierską ustawą o dobrostanie zwierząt i wszystkie badania zostały zakończone, zanim leczone osoby osiągnęły etap swobodnego żywienia.

1. Pobieranie i leczenie zarodków

  1. Utrzymuj Tg(vtg1:mCherry) danio pręgowanego w temperaturze 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, przewodności między 525 ± 50 μS/m, poziomu tlenu ≥80% nasycenia oraz 14 godzin światła i 10 godzin cyklu ciemnego.
  2. Napełnij zbiorniki godowe wodą systemową i przygotuj ryby do krycia po południu przed zbiorem jaj.
  3. Umieść samce i samice ryb w zbiorniku i oddziel je za pomocą przegrody.
  4. Wyjmij przegrodę ze zbiorników, gdy światło włączy się następnego ranka. Sprawdzaj zbiorniki kryjące pod kątem jaj co 15–20 minut.
  5. Zbierz wszystkie zarodki za pomocą sitka do herbaty lub gęsto tkanej drobnej siatki i połącz je w jedną dużą szalkę Petriego z buforem E3 (5 mM chlorku sodu, 0,17 mM chlorku potasu, 0,33 mM chlorku wapnia, 0,33 mM siarczanu magnezu) lub czystą wodą systemową.
  6. Umieścić zarodki w inkubatorze nastawionym na temperaturę 25,5 ± 0,5 °C.
  7. Po 1–1,5 godziny wyjąć i wyrzucić niezapłodnione lub nieodpowiednio dzielące się jaja za pomocą plastikowej pipety transferowej pod mikroskopem preparacyjnym.
    UWAGA: Niezapłodnione jaja są nieprzezroczyste; Zapłodnione jaja są przezroczyste. Aby rozpocząć leczenie w późniejszym etapie rozwoju, należy zwrócić uwagę na prawidłowy rozwój leczonych osób.
  8. Umieścić wybrane zarodki w naczyniach zabiegowych (np. na szalkach Petriego lub płytkach do hodowli tkankowych), które zostały już oznakowane i wypełnione różnymi stężeniami substancji badanej.
  9. Inkubować zarodki w temperaturze 25,5 ± 0,5 °C do końca doświadczenia><. UWAGA: Zarodki mogą reagować ze znaczną indywidualną wrażliwością na różne związki estrogenowe, dlatego zaleca się użycie co najmniej 15 zarodków w co najmniej trzech powtórzonych zabiegach w celu prawidłowej oceny eksperymentu. Wybierając pojemnik, należy pamiętać, że rozwój zarodka wymaga co najmniej 200 μL wody26. W tym eksperymencie zarodki inkubowano do 120 hpf w temperaturze 25,5 ± 0,5 °C.
  10. Odświeżyć roztwór badany, jeśli jest to konieczne do utrzymania stężenia poddanego działaniu substancji. Zachowaj ostrożność podczas zmiany roztworu testowego, aby uniknąć uszkodzenia zarodków.
    UWAGA: Podczas eksperymentu możliwe jest również zbadanie śmiertelności lub objawów subletalnych. Stosowane stężenia powinny pozostać jak najbardziej stabilne, aby uzyskać wiarygodne wyniki. Można to łatwo osiągnąć poprzez odświeżenie roztworów testowych. Częstotliwość odświeżania może się różnić w zależności od substancji badanej. Dlatego zaleca się sprawdzenie stężenia substancji badanej za pomocą pomiarów analitycznych w celu określenia częstotliwości aktualizacji roztworu.

2. Przygotowanie larw do fotografii

  1. Przygotuj wcześniej 4% metylocelulozy z MS-222 (trikaina-metano-sulfonian).
    1. W tym celu należy dodać 4 mg/ml MS-222 do 100 ml podwójnie destylowanej wody do końcowego stężenia 0,168 mg/ml i doprowadzić roztwór do 4 °C. Następnie dodaj 4 g metylocelulozy. Wymieszać mieszadłem magnetycznym, a następnie pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
    2. Następnego dnia ponownie wymieszaj, a roztwór powinien być gotowy do użycia. Jeśli metyloceluloza nie jest całkowicie rozpuszczona, należy ją ponownie nagrzać w temperaturze 4 °C i odczekać jeszcze kilka godzin.
  2. Umieścić 5-dniowe larwy na 5-centymetrowej szalce Petriego na każdą grupę badaną za pomocą pipety Pasteura.
  3. Usunąć roztwór leczniczy z larw za pomocą plastikowej pipety, a następnie napełnić szalkę Petriego 2 ml 0,02% roztworu znieczulającego MS-222.
    UWAGA: Znieczulenie jest zwykle skuteczne w mniej niż minutę. Larwy są znieczulane, jeśli nie odpływają w odpowiedzi na dotyk. Przedawkowanie MS-222 może zabić larwy.
  4. Wypełnij każdy kwadrat specjalnie zaprojektowanej 10-centymetrowej szalki Petriego 4% metylocelulozy za pomocą MS-222 (Rysunek 3).
    UWAGA: Przyklej dwa kwadratowe obszary o wymiarach 1,5 x 1,5 cm na dnie szalki Petriego za pomocą plastikowych arkuszy (1 mm wysokości, 5 mm szerokości). Dwadzieścia larw można umieścić obok siebie w kwadracie. Zamiast specjalnie zaprojektowanej szalki Petriego, do ustalenia pozycji zarodków można użyć innego pojemnika o niskiej krawędzi.

figure-protocol-1
Ryc. 3: Szalka Petriego o średnicy 10 cm z przyklejonymi kwadratami z tworzywa sztucznego o wymiarach 1,5 x 1,5 cm i grubości 1 mm do przygotowania larw do fotografii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przenieś znieczulone larwy do metylocelulozy z niewielką ilością wody w jednym z dwóch kwadratów. Z pierwszego kwadratu przenieś larwy do drugiego kwadratu.
    UWAGA: Dzięki temu transferowi 4% metylocelulozy używanej do fotografii nie zostanie rozcieńczone, a larwy nie będą się obracać podczas obrazowania.
  2. W drugim kwadracie obróć i ustaw larwy na ich lewej stronie i delikatnie dociśnij je do dna celulozy za pomocą końcówki do pipety do mikroładowarki przyciętej do 2 cm.
    UWAGA: Nie należy używać innych końcówek do pipet, ponieważ mogą one spowodować uszkodzenie larw.

3. Mikroskopia

UWAGA: Fotografia nie zabija zwierząt. Zwierzęta można obudzić, usuwając je z metylocelulozy i umieszczając w świeżej wodzie systemowej lub roztworze uzdatniającym, dzięki czemu ten sam osobnik może być badany kilka razy podczas zabiegu.

  1. Aby ocenić sygnał wyrażonego reportera, należy zobrazować zarodki w tym samym widoku i ustawieniach.
    UWAGA: Patrz krok 2.6, aby uzyskać informacje na temat optymalnego pozycjonowania zarodka. Zdjęcia w rękopisie zostały wykonane w opisanych warunkach. Jasne pole: 60-krotne powiększenie, ekspozycja 6 ms, przysłona 100%, wzmocnienie: 1,1, zdjęcia fluorescencyjne: powiększenie 60x, ekspozycja 300 ms, przysłona: 100%, wzmocnienie: 1, mFiltr wiśniowy, źródło światła fluorescencyjnego: żarówka metalohalogenkowa. Do wykonania zdjęć wykorzystano fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy, dedykowaną kamerę oraz oprogramowanie do mikroskopu.
  2. Umieść szalkę Petriego na stoliku mikroskopu.
  3. Skoncentruj się na wątrobie zarodka i uchwyć obraz jasnego pola za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  4. Przełącz mikroskop na filtr mCherry i wykonaj fluorescencyjny obraz wątroby w świetle fluorescencyjnym za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
    UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki fluorescencji w ciemności. Nie zmieniaj powiększenia, ostrości ani pozycji zarodka między przechwytywaniem jasnego pola a obrazami fluorescencyjnymi, ponieważ pomoże to w analizie obrazów.
  5. Powtarzać kroki 3.3 i 3.4 aż do zobrazowania wszystkich zarodków w doświadczeniu.

4. Wyznaczanie gęstości całkowanej

UWAGA: Jednym z najlepszych wskaźników do porównywania siły sygnału fluorescencyjnego jest wartość gęstości zintegrowanej (tj. iloczyn obszaru i średniej wartości szarości). Jednym z najprostszych sposobów wyznaczenia gęstości zintegrowanej jest użycie programu ImageJ27. Program jest dostępny w Internecie i można go zainstalować na komputerze.

  1. Otwórz ImageJ, a następnie prześlij obraz fluorescencyjny do analizy, przeciągając i upuszczając obraz lub klikając Plik|Otwarty.
  2. Kliknij na Obrazek|Kolor|Podziel kanały, aby podzielić obraz utworzony przez filtr fluorescencyjny zgodnie z kartą kolorów RGB.
  3. Pracuj z widmem obrazu kanału czerwonego, zamknij pozostałe kanały.
  4. Oznacz na obrazie eliptyczny obszar o podobnej wielkości, aby fałszywe sygnały nie zakłócały oceny. Korzystając z narzędzi Owalny, narysuj elipsę nad podświetlonym obszarem wątroby tak dokładnie, jak to możliwe.
  5. Jeśli sygnał jest słaby, użyj obrazów z mikroskopii świetlnej (tj. pary jasnych pól obrazu fluorescencyjnego), aby określić lokalizację wątroby.
  6. Kliknij Analizuj |Zmierz, aby określić siłę sygnału i rozmiar dotkniętego obszaru. Zintegrowana wartość gęstości jest automatycznie obliczana przez oprogramowanie (kolumna IntDen na wykresie).
  7. Kontynuować analizę, powtarzając kroki 4.1–4.6, aż do momentu przeanalizowania wszystkich obrazów fluorescencyjnych wszystkich zarodków w grupie poddanej badaniu.
  8. Zapisz dane, a następnie przeanalizuj zintegrowane wartości gęstości.
    UWAGA: Podczas analizy należy zawsze wybierać ten sam rozmiar obszaru na obrazach. Rozmiar analizowanego obszaru zależy od powiększenia, rozdzielczości obrazu, innych ustawień fotografowania itp. Analizę można przyspieszyć lub zwiększyć dokładność, używając do analizy makr osobistych. Na przykład makra mogą być używane do zapewnienia, że wybrany obszar jest zawsze taki sam na badanych obrazach. Szczegółowe opisy tworzenia makr, które pozwalają na najlepszą analizę obrazu zgodnie z poszczególnymi ustawieniami zdjęcia, znajdują się na stronie ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W eksperymencie przedstawionym w tym manuskrypcie, działanie dwóch substancji estrogenowych zostało przetestowane w pięciu stężeniach, począwszy od zapłodnienia przez 5 dni, na zarodkach danio pręgowanego Tg(vtg1:mCherry). Zbadaliśmy, czy sygnały fluorescencyjne pojawiły się w wątrobie ryb pod koniec czasu ekspozycji z powodu substancji i czy istnieją różnice w estrogenności tych dwóch substancji. Wyniki oceniono na podstawie obrazów fluorescencyjnych i zintegrowanych wartości gęstości. Ogólnie rzecz biorąc, obi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosowanie biomonitorów/bioindykatorów do działania estrogenowego rozprzestrzenia się w badaniach toksykologicznych. Modele in vivo odgrywają znakomitą rolę, ponieważ w przeciwieństwie do testów in vitro nie tylko dostarczają informacji o odpowiedzi komórki lub receptora, ale także pozwalają na badanie złożonych procesów zachodzących w organizmie. Z danio pręgowanego wyprodukowano kilka linii transgenicznych do badania efektów estrogenowych, z których jedna Tg(vtg1:mCherry) została wykorzystana w tych badaniach....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodowe Biuro Badań, Rozwoju i Innowacji (NKFIH) z Narodowego Funduszu Badań, Rozwoju i Innowacji (NKFIA); Umowa o dofinansowanie: NVKP_16-1-2016-0003, projekt EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 współfinansowany przez Unię Europejską oraz Program Doskonałości Tematycznej NKFIH-831-10/2019 Uniwersytetu Szent István, przyznany przez Ministerstwo Innowacji i Technologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowejJet BiofilTCP011024
Chlorek wapnia (CaCl2)Reanal Laborvegyszer Ltd.16383-0-27-39
Oprogramowanie GraphPad Prism 6.01GraphPad Software Inc.
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of Health, USAOprogramowanie do publicznego dostępu, do pobrania z: http://imagej.nih.gov/
Oprogramowanie kalibrowane w pakiecie Leica Application Suite XLeica Microsystems GmbH.Użyliśmy oprogramowania opisanego w eksperymentach, ale każde oprogramowanie fotograficzne jest zgodne z testami
mikroskopu stereoskopowego Leica M205 FA, aparatu Leica DFC 7000TLeica Microsystems GmbH.Użyliśmy sprzętu opisanego w doświadczeniach, ale każdy fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy nadaje się do badań
Siarczan magnezu (MgSO4)Reanal Laborvegyszer Ltd.20342-0-27-38
mFiltr wiśniowyLeica Microsystems GmbH.
MetylocelulozaSigma Aldrich Sp. z o.o.
Końcówka do pipet do mikroładowarekEppendorf GmbH.
Pipeta PasteuraVWR International LLC.612-1684
Szalka PetriegoJet BiofilTCD000060
Chlorek potasu (KCl)Reanal Laborvegyszer Ltd.18050-0-01-33
Chlorek sodu (NaCl)Reanal Laborvegyszer Ltd.24640-0-01-38
Trikanosulfonian (MS-222)Sigma Aldrich Ltd.E10521
2744295242956003 powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
  2. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
  3. Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
  4. Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
  5. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
  6. Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
  7. Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
  8. Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
  9. Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
  10. Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
  11. Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
  14. Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
  15. Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
  16. Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
  17. Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
  18. Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
  19. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  20. Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
  21. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
  22. Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
  23. Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
  24. Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
  25. Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
  26. Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
  29. Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
  30. Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
  31. Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425(2016).
  32. Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
  33. Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Detekcja sygna u fluorescencyjnegoobrazowanie fluorescencji mCherryreporter witellogeninytransgeniczna linia danio pr gowanegobadanie wra liwo ci na estrogenyalfa zearalenolbeta zearalenol

Powiązane artykuły