Rekapitulacja przejścia od ssania do odsadzenia in vitro przy użyciu organoidów jelitowych płodu

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak naśladować przejście od ssania do odsadzenia in vitro przy użyciu mysich organoidów jelitowych późnych płodów hodowanych przez 30 dni.

Streszczenie

Pod koniec okresu ssania, wiele gatunków ssaków przechodzi poważne zmiany w nabłonku jelitowym, które są związane ze zdolnością do trawienia stałego pokarmu. Proces ten nazywany jest przejściem od ssania do odsadzenia i powoduje zastąpienie nabłonka noworodka nabłonkiem dorosłego, co idzie w parze z dostosowaniami metabolicznymi i morfologicznymi. Te złożone zmiany rozwojowe są wynikiem programu genetycznego, który jest nieodłączny od komórek nabłonka jelitowego, ale może być do pewnego stopnia modulowany przez czynniki zewnętrzne. Przedłużona hodowla pierwotnych komórek nabłonka jelitowego myszy z późnego okresu płodowego podsumowuje przejście od ssania do odsadzania in vitro. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół hodowli organoidów jelitowych płodu myszy, który najlepiej nadaje się do modelowania tego procesu in vitro. Opisujemy kilka przydatnych testów zaprojektowanych do monitorowania zmian funkcji jelit związanych z przejściem od ssania do odsadzania w czasie. Dodatkowo podajemy przykład czynnika zewnętrznego, który jest w stanie wpływać na przejście od ssania do odsadzenia in vivo, jako reprezentację modulowania czasu przejścia od ssania do odsadzenia in vitro. To podejście in vitro może być wykorzystane do badania molekularnych mechanizmów przejścia od ssania do odsadzenia, a także modulatorów tego procesu. Co ważne, w odniesieniu do etyki zwierząt w badaniach, zastąpienie modeli invivo modelem in vitro przyczynia się do udoskonalenia doświadczeń na zwierzętach i być może do ograniczenia wykorzystywania zwierząt do badania procesów dojrzewania jelit.

Wprowadzenie

U wielu gatunków ssaków, w tym myszy i ludzi, jelito noworodka ma kilka cech, które różnią się od w pełni dojrzałego nabłonka jelitowego. Cechy te ułatwiają enterocytom noworodków trawienie i wchłanianie mleka, które zawiera dużo tłuszczu i niską zawartość węglowodanów, z laktozą jako głównym węglowodanem. Krawędź szczoteczki komórek nabłonka jelitowego noworodka wyraża hydrolazę dwucucharydazy laktazy-floryzyny (Lct)¹ w celu trawienia laktozy dwucucharydowej mleka. Po okresie ssania enterocyty przystosowują się do trawienia stałego pokarmu, który jest bogaty w węglowodany złożone i ubogi w tłuszcze. Objawia się to zmianą ekspresji disacharydazy na granicy szczotek z laktazy na sacharazę-izomaltazę (Sis) i trehalazę (Treh), które mogą trawić bardziej złożone węglowodany obecne w pokarmach stałych². Kolejny przełącznik metaboliczny jest związany z niskim stężeniem argininy w mleku. Aby zaspokoić zapotrzebowanie na argininę, enterocyty noworodków wyrażają enzym ograniczający szybkość w biosyntezie argininy, syntazę argininobursztynianu-1 (Ass1), w celu syntezy argininy³. Natomiast dorosłe enterocyty wyrażają arginazę 2 (Arg2), enzym zdolny do katabolizacji argininy, który jest obfity w pokarmach stałych. Ponadto nabłonek jelitowy noworodka wykazuje ekspresję noworodkowego receptora Fc dla immunoglobulin (FcRn), który pośredniczy w wchłanianiu matczynych IgG z mleka do krążenia/krwiobiegu⁴. Ekspresja FcRn znacznie spada podczas przejścia od ssania do odsadzenia⁵. U myszy dojrzewanie komórek Panetha następuje po urodzeniu, równolegle z tworzeniem i dojrzewaniem krypt i charakteryzuje się ekspresją peptydów przeciwdrobnoustrojowych lizosomu (Lyz) i defensyn⁶.

Wszystkie te zmiany są częścią przejścia od ssania do odsadzenia, procesu zachodzącego stopniowo po urodzeniu do pierwszego miesiąca życia u myszy, kiedy nabłonek jelitowy osiąga dojrzały stan. Przejście od ssania do odsadzenia jest wewnętrznie regulowane i rozwojowo osadzone w zgłębniku jelitowym. Białko dojrzewania indukowane limfocytami B-1 (Blimp-1) odgrywa kluczową rolę w tym wewnętrznym procesie dojrzewania⁷. Sterowiec-1 ulega silnej ekspresji w nabłonku noworodków, podczas gdy jego ekspresja zmniejsza się i jest tracona podczas przejścia od ssania do odsadzenia, dlatego może służyć jako wiarygodny marker nabłonka jelitowego noworodków. Pomimo tego, że jest to proces wewnętrzny, przejście od ssania do odsadzenia może być modulowane przez czynniki zewnętrzne. Na przykład syntetyczny analog kortyzolu, deksametazon, jest znany z tego, że przyspiesza dojrzewanie jelit in vivo^8,9.

Obecne modele in vitro używane do badania dojrzewania nabłonka jelitowego, w tym przejścia od ssania do odsadzenia, wykorzystują dorosłe linie komórek nabłonkowych i/lub dorosłe organoidy, które noszą cechy nabłonka jelitowego dorosłego. Niedawno wykazaliśmy, że pierwotne komórki nabłonka jelitowego wyizolowane z jelita późnego płodu dojrzewają i podsumowują przejście od ssania do odsadzania podczas wzrostu in vitro jako organoidy¹⁰. Wykazaliśmy ponadto, że ten proces dojrzewania jelit in vitro przebiega w tym samym tempie co in vivo. Na koniec zastosowaliśmy deksametazon w celu przyspieszenia procesu dojrzewania w taki sam sposób, jak opisano w badaniach in vivo.

Tutaj przedstawiamy dokładny protokół izolacji i hodowli organoidów jelitowych późnych płodów myszy. Opisujemy preferowany sposób pobierania próbek do przedłużonej hodowli organoidów oraz metody monitorowania przejścia od ssania do odsadzenia in vitro. Protokół ten może być stosowany do badań in vitro dojrzewania nabłonka jelitowego i modulatorów tego procesu, co skutkuje wyższą przepustowością, zwiększoną jakością i wartością translacyjną danych oraz zmniejszeniem wykorzystania przez zwierzęta.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, ustanowionymi przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Amsterdamie, w pełnej zgodności z krajowym ustawodawstwem dotyczącym badań na zwierzętach zgodnie z europejską dyrektywą 2010/63/UE dotyczącą wykorzystywania zwierząt do celów naukowych (ALC312).

1. Izolacja płodowych organoidów jelita cienkiego

1. Złóż w ofierze płód E18-E20 poprzez ścięcie nożyczek chirurgicznych, zgodnie z zatwierdzonymi przepisami etycznymi.
2. Natychmiast po eutanazji ostrożnie rozciąć dolną część brzucha płodu nożyczkami jelitowymi i usunąć całe jelito.
   UWAGA: Izolację należy przeprowadzić w jelitach między E18 a E20 ciąży w celu osiągnięcia prawidłowego przejścia od ssania do odsadzenia i dojrzewania in vitro.
3. Za pomocą dwóch małych kleszczy rozciągnij jelito. Używając żołądka i wyrostka robaczkowego jako prowadnic, rozetnij bliższą i dalszą część jelita cienkiego.
   UWAGA: Jeśli sekcja zostanie wykonana ostrożnie, możliwe jest również odizolowanie okrężnicy. Rozetnij go na części, używając dodatku jako przewodnika (Rysunek 1).
4. Spraw, aby jelito otworzyło się wzdłużnie: przymocuj jelito za pomocą żyletki umieszczonej wzdłuż i pociągnij jelito za pomocą przesuwanych kleszczy (jedno ramię kleszczyków po każdej stronie żyletki) wzdłuż żyletki. Następnie przeciąć otwarte jelito na 1 cm kawałki.
5. Przygotuj dwie probówki o pojemności 50 ml z 10 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przenieś bliższą i dalszą część jelita cienkiego (i okrężnicę, jeśli dotyczy) oddzielnie do rurek. Trzymaj probówki na lodzie podczas preparowania jelit dodatkowych myszy. Zebrać wszystkie części jelitowe jednego miotu razem w tej samej probówce.
   UWAGA: Jeden miot ma zwykle 6-10 płodów. Jelita wszystkich płodów muszą być połączone. Ilość ta powinna wystarczyć do uzyskania 4-8 dołków z organoidami, w 48-dołkowej płytce, na część jelita.
6. Kontynuuj izolację organoidów zgodnie z wcześniejszym opisem¹¹. Krótko mówiąc, umyć kawałki jelita lodowatym PBS, inkubować z 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 30 minut w temperaturze 4 °C, oddzielić krypty od tkanki poprzez ostre przemycie kawałków lodowatym PBS + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), przefiltrować za pomocą sitka komórkowego o wielkości 70 μm i odwirować w celu zebrania krypt w temperaturze 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. Płytka od 4 do 8 dołków z kryptami w żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej, w zależności od wielkości osadu, na ciepłej płytce 48-dołkowej. Użyj 20 μl krypt zawieszonych w żelu macierzy zewnątrzkomórkowej na dołek. Pozostawić żel do zestalenia się w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 10 min.
   UWAGA: Biorąc pod uwagę, że tylko 40% do 50% izolowanych krypt tworzy organoidy, należy dążyć do zagęszczenia od 250 do 300 organoidów na studzienkę. Najpierw dodaj mniej żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej niż to konieczne. Spójrz pod mikroskop po poszyciu pierwszej studzienki, aby przeanalizować, czy gęstość izolowanych krypt jest idealna. W razie potrzeby dodaj więcej żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej.
8. W międzyczasie przygotuj pożywkę ENR: 14 ml Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) 1:1 +++ (uzupełnione kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) 1x, L-glutaminą 0,01 M i 0,2U/ml penicyliny/Streptomycyny), 4 ml pożywki kondycjonowanej Noggin, 2 ml pożywki kondycjonowanej Rspondyną, 400 μL suplementu B27 1x, 200 μL suplementu N2 1x, 50 μL 1,25 mM n-acetylocysteiny, 20 μL 0,05 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
   UWAGA: Podczas hodowli organoidów okrężnicy należy uzupełnić 50% pożywką kondycjonowaną Wnt.
9. Dodać 250 μl pożywki ENR do dołka.

2. Hodowla organoidów płodowych

1. Zmieniaj podłoże kultur 3 razy w tygodniu. Dojrzewanie organoidów osiąga się po 1 miesiącu hodowli.
2. W 3 dniu po każdym pasażu policz liczbę sferoidów i organoidów za pomocą mikroskopu optycznego. Określ ilościowo co najmniej 3 studzienki na stan i wszystkie organoidy obecne w każdym studzience.
   UWAGA: Liczba sferoidów zmniejsza się z czasem, podczas gdy liczba organoidów wzrasta (Rysunek 2).
3. Organoidy należy przepuszczać raz w tygodniu przez mechaniczną dysocjację, jak opisano poniżej.
   1. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml lodowatego Advanced DMEM/F12 1:1 +++. Zbierz cały żel do macierzy zewnątrzkomórkowej z organoidami do probówki o pojemności 15 ml. Użyj końcówki o pojemności 200 μl na końcówce filtra o pojemności 1000 μl i pipetuj w górę i w dół 20 razy, aby rozbić organoidy.
   2. Wirować przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej na dołek. Zwykle organoidy płodowe mogą być rozszerzane w stosunku 1:2.
   3. Pozwól żelowi macierzy zewnątrzkomórkowej zestalać się przez 5-10 minut. Dodaj 250 μl pożywki ENR na dołek.

3. Analiza dojrzewania na poziomie RNA i białka

1. Analizuj kulturę co 3 dni po każdym pasażu, przez okres 1 miesiąca (tj. czas, w którym osiąga się pełną dojrzałość) (Rysunek 3).
   UWAGA: Hodowla organoidów płodowych jest dynamiczna (film 1) i aby uniknąć odchyleń od normalnej regeneracji organoidów po mechanicznym rozerwaniu, konieczne jest zawsze pobieranie próbek tego samego dnia po pasażowaniu.
2. Izolacja RNA
   1. Zbierz 3 dołki organoidów, używając 200 μl buforu do lizy RNA dla każdej studzienki uzupełnionej 2 μl β-merkaptoetanolu. Po dodaniu buforu do lizy RNA + β-merkaptoetanolu do studzienki, upewnij się, że cały żel macierzy zewnątrzkomórkowej z organoidami został przeniesiony do probówki 1,5 ml wolnej od RNaz.
   2. Energicznie wirować i utrzymywać w temperaturze -80 °C nie dłużej niż 1 miesiąc. Wyizoluj RNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów kolumn wirowych z krzemionki.
   3. Aby zwiększyć jakość RNA, po etapach płukania dodaj 500 μl 80% EtOH i delikatnie wymieszaj, odwracając kolumnę. Wirować przez 2 minuty przy 11 000 x g, aby całkowicie wysuszyć kolumnę.
      UWAGA: Upewnij się, że umyłeś wnętrze wieczka probówki 80% EtOH, przesuwając rurkę do góry nogami trzy do pięciu razy, aby pozbyć się wszelkich śladów tiocyjanianu guanidyny.
   4. Aby zwiększyć wydajność RNA, odczekaj 1-2 minuty po zastosowaniu wody wolnej od RNaz przed wirowaniem. Ponownie eluować RNA, nakładając pierwszy przepływowy eluat do kolumny po raz drugi.
      UWAGA: Jakość wyizolowanego RNA jest wystarczająca do zastosowania w analizie ekspresji całego genomu. Sprawdź, czy liczba integralności RNA jest wyższa niż 8.
3. Izolacja białek
   1. Zbierz 5 dołków organoidów za pomocą 250 μl lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek do jednej probówki o pojemności 15 ml. Inkubować przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby rozpuścić żel macierzy zewnątrzkomórkowej (zmniejszy to udział białka w żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej).
   2. Umyć lodowatym PBS. Dodać 250 μl buforu do lizy komórek i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Po sonikacji próbki mogą być używane do wykrywania aktywności enzymu lub do wykrywania Western Blots.
4. Barwienie immunologiczne
   1. Zbierz 2 dołki organoidów, używając 250 μl lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek do probówki o pojemności 15 ml. Inkubuj przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby rozpuścić żel macierzy zewnątrzkomórkowej (zmniejszy to plamienie tła). Umyć lodowatym PBS.
   2. Utrwalić organoidy za pomocą 500 μl 4% paraformaldegydu (PFA) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przemyć lodowatym PBS. Przejdź do immunofluorescencji całego organoidu lub do zatapiania parafiny, zgodnie z opublikowanymi protokołami¹².
      UWAGA: Do obsługi organoidów należy użyć plastikowej pipety Pasteura. Pozwoli to uniknąć zakłócenia jego struktury.

4. Wpływ czynnika zewnętrznego (deksametazon jako przykład) na proces dojrzewania organoidów

1. W pierwszym dniu hodowli dodać 0,01 M deksametazon do organoidów. Inkubować organoidy z deksametazonem przez cały miesiąc hodowli, dodając nowy deksametazon za każdym razem, gdy zmienia się pożywkę.
2. Analiza ekspresji genów
   1. Wyizoluj RNA zgodnie z powyższym opisem. W tym samym czasie zsyntetyzować cDNA wszystkich próbek, które mają być porównane (poddanych działaniu substancji i niepoddanych obróbce). Postępuj zgodnie z preferowaną metodą qRTPCR.
   2. Za pomocą GeNorm można zidentyfikować dwa najbardziej stabilne geny referencyjne za każdym razem, gdy nowa terapia jest stosowana na organoidach płodowych. Do obliczeń ekspresji względnej należy użyć średniej geometrycznej dwóch wybranych genów referencyjnych.
      UWAGA: Sugestie genów referencyjnych do badania organoidów płodowych myszy: Cyklofilina, Gapdh, βaktyna, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib i Tbp.
   3. Aby zbadać, w jaki sposób pewien czynnik zewnętrzny wpływa na dojrzewanie płodu myszy po urodzeniu, należy ocenić wszystkie poniższe geny.
      1. Sprawdź, czy markery płodowe laktaza (Lct), syntaza argininobursztynianu 1 (Ass1), białko dojrzewania indukowane limfocytami B 1 (Blimp-1) i receptor Fc noworodka (FcRn) zmniejszają ekspresję w ciągu pierwszych dwóch tygodni hodowli i są nieobecne przez pozostały czas hodowli (Figura 4C). Przeanalizuj, czy ten wzorzec został zmieniony.
      2. Sprawdź, czy dorosłe markery, sacharazy-izomaltaza (Sis), arginaza 2 (Arg2), trehalaza (Treh) i lizozym (Lyz) zwiększają ekspresję po dwóch tygodniach hodowli (Rysunek 4D). Przeanalizuj, czy ten wzorzec jest zmieniany przez czynnik zewnętrzny.
         UWAGA: Deksametazon jest czynnikiem zewnętrznym, który może przyspieszyć dojrzewanie organoidów płodowych i może być stosowany jako kontrola pozytywna we wszystkich eksperymentach mających na celu przetestowanie innych czynników zewnętrznych.
3. Analiza aktywności enzymów
   1. Wyizolować białko zgodnie z powyższym opisem. Wykrywanie aktywności disacharydaz jelitowych zgodnie z protokołami opublikowanymi przez Dahlqvist i Messer^13,14.
   2. Przygotować 0,625 M bufor maleinowy o pH 6,0 (przechowywać przez 3 miesiące w temperaturze 4 °C). Korzystając z tego buforu, przygotować 0,05 M laktozy (dodać sodowy p-hydroksymerkurybenzoesan jako stabilizator w celu zahamowania lizosomalnej aktywności p-galaktozydazy); 0,05 M maltoza; 0,05 M sacharozy i 0,05 M trehalozy.
      UWAGA: Wszystkie te roztwory można przechowywać przez 5 dni w temperaturze 4 °C. Podczas przygotowywania testu przechowywać na lodzie.
   3. Przygotować wzorce testowe, rozcieńczając 5,56 M roztwór glukozy ultraczystą wodą w celu otrzymania roztworów o następujących stężeniach: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 M i 0,025 M.
      UWAGA: roztwór stabilny przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze 4 °C.
   4. Inkubować na 96-dołkowej płytce przez 60 minut w temperaturze 37 °C:
      - 30 μl lizatu organoidowego z 30 μl laktozy
      - 30 μl lizatu organoidowego z 30 μl sacharozy
      - 30 μl dziesięciokrotnie rozcieńczonego lizatu organoidowego z 30 μl maltozy
      - 30 μl pięciokrotnie rozcieńczonego lizatu organoidowego z 30 μl trehalazy
      - 30 μl nierozcieńczonego lizatu organoidowego z 30 μl kwasu maleinowego, jako tło próbki
      - 30 μL każdego wzorca glukozy
      - 30 μl ultraczystej wody w postaci ślepej próby
      - 30 μl kontroli pozytywnej (optymalna rozcieńczenie; lizowana tkanka jelitowa płodu może być stosowana jako kontrola aktywności laktazy, podczas gdy lizowana tkanka jelitowa dorosłego może być stosowana jako kontrola sacharazy, maltazy i trehalazy)
      UWAGA: Rozcieńczenia próbek należy dokonać za pomocą buforu do lizy komórek. Przechowywać próbki i płytkę na lodzie podczas przygotowywania testu.
   5. W celu określenia ilości glukozy wytwarzanej przez enzymy obecne w lizacie organoidowym po inkubacji z odpowiednimi substratami, należy szybko dodać 200 μl roztworu barwnego PGO i mierzyć absorbancję przy 450 nm co 5 minut przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Spraw, aby roztwór PGO-color był świeży. Użyj 10 U/ml oksydazy glukozowej, 2 U/ml peroksydazy i 7,88 mmol/l o-dianizydyny w buforze Tris-HCl o 0,5 mol/l przy pH 7,0. Roztwór powinien mieć temperaturę pokojową po dodaniu do talerza.
   6. Obliczyć aktywność zgodnie ze wzorcem glukozy i skorygować całkowitą ilość białka (oznaczoną za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA)). Aktywność enzymu powinna być wyrażona jako μM glukozy/μg białka·^min-1 (Rysunek 5B).
      UWAGA: Zmierz aktywność arginazy za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oznaczania aktywności arginazy.

Wyniki

Przedłużona hodowla komórek nabłonka jelitowego płodu
Protokół naśladowania przejścia od ssania do odsadzania in vitro zależy od prawidłowego obchodzenia się z organoidami płodowymi podczas przedłużonej hodowli. Jelito proksymalne i dystalne izolowane od płodów myszy E18-E20 są oddzielone, jak pokazano na (Ryc. 1). Po izolacji komórki nabłonkowe są umieszczane w żelowych kopułach macierzy zewnątrzkomórkowej ( Rysunek 2). Zazwyczaj potrzeba czterech pasaży i około 28-30 dni hodowli, aby organoidy płodowe dojrzały do stanu dorosłego. W tym czasie można zebrać komórki na różnych etapach dojrzewania (Ryc. 3).

Reprezentatywna dalsza analiza przejścia od ssania do odsadzenia in vitro
Aby potwierdzić, że izolowane organoidy płodowe są wyraźnie proksymalne lub dystalne, porównaj poziom ekspresji proksymalnych markerów jednego członka rodziny domen cięcia 2 (Onecut2) i białka wiążącego GATA 4 (Gata4) oraz dystalnych markerów białka wiążącego kwasy tłuszczowe 6 (Fabp6) i aktywatora cyklazy guanylanowej 2A (Guca2a) między zarówno proksymalnymi, jak i dystalnymi kulturami organoidów (Rysunek 4A, Przejście od ssania do odsadzenia in vitro może być monitorowane przez dwa zestawy genów: markery płodowe (Figura 4C) i dorosłe (Figura 4D). Markery płodu powinny stopniowo zmniejszać się w trakcie hodowli, podczas gdy ekspresja markerów dorosłych powinna stopniowo wzrastać (Rysunek 4C,D).

Używanie czynnika zewnętrznego jako modyfikatora przejścia od ssania do odsadzania in vitro
W protokole tym deksametazon, syntetyczny glikokortykosteroid, został wykorzystany jako przykład czynnika zewnętrznego zdolnego do modyfikacji przejścia od ssania do odsadzania in vitro. Reprezentatywne dane w Rysunek 5 sugeruje, że wpływ czynników zewnętrznych najlepiej jest określić za pomocą wielu testów, ponieważ niekoniecznie muszą one być genomiczne. Na przykład w przypadku sacharazy-izomaltazy zarówno ekspresja RNA, jak i białka jest indukowana za pomocą deksametazonu (Rysunek 5A), podczas gdy ekspresja trehalazy jest zmieniana tylko na poziomie białka. (Rysunek 5B).

Rycina 1: Izolacja jelita cienkiego płodu myszy. (A) Fotografia wypreparowanego i rozciągniętego jelita płodu, w tym żołądka, bliższego i dalszego jelita cienkiego, wyrostka robaczkowego i okrężnicy. linia wskazuje, gdzie należy przeciąć jelito, aby podzielić proksymalne i dystalne jelito cienkie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne obrazy mikroskopowe proksymalnej i dystalnej hodowli organoidów płodu w 3., 17. i 28. dniu hodowli. Wszystkie obrazy zostały uzyskane w 3 dniu po przejściu i pokazują spadek liczby sferoid w miarę upływu czasu. Podziałka skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: Reprezentatywny film pokazujący dynamikę hodowli organoidów płodowych, od 4 do 6 dnia hodowli. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Rycina 3: Schematyczne przedstawienie zbioru organoidów do analizy dojrzewania jelit w czasie. Proksymalne i dystalne hodowle organoidów płodu powinny być hodowane przez jeden miesiąc i pasażowane co tydzień. Próbki do analizy dojrzewania powinny być pobierane 3 dni po izolacji i co 3 dni po każdym pasażu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Reprezentatywne qRTPCR markerów dojrzewania jelit w proksymalnych i dystalnych organoidach płodu. (A) Markery proksymalne Onecut2 i Gata4 ulegają ekspresji głównie w proksymalnej kulturze organoidów, podczas gdy (B) dystalne markery Fabp6 i Guca2a ulegają ekspresji głównie w dystalnej kulturze organoidowej. (C) markery płodowe Lct, Ass1, Blimp-1 i FcRn zmniejszają się, a (D) markery dorosłych Sis, Arg2, Treh i Lyz zwiększają się z czasem zarówno w proksymalnych, jak i dystalnych hodowlach organoidów. Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Czynnik zewnętrzny deksametazon może modulować dojrzewanie organoidów płodowych. (A) Ekspresja genu markera płodowego Blimp-1 jest zmniejszona w 12 dniu hodowli w organoidach traktowanych deksametazonem w porównaniu z organoidami kontrolnymi, podczas gdy zarówno ekspresja genów (B), jak i aktywność enzymatyczna (C) dorosłego markera sacharazy-izomaltazy (Sis) jest zwiększona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten opisuje hodowlę organoidów jelitowych późnego płodu przez dłuższy czas, aby naśladować przejście od ssania do odsadzenia in vitro. Proces dojrzewania jest równy tempu in vivo i kończy się po miesiącu w hodowli. Dalsza analiza tej kultury przy użyciu ilościowych technik RNA i białek jest szczegółowa.

W tym protokole wykorzystuje się pierwotne komórki jelitowe z zarodków myszy E18-E20. Szczególnie ważny jest etap rozwoju pierwotnych komórek myszy wykorzystywanych do generowania organoidów dla tego protokołu. Wykorzystanie wcześniejszego etapu rozwojowego spowoduje wytworzenie sferoid jelitowych, które utrzymują swoją specyficzną ekspresję genów płodowych przez dłuższy czas z ograniczonym przejściem do dorosłych organoidów^15,16. Tylko sferoidy w późnym stadium płodu są zdolne do przejścia do dorosłych organoidów in vitro¹⁰. Aby zmaksymalizować okno możliwości w odniesieniu do wpływu czynników zewnętrznych na dojrzewanie jelit, zaleca się jelita od późnego okresu płodowego, a nie jelita urodzonych szczeniąt, które były narażone na drobnoustroje i mleko matki. Doniesiono, że niektóre metabolity bakteryjne i składniki mleka mogą działać jako modyfikatory procesu dojrzewania¹⁷.

Aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do utrzymania hodowli przez jeden miesiąc, aby zbadać całe dojrzewanie od urodzenia do dorosłości, podczas pobierania próbek do dalszych analiz, jako materiał wyjściowy należy użyć jelit z 6-8 zarodków. Do wytworzenia kultury preferowane jest używanie zarodków z tego samego etapu rozwoju. Nie zalecamy łączenia różnych miotów, ponieważ niewielkie różnice w stadium rozwoju mogą wpływać na ekspresję genów dojrzewania.

Opisany tutaj protokół uwzględnia wytwarzanie organoidów z bliższego i dalszego jelita cienkiego w celu utrzymania cech rozwojowych różnych segmentów jelita. Alternatywnie, całe jelito może być wykorzystane do zbadania ogólnego dojrzewania w odniesieniu do zwiększenia/zmniejszenia ekspresji określonych markerów. W tym drugim przypadku mniejsza liczba zarodków może być wykorzystana do wyizolowania komórek jelitowych do początkowej hodowli.

Protokół ten został opracowany przy użyciu trójwymiarowych kultur organoidów. Ponieważ organoidy ulegają dynamicznemu wzrostowi w kulturze, ważne jest, aby pobierać próbki do dalszych analiz w tym samym momencie po pasażowaniu. W tym protokole wybraliśmy dzień 3 po pasażu, ponieważ reprezentuje on średni czas między dwoma podziałami, w których organoidy zawierają mocne pąki i niewielką lub żadną śmierć komórki. Można zastosować alternatywny punkt czasowy po pasażu, ale powinien on być spójny podczas całego eksperymentu. Nie zalecamy hodowli organoidów dłużej niż 7 dni po pasażu, ponieważ wzrost liczby komórek śmierci w świetle organoidu może wpłynąć na wyniki.

W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy deksametazon jako przykład czynnika zewnętrznego, który jest pokazany i najlepiej zbadany w literaturze w celu przyspieszenia dojrzewania jelit in vivo ^9,18. Deksametazon wywiera swoje działanie zarówno drogą genomową, jak i niegenomową. Na przykład na poziomie regulacji genomowej można zaobserwować przedwczesny wzrost poziomu mRNA Sis. Na poziomie niegenomowym obserwujemy zmiany w aktywności enzymów trawiennych, takich jak trehalaza. Oba są zgodne z opisanymi specyficznymi aspektami deksametazonu na aktywację genu sacharazy i niegenomowym wpływem aktywującym na enzymy brzegowe szczoteczki jelitowej obserwowane in vivo¹⁹. Fakt, że czynniki zewnętrzne, takie jak syntetyczne glikokortykosteroidy, mogą modulować pewne aspekty przejścia od ssania do odsadzania w kulturze organoidów, podobnie jak opisano in vivo, dodatkowo ustanawia organoidy jelitowe płodu myszy jako model do badania różnego rodzaju modulatorów dojrzewania jelit.

Mimo że dojrzewanie morfologiczne nabłonka jelitowego człowieka kończy się w okresie dojrzewania w okresie ciąży trwającym 22 tygodnie, funkcja bariery jelitowej dojrzewa do dzieciństwa w ścisłym związku z rodzajem żywienia, rozwojem mikrobioty i odpowiedzią immunologiczną. Ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich na tych etapach rozwoju, wartość translacyjna mysiego modelu in vitro polega na możliwości wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników zdolnych do modulowania dojrzewania jelit, procesu zachowanego wśród ssaków ssących.

Co ważne, w odniesieniu do etyki zwierząt w badaniach, model ten może przyczynić się do udoskonalenia doświadczeń na zwierzętach, ponieważ nie obejmuje interwencji przeprowadzanych na zwierzętach. Liczbę zwierząt można jeszcze bardziej zmniejszyć, przeprojektowując pytania badawcze na jeden lub dwa punkty czasowe hodowli, co pozwoli na testowanie wielu składników w ramach jednej hodowli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zaawansowany DMEM/F12 1:1	Invitrogen	12634-028
Zestaw do oznaczania aktywności arginazy	Sigma-Aldrich	MAK112-1KT
B27 suplement	Invitrogen	17504-044	100x
Test białka BCA Zestaw	Fisher	10741395
Bufor do lizy komórek	Technologia sygnalizacji komórkowej	Komórka 9803S
Rozwiązanie do odzyskiwania	Corning B.V.
Sitko komórkowe 70µ M	BD/VWR	734-0003
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902
EDTA	Merck	10,84,18,250	EDTA Titriplex III
EGF	Invitrogen	PMG8045
Etanol	Merck	1,00,98,31,000
Roztwór glukozy	Sigma-Aldrich	G6918
Glutamax	Invitrogen	35050-038	100x
Hepes	Invitrogen	15630-056	1M
Izolat II RNA Mini Kit	Bioline	BIO-52073
Laktoza	Sigma-Aldrich	L3625	a-Laktoza jednowodny
Bufor maleinowy	Sigma-Aldrich	M0375	Kwas maleinowy
Maltoza	Sigma-Aldrich	M5885	D-(+)-Maltoza monohydrat >99%
Matrigel	Corning B.V.	356231	Czynnik wzrostu Zmniejszona matryca błony podstawnej
Miliporowa woda	N.A.
Suplement N2	Invitrogen	17502-048	100x
n-Acetylcysteina	Sigma-Aldrich	A9165
Pożywka kondycjonowana Noggin	Domowa
o-dianizydyna	Sigma-Aldrich	191248
PBS	Domowa
penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140-122	0,2 U/ml
PGO-preparat enzymatyczny	Sigma-Aldrich	P-7119-10CAP	kapsułki z peroksydazą/oksydazą glukozową
p-hydroksymerkuriozanian sodu	Sigma-Aldrich	55540
Pożywka kondycjonowana rspondyną	Domowa
sacharoza	Sigma-Aldrich	84097
Trehaloza	Sigma-Aldrich	T5251	D-trehaloza dwuwodny
Bufor Tris-HCl	Domowej roboty
β-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148