Ten protokół opisuje, jak naśladować przejście od ssania do odsadzenia in vitro przy użyciu mysich organoidów jelitowych późnych płodów hodowanych przez 30 dni.
Artykuł metodologiczny
Rekapitulacja przejścia od ssania do odsadzenia in vitro przy użyciu organoidów jelitowych płodu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pod koniec okresu ssania, wiele gatunków ssaków przechodzi poważne zmiany w nabłonku jelitowym, które są związane ze zdolnością do trawienia stałego pokarmu. Proces ten nazywany jest przejściem od ssania do odsadzenia i powoduje zastąpienie nabłonka noworodka nabłonkiem dorosłego, co idzie w parze z dostosowaniami metabolicznymi i morfologicznymi. Te złożone zmiany rozwojowe są wynikiem programu genetycznego, który jest nieodłączny od komórek nabłonka jelitowego, ale może być do pewnego stopnia modulowany przez czynniki zewnętrzne. Przedłużona hodowla pierwotnych komórek nabłonka jelitowego myszy z późnego okresu płodowego podsumowuje przejście od ssania do odsadzania in vitro. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół hodowli organoidów jelitowych płodu myszy, który najlepiej nadaje się do modelowania tego procesu in vitro. Opisujemy kilka przydatnych testów zaprojektowanych do monitorowania zmian funkcji jelit związanych z przejściem od ssania do odsadzania w czasie. Dodatkowo podajemy przykład czynnika zewnętrznego, który jest w stanie wpływać na przejście od ssania do odsadzenia in vivo, jako reprezentację modulowania czasu przejścia od ssania do odsadzenia in vitro. To podejście in vitro może być wykorzystane do badania molekularnych mechanizmów przejścia od ssania do odsadzenia, a także modulatorów tego procesu. Co ważne, w odniesieniu do etyki zwierząt w badaniach, zastąpienie modeli invivo modelem in vitro przyczynia się do udoskonalenia doświadczeń na zwierzętach i być może do ograniczenia wykorzystywania zwierząt do badania procesów dojrzewania jelit.
Wprowadzenie
U wielu gatunków ssaków, w tym myszy i ludzi, jelito noworodka ma kilka cech, które różnią się od w pełni dojrzałego nabłonka jelitowego. Cechy te ułatwiają enterocytom noworodków trawienie i wchłanianie mleka, które zawiera dużo tłuszczu i niską zawartość węglowodanów, z laktozą jako głównym węglowodanem. Krawędź szczoteczki komórek nabłonka jelitowego noworodka wyraża hydrolazę dwucucharydazy laktazy-floryzyny (Lct)1 w celu trawienia laktozy dwucucharydowej mleka. Po okresie ssania enterocyty przystosowują się do trawienia stałego pokarmu, który jest bogaty w węglowodany złożone i ubogi w tłuszcze. Objawia się to zmianą ekspresji disacharydazy na granicy szczotek z laktazy na sacharazę-izomaltazę (Sis) i trehalazę (Treh), które mogą trawić bardziej złożone węglowodany obecne w pokarmach stałych2. Kolejny przełącznik metaboliczny jest związany z niskim stężeniem argininy w mleku. Aby zaspokoić zapotrzebowanie na argininę, enterocyty noworodków wyrażają enzym ograniczający szybkość w biosyntezie argininy, syntazę argininobursztynianu-1 (Ass1), w celu syntezy argininy3. Natomiast dorosłe enterocyty wyrażają arginazę 2 (Arg2), enzym zdolny do katabolizacji argininy, który jest obfity w pokarmach stałych. Ponadto nabłonek jelitowy noworodka wykazuje ekspresję noworodkowego receptora Fc dla immunoglobulin (FcRn), który pośredniczy w wchłanianiu matczynych IgG z mleka do krążenia/krwiobiegu4. Ekspresja FcRn znacznie spada podczas przejścia od ssania do odsadzenia5. U myszy dojrzewanie komórek Panetha następuje po urodzeniu, równolegle z tworzeniem i dojrzewaniem krypt i charakteryzuje się ekspresją peptydów przeciwdrobnoustrojowych lizosomu (Lyz) i defensyn6.
Wszystkie te zmiany są częścią przejścia od ssania do odsadzenia, procesu zachodzącego stopniowo po urodzeniu do pierwszego miesiąca życia u myszy, kiedy nabłonek jelitowy osiąga dojrzały stan. Przejście od ssania do odsadzenia jest wewnętrznie regulowane i rozwojowo osadzone w zgłębniku jelitowym. Białko dojrzewania indukowane limfocytami B-1 (Blimp-1) odgrywa kluczową rolę w tym wewnętrznym procesie dojrzewania7. Sterowiec-1 ulega silnej ekspresji w nabłonku noworodków, podczas gdy jego ekspresja zmniejsza się i jest tracona podczas przejścia od ssania do odsadzenia, dlatego może służyć jako wiarygodny marker nabłonka jelitowego noworodków. Pomimo tego, że jest to proces wewnętrzny, przejście od ssania do odsadzenia może być modulowane przez czynniki zewnętrzne. Na przykład syntetyczny analog kortyzolu, deksametazon, jest znany z tego, że przyspiesza dojrzewanie jelit in vivo8,9.
Obecne modele in vitro używane do badania dojrzewania nabłonka jelitowego, w tym przejścia od ssania do odsadzenia, wykorzystują dorosłe linie komórek nabłonkowych i/lub dorosłe organoidy, które noszą cechy nabłonka jelitowego dorosłego. Niedawno wykazaliśmy, że pierwotne komórki nabłonka jelitowego wyizolowane z jelita późnego płodu dojrzewają i podsumowują przejście od ssania do odsadzania podczas wzrostu in vitro jako organoidy10. Wykazaliśmy ponadto, że ten proces dojrzewania jelit in vitro przebiega w tym samym tempie co in vivo. Na koniec zastosowaliśmy deksametazon w celu przyspieszenia procesu dojrzewania w taki sam sposób, jak opisano w badaniach in vivo.
Tutaj przedstawiamy dokładny protokół izolacji i hodowli organoidów jelitowych późnych płodów myszy. Opisujemy preferowany sposób pobierania próbek do przedłużonej hodowli organoidów oraz metody monitorowania przejścia od ssania do odsadzenia in vitro. Protokół ten może być stosowany do badań in vitro dojrzewania nabłonka jelitowego i modulatorów tego procesu, co skutkuje wyższą przepustowością, zwiększoną jakością i wartością translacyjną danych oraz zmniejszeniem wykorzystania przez zwierzęta.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, ustanowionymi przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Amsterdamie, w pełnej zgodności z krajowym ustawodawstwem dotyczącym badań na zwierzętach zgodnie z europejską dyrektywą 2010/63/UE dotyczącą wykorzystywania zwierząt do celów naukowych (ALC312).
1. Izolacja płodowych organoidów jelita cienkiego
- Złóż w ofierze płód E18-E20 poprzez ścięcie nożyczek chirurgicznych, zgodnie z zatwierdzonymi przepisami etycznymi.
- Natychmiast po eutanazji ostrożnie rozciąć dolną część brzucha płodu nożyczkami jelitowymi i usunąć całe jelito.
UWAGA: Izolację należy przeprowadzić w jelitach między E18 a E20 ciąży w celu osiągnięcia prawidłowego przejścia od ssania do odsadzenia i dojrzewania in vitro. - Za pomocą dwóch małych kleszczy rozciągnij jelito. Używając żołądka i wyrostka robaczkowego jako prowadnic, rozetnij bliższą i dalszą część jelita cienkiego.
UWAGA: Jeśli sekcja zostanie wykonana ostrożnie, możliwe jest również odizolowanie okrężnicy. Rozetnij go na części, używając dodatku jako przewodnika (Rysunek 1). - Spraw, aby jelito otworzyło się wzdłużnie: przymocuj jelito za pomocą żyletki umieszczonej wzdłuż i pociągnij jelito za pomocą przesuwanych kleszczy (jedno ramię kleszczyków po każdej stronie żyletki) wzdłuż żyletki. Następnie przeciąć otwarte jelito na 1 cm kawałki.
- Przygotuj dwie probówki o pojemności 50 ml z 10 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przenieś bliższą i dalszą część jelita cienkiego (i okrężnicę, jeśli dotyczy) oddzielnie do rurek. Trzymaj probówki na lodzie podczas preparowania jelit dodatkowych myszy. Zebrać wszystkie części jelitowe jednego miotu razem w tej samej probówce.
UWAGA: Jeden miot ma zwykle 6-10 płodów. Jelita wszystkich płodów muszą być połączone. Ilość ta powinna wystarczyć do uzyskania 4-8 dołków z organoidami, w 48-dołkowej płytce, na część jelita. - Kontynuuj izolację organoidów zgodnie z wcześniejszym opisem11. Krótko mówiąc, umyć kawałki jelita lodowatym PBS, inkubować z 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 30 minut w temperaturze 4 °C, oddzielić krypty od tkanki poprzez ostre przemycie kawałków lodowatym PBS + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), przefiltrować za pomocą sitka komórkowego o wielkości 70 μm i odwirować w celu zebrania krypt w temperaturze 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Płytka od 4 do 8 dołków z kryptami w żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej, w zależności od wielkości osadu, na ciepłej płytce 48-dołkowej. Użyj 20 μl krypt zawieszonych w żelu macierzy zewnątrzkomórkowej na dołek. Pozostawić żel do zestalenia się w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 10 min.
UWAGA: Biorąc pod uwagę, że tylko 40% do 50% izolowanych krypt tworzy organoidy, należy dążyć do zagęszczenia od 250 do 300 organoidów na studzienkę. Najpierw dodaj mniej żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej niż to konieczne. Spójrz pod mikroskop po poszyciu pierwszej studzienki, aby przeanalizować, czy gęstość izolowanych krypt jest idealna. W razie potrzeby dodaj więcej żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej. - W międzyczasie przygotuj pożywkę ENR: 14 ml Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) 1:1 +++ (uzupełnione kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) 1x, L-glutaminą 0,01 M i 0,2U/ml penicyliny/Streptomycyny), 4 ml pożywki kondycjonowanej Noggin, 2 ml pożywki kondycjonowanej Rspondyną, 400 μL suplementu B27 1x, 200 μL suplementu N2 1x, 50 μL 1,25 mM n-acetylocysteiny, 20 μL 0,05 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
UWAGA: Podczas hodowli organoidów okrężnicy należy uzupełnić 50% pożywką kondycjonowaną Wnt. - Dodać 250 μl pożywki ENR do dołka.
2. Hodowla organoidów płodowych
- Zmieniaj podłoże kultur 3 razy w tygodniu. Dojrzewanie organoidów osiąga się po 1 miesiącu hodowli.
- W 3 dniu po każdym pasażu policz liczbę sferoidów i organoidów za pomocą mikroskopu optycznego. Określ ilościowo co najmniej 3 studzienki na stan i wszystkie organoidy obecne w każdym studzience.
UWAGA: Liczba sferoidów zmniejsza się z czasem, podczas gdy liczba organoidów wzrasta (Rysunek 2). - Organoidy należy przepuszczać raz w tygodniu przez mechaniczną dysocjację, jak opisano poniżej.
- Usuń pożywkę i dodaj 1 ml lodowatego Advanced DMEM/F12 1:1 +++. Zbierz cały żel do macierzy zewnątrzkomórkowej z organoidami do probówki o pojemności 15 ml. Użyj końcówki o pojemności 200 μl na końcówce filtra o pojemności 1000 μl i pipetuj w górę i w dół 20 razy, aby rozbić organoidy.
- Wirować przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej na dołek. Zwykle organoidy płodowe mogą być rozszerzane w stosunku 1:2.
- Pozwól żelowi macierzy zewnątrzkomórkowej zestalać się przez 5-10 minut. Dodaj 250 μl pożywki ENR na dołek.
3. Analiza dojrzewania na poziomie RNA i białka
- Analizuj kulturę co 3 dni po każdym pasażu, przez okres 1 miesiąca (tj. czas, w którym osiąga się pełną dojrzałość) (Rysunek 3).
UWAGA: Hodowla organoidów płodowych jest dynamiczna (film 1) i aby uniknąć odchyleń od normalnej regeneracji organoidów po mechanicznym rozerwaniu, konieczne jest zawsze pobieranie próbek tego samego dnia po pasażowaniu. - Izolacja RNA
- Zbierz 3 dołki organoidów, używając 200 μl buforu do lizy RNA dla każdej studzienki uzupełnionej 2 μl β-merkaptoetanolu. Po dodaniu buforu do lizy RNA + β-merkaptoetanolu do studzienki, upewnij się, że cały żel macierzy zewnątrzkomórkowej z organoidami został przeniesiony do probówki 1,5 ml wolnej od RNaz.
- Energicznie wirować i utrzymywać w temperaturze -80 °C nie dłużej niż 1 miesiąc. Wyizoluj RNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów kolumn wirowych z krzemionki.
- Aby zwiększyć jakość RNA, po etapach płukania dodaj 500 μl 80% EtOH i delikatnie wymieszaj, odwracając kolumnę. Wirować przez 2 minuty przy 11 000 x g, aby całkowicie wysuszyć kolumnę.
UWAGA: Upewnij się, że umyłeś wnętrze wieczka probówki 80% EtOH, przesuwając rurkę do góry nogami trzy do pięciu razy, aby pozbyć się wszelkich śladów tiocyjanianu guanidyny. - Aby zwiększyć wydajność RNA, odczekaj 1-2 minuty po zastosowaniu wody wolnej od RNaz przed wirowaniem. Ponownie eluować RNA, nakładając pierwszy przepływowy eluat do kolumny po raz drugi.
UWAGA: Jakość wyizolowanego RNA jest wystarczająca do zastosowania w analizie ekspresji całego genomu. Sprawdź, czy liczba integralności RNA jest wyższa niż 8.
- Izolacja białek
- Zbierz 5 dołków organoidów za pomocą 250 μl lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek do jednej probówki o pojemności 15 ml. Inkubować przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby rozpuścić żel macierzy zewnątrzkomórkowej (zmniejszy to udział białka w żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej).
- Umyć lodowatym PBS. Dodać 250 μl buforu do lizy komórek i przechowywać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Po sonikacji próbki mogą być używane do wykrywania aktywności enzymu lub do wykrywania Western Blots.
- Barwienie immunologiczne
- Zbierz 2 dołki organoidów, używając 250 μl lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek do probówki o pojemności 15 ml. Inkubuj przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby rozpuścić żel macierzy zewnątrzkomórkowej (zmniejszy to plamienie tła). Umyć lodowatym PBS.
- Utrwalić organoidy za pomocą 500 μl 4% paraformaldegydu (PFA) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przemyć lodowatym PBS. Przejdź do immunofluorescencji całego organoidu lub do zatapiania parafiny, zgodnie z opublikowanymi protokołami12.
UWAGA: Do obsługi organoidów należy użyć plastikowej pipety Pasteura. Pozwoli to uniknąć zakłócenia jego struktury.
4. Wpływ czynnika zewnętrznego (deksametazon jako przykład) na proces dojrzewania organoidów
- W pierwszym dniu hodowli dodać 0,01 M deksametazon do organoidów. Inkubować organoidy z deksametazonem przez cały miesiąc hodowli, dodając nowy deksametazon za każdym razem, gdy zmienia się pożywkę.
- Analiza ekspresji genów
- Wyizoluj RNA zgodnie z powyższym opisem. W tym samym czasie zsyntetyzować cDNA wszystkich próbek, które mają być porównane (poddanych działaniu substancji i niepoddanych obróbce). Postępuj zgodnie z preferowaną metodą qRTPCR.
- Za pomocą GeNorm można zidentyfikować dwa najbardziej stabilne geny referencyjne za każdym razem, gdy nowa terapia jest stosowana na organoidach płodowych. Do obliczeń ekspresji względnej należy użyć średniej geometrycznej dwóch wybranych genów referencyjnych.
UWAGA: Sugestie genów referencyjnych do badania organoidów płodowych myszy: Cyklofilina, Gapdh, βaktyna, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib i Tbp. - Aby zbadać, w jaki sposób pewien czynnik zewnętrzny wpływa na dojrzewanie płodu myszy po urodzeniu, należy ocenić wszystkie poniższe geny.
- Sprawdź, czy markery płodowe laktaza (Lct), syntaza argininobursztynianu 1 (Ass1), białko dojrzewania indukowane limfocytami B 1 (Blimp-1) i receptor Fc noworodka (FcRn) zmniejszają ekspresję w ciągu pierwszych dwóch tygodni hodowli i są nieobecne przez pozostały czas hodowli (Figura 4C). Przeanalizuj, czy ten wzorzec został zmieniony.
- Sprawdź, czy dorosłe markery, sacharazy-izomaltaza (Sis), arginaza 2 (Arg2), trehalaza (Treh) i lizozym (Lyz) zwiększają ekspresję po dwóch tygodniach hodowli (Rysunek 4D). Przeanalizuj, czy ten wzorzec jest zmieniany przez czynnik zewnętrzny.
UWAGA: Deksametazon jest czynnikiem zewnętrznym, który może przyspieszyć dojrzewanie organoidów płodowych i może być stosowany jako kontrola pozytywna we wszystkich eksperymentach mających na celu przetestowanie innych czynników zewnętrznych.
- Analiza aktywności enzymów
- Wyizolować białko zgodnie z powyższym opisem. Wykrywanie aktywności disacharydaz jelitowych zgodnie z protokołami opublikowanymi przez Dahlqvist i Messer13,14.
- Przygotować 0,625 M bufor maleinowy o pH 6,0 (przechowywać przez 3 miesiące w temperaturze 4 °C). Korzystając z tego buforu, przygotować 0,05 M laktozy (dodać sodowy p-hydroksymerkurybenzoesan jako stabilizator w celu zahamowania lizosomalnej aktywności p-galaktozydazy); 0,05 M maltoza; 0,05 M sacharozy i 0,05 M trehalozy.
UWAGA: Wszystkie te roztwory można przechowywać przez 5 dni w temperaturze 4 °C. Podczas przygotowywania testu przechowywać na lodzie. - Przygotować wzorce testowe, rozcieńczając 5,56 M roztwór glukozy ultraczystą wodą w celu otrzymania roztworów o następujących stężeniach: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 M i 0,025 M.
UWAGA: roztwór stabilny przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze 4 °C. - Inkubować na 96-dołkowej płytce przez 60 minut w temperaturze 37 °C:
- 30 μl lizatu organoidowego z 30 μl laktozy
- 30 μl lizatu organoidowego z 30 μl sacharozy
- 30 μl dziesięciokrotnie rozcieńczonego lizatu organoidowego z 30 μl maltozy
- 30 μl pięciokrotnie rozcieńczonego lizatu organoidowego z 30 μl trehalazy
- 30 μl nierozcieńczonego lizatu organoidowego z 30 μl kwasu maleinowego, jako tło próbki
- 30 μL każdego wzorca glukozy
- 30 μl ultraczystej wody w postaci ślepej próby
- 30 μl kontroli pozytywnej (optymalna rozcieńczenie; lizowana tkanka jelitowa płodu może być stosowana jako kontrola aktywności laktazy, podczas gdy lizowana tkanka jelitowa dorosłego może być stosowana jako kontrola sacharazy, maltazy i trehalazy)
UWAGA: Rozcieńczenia próbek należy dokonać za pomocą buforu do lizy komórek. Przechowywać próbki i płytkę na lodzie podczas przygotowywania testu. - W celu określenia ilości glukozy wytwarzanej przez enzymy obecne w lizacie organoidowym po inkubacji z odpowiednimi substratami, należy szybko dodać 200 μl roztworu barwnego PGO i mierzyć absorbancję przy 450 nm co 5 minut przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Spraw, aby roztwór PGO-color był świeży. Użyj 10 U/ml oksydazy glukozowej, 2 U/ml peroksydazy i 7,88 mmol/l o-dianizydyny w buforze Tris-HCl o 0,5 mol/l przy pH 7,0. Roztwór powinien mieć temperaturę pokojową po dodaniu do talerza. - Obliczyć aktywność zgodnie ze wzorcem glukozy i skorygować całkowitą ilość białka (oznaczoną za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA)). Aktywność enzymu powinna być wyrażona jako μM glukozy/μg białka·min-1 (Rysunek 5B).
UWAGA: Zmierz aktywność arginazy za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oznaczania aktywności arginazy.
Wyniki
Przedłużona hodowla płodowych komórek nabłonkowych jelita
Protokół naśladujący przejście z okresu ssania do odsadzenia in vitro zależy od prawidłowego obchodzenia się z płodowymi organoidami podczas przedłużonej hodowli. Odizolowane z płodów myszy w dniach E18-E20 odcinki proksymalne i dystalne jelita są rozdzielane, jak przedstawiono na (Rysunku 1). Po izolacji komórki nabłonkowe są wysiewane w kopułkach z żelu macierzy zewnątrzkomórkowej (Rysunek 2). Dojrzenie płodowych organoidów do stanu dorosłego zajmuje zazwyczaj cztery pasaże i około 28-30 dni hodowli. W tym czasie można zbierać komórki na różnych etapach dojrzewania (Rysunek 3).
Reprezentatywna analiza końcowa przejścia z okresu ssania do odsadzenia in vitro
Aby potwierdzić, że wyizolowane organoidy płodowe są wyraźnie proksymalne lub dystalne, należy porównać poziom ekspresji markerów proksymalnych: One cut domain family member 2 (Onecut2) oraz GATA binding protein 4 (Gata4) i markerów dystalnych: Fatty acid binding protein 6 (Fabp6) oraz Guanylate Cyclase Activator 2A (Guca2a) pomiędzy kulturami organoidów proksymalnych i dystalnych (Rysunek 4A,B). Przejście z okresu ssania do odsadzenia in vitro można monitorować za pomocą dwóch zestawów genów: markerów płodowych (Rysunek 4C) oraz markerów dorosłych (Rysunek 4D). Ekspresja markerów płodowych powinna stopniowo spadać w trakcie trwania hodowli, natomiast ekspresja markerów dorosłych powinna stopniowo wzrastać (Rysunek 4C,D).
Wykorzystanie czynnika zewnętrznego jako modyfikatora przejścia z ssania na odsadzanie in vitro
W niniejszym protokole deksametazon, syntetyczny glikokortykosteroid, został użyty jako przykład czynnika zewnętrznego zdolnego do modyfikowania przejścia z ssania na odsadzanie in vitro. Reprezentatywne dane na Ryc. 5 sugerują, że wpływ czynników zewnętrznych najlepiej określać za pomocą wielu testów, ponieważ nie muszą one mieć charakteru genomicznego. Na przykład, w przypadku sacharozy-izomaltazy indukowana deksametazonem jest ekspresja zarówno RNA, jak i białka (Ryc. 5A), podczas gdy ekspresja trehalazy zmienia się wyłącznie na poziomie białka (Ryc. 5B).
Rysunek 1: Izolacja jelita cienkiego płodu myszy. (A) Fotografia wypreparowanego i rozciągniętego jelita płodowego, obejmująca żołądek, proksymalną i dystalną część jelita cienkiego, wyrostek robaczkowy oraz jelito grube. Czarna linia wskazuje miejsce, w którym należy przeciąć jelito, aby oddzielić proksymalną od dystalnej części jelita cienkiego. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy mikroskopowe proksymalnych i dystalnych kultur organoidów płodowych w 3., 17. i 28. dniu hodowli. Wszystkie obrazy uzyskano w 3. dniu po pasażowaniu; przedstawiają one spadek liczby sferoidów w czasie. Pasek skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Film 1: Reprezentacyjne wideo obrazujące dynamikę hodowli organoidów płodowych od 4. do 6. dnia hodowli. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie pobierania organoidów do analizy dojrzewania jelita w czasie. Kultury proksymalnych i dystalnych organoidów płodowych należy hodować przez miesiąc, przeprowadzając pasażowanie raz w tygodniu. Próbki do analizy dojrzewania należy pobierać 3 dni po izolacji oraz co 3 dni po każdym pasażowaniu.. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki qRTPCR dla markerów dojrzewania jelita w proksymalnych i dystalnych organoidach płodowych. (A) Markery proksymalne Onecut2 i Gata4 wykazują głównie ekspresję w proksymalnej kulturze organoidów, podczas gdy (B) markery dystalne Fabp6 i Guca2a wykazują największą ekspresję w dystalnej kulturze organoidów. (C) Markery płodowe Lct, Zadanie 1, Blimp-1 i FcRn zmniejszenie i (D) markery dorosłych Sis, Arg2, Treh i Lyz wzrost w czasie zarówno w kulturach organoidów proksymalnych, jak i dystalnych. Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 5: Zewnętrzny czynnik, deksametazon, może modulować dojrzewanie organoidów płodowych. (A) Ekspresja genu markeru płodowego Blimp-1 jest obniżona w 12. dniu hodowli w organoidach traktowanych deksametazonem w porównaniu z organoidami kontrolnymi, podczas gdy zarówno ekspresja genu (B) oraz aktywność enzymatyczna (C) dojrzałej sacharozy-izomaltazy (Sis) ulega zwiększeniu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Protokół ten opisuje hodowlę organoidów jelitowych późnego płodu przez dłuższy czas, aby naśladować przejście od ssania do odsadzenia in vitro. Proces dojrzewania jest równy tempu in vivo i kończy się po miesiącu w hodowli. Dalsza analiza tej kultury przy użyciu ilościowych technik RNA i białek jest szczegółowa.
W tym protokole wykorzystuje się pierwotne komórki jelitowe z zarodków myszy E18-E20. Szczególnie ważny jest etap rozwoju pierwotnych komórek myszy wykorzystywanych do generowania organoidów dla tego protokołu. Wykorzystanie wcześniejszego etapu rozwojowego spowoduje wytworzenie sferoid jelitowych, które utrzymują swoją specyficzną ekspresję genów płodowych przez dłuższy czas z ograniczonym przejściem do dorosłych organoidów15,16. Tylko sferoidy w późnym stadium płodu są zdolne do przejścia do dorosłych organoidów in vitro10. Aby zmaksymalizować okno możliwości w odniesieniu do wpływu czynników zewnętrznych na dojrzewanie jelit, zaleca się jelita od późnego okresu płodowego, a nie jelita urodzonych szczeniąt, które były narażone na drobnoustroje i mleko matki. Doniesiono, że niektóre metabolity bakteryjne i składniki mleka mogą działać jako modyfikatory procesu dojrzewania17.
Aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do utrzymania hodowli przez jeden miesiąc, aby zbadać całe dojrzewanie od urodzenia do dorosłości, podczas pobierania próbek do dalszych analiz, jako materiał wyjściowy należy użyć jelit z 6-8 zarodków. Do wytworzenia kultury preferowane jest używanie zarodków z tego samego etapu rozwoju. Nie zalecamy łączenia różnych miotów, ponieważ niewielkie różnice w stadium rozwoju mogą wpływać na ekspresję genów dojrzewania.
Opisany tutaj protokół uwzględnia wytwarzanie organoidów z bliższego i dalszego jelita cienkiego w celu utrzymania cech rozwojowych różnych segmentów jelita. Alternatywnie, całe jelito może być wykorzystane do zbadania ogólnego dojrzewania w odniesieniu do zwiększenia/zmniejszenia ekspresji określonych markerów. W tym drugim przypadku mniejsza liczba zarodków może być wykorzystana do wyizolowania komórek jelitowych do początkowej hodowli.
Protokół ten został opracowany przy użyciu trójwymiarowych kultur organoidów. Ponieważ organoidy ulegają dynamicznemu wzrostowi w kulturze, ważne jest, aby pobierać próbki do dalszych analiz w tym samym momencie po pasażowaniu. W tym protokole wybraliśmy dzień 3 po pasażu, ponieważ reprezentuje on średni czas między dwoma podziałami, w których organoidy zawierają mocne pąki i niewielką lub żadną śmierć komórki. Można zastosować alternatywny punkt czasowy po pasażu, ale powinien on być spójny podczas całego eksperymentu. Nie zalecamy hodowli organoidów dłużej niż 7 dni po pasażu, ponieważ wzrost liczby komórek śmierci w świetle organoidu może wpłynąć na wyniki.
W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy deksametazon jako przykład czynnika zewnętrznego, który jest pokazany i najlepiej zbadany w literaturze w celu przyspieszenia dojrzewania jelit in vivo 9,18. Deksametazon wywiera swoje działanie zarówno drogą genomową, jak i niegenomową. Na przykład na poziomie regulacji genomowej można zaobserwować przedwczesny wzrost poziomu mRNA Sis. Na poziomie niegenomowym obserwujemy zmiany w aktywności enzymów trawiennych, takich jak trehalaza. Oba są zgodne z opisanymi specyficznymi aspektami deksametazonu na aktywację genu sacharazy i niegenomowym wpływem aktywującym na enzymy brzegowe szczoteczki jelitowej obserwowane in vivo19. Fakt, że czynniki zewnętrzne, takie jak syntetyczne glikokortykosteroidy, mogą modulować pewne aspekty przejścia od ssania do odsadzania w kulturze organoidów, podobnie jak opisano in vivo, dodatkowo ustanawia organoidy jelitowe płodu myszy jako model do badania różnego rodzaju modulatorów dojrzewania jelit.
Mimo że dojrzewanie morfologiczne nabłonka jelitowego człowieka kończy się w okresie dojrzewania w okresie ciąży trwającym 22 tygodnie, funkcja bariery jelitowej dojrzewa do dzieciństwa w ścisłym związku z rodzajem żywienia, rozwojem mikrobioty i odpowiedzią immunologiczną. Ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich na tych etapach rozwoju, wartość translacyjna mysiego modelu in vitro polega na możliwości wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników zdolnych do modulowania dojrzewania jelit, procesu zachowanego wśród ssaków ssących.
Co ważne, w odniesieniu do etyki zwierząt w badaniach, model ten może przyczynić się do udoskonalenia doświadczeń na zwierzętach, ponieważ nie obejmuje interwencji przeprowadzanych na zwierzętach. Liczbę zwierząt można jeszcze bardziej zmniejszyć, przeprojektowując pytania badawcze na jeden lub dwa punkty czasowe hodowli, co pozwoli na testowanie wielu składników w ramach jednej hodowli.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują niczego do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zaawansowany DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Zestaw do oznaczania aktywności arginazy | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
| B27 suplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
| Test białka BCA Zestaw | Fisher | 10741395 | |
| Bufor do lizy komórek | Technologia sygnalizacji komórkowej | Komórka 9803S | |
| Rozwiązanie do odzyskiwania | Corning B.V. | ||
| Sitko komórkowe 70µ M | BD/VWR | 734-0003 | |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
| EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
| Etanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Roztwór glukozy | Sigma-Aldrich | G6918 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
| Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
| Izolat II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
| Laktoza | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Laktoza jednowodny |
| Bufor maleinowy | Sigma-Aldrich | M0375 | Kwas maleinowy |
| Maltoza | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltoza monohydrat >99% |
| Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Czynnik wzrostu Zmniejszona matryca błony podstawnej |
| Miliporowa woda | N.A. | ||
| Suplement N2 | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
| n-Acetylcysteina | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Pożywka kondycjonowana Noggin | Domowa | ||
| o-dianizydyna | Sigma-Aldrich | 191248 | |
| PBS | Domowa | ||
| penicylina/Streptomycyna | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/ml |
| PGO-preparat enzymatyczny | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | kapsułki z peroksydazą/oksydazą glukozową |
| p-hydroksymerkuriozanian sodu | Sigma-Aldrich | 55540 | |
| Pożywka kondycjonowana rspondyną | Domowa | ||
| sacharoza | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Trehaloza | Sigma-Aldrich | T5251 | D-trehaloza dwuwodny |
| Bufor Tris-HCl | Domowej roboty | ||
| β-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
Bibliografia
- Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).
- Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).
- Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).
- Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
- Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).
- Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10335-10339 (1994).
- Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452(2011).
- Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82 (1), 91-95 (1985).
- Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264 (2), 306-311 (1993).
- Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20 (2), (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531(2015).
- Dahlqvist, A. Assay of intestinal disaccharidases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44 (2), 169-172 (1984).
- Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14 (3), 376-392 (1966).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).
- Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).
- Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine. Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).
- Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).
Przedruki i uprawnienia
