Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Segmentowe uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej szczura z kontrolowanym ciśnieniem z okołoprzybytkowym zastosowaniem terapeutycznym

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60473

⸱

9 lipca 2020

 , 
1Department of Surgery, Division of Vascular Surgery, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Center for Nanotechnology in Drug Delivery, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Curriculum in Toxicology & Environmental Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Cell Biology & Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 5McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej szczura naśladuje zabieg angioplastyki klinicznej wykonywany w celu przywrócenia przepływu krwi w naczyniach miażdżycowych. Model ten indukuje reakcję na uszkodzenie tętnicy poprzez rozdęcie ściany tętnicy i obnażenie warstwy wewnętrznej komórek śródbłonka, ostatecznie powodując przebudowę i reakcję hiperplastyczną błony wewnętrznej.

Streszczenie

Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie, częściowo z powodu miażdżycy. Blaszka miażdżycowa zwęża powierzchnię światła w tętnicach, zmniejszając w ten sposób odpowiedni przepływ krwi do narządów i tkanek dystalnych. Klinicznie zabiegi rewaskularyzacyjne, takie jak angioplastyka balonowa z umieszczeniem stentu lub bez, mają na celu przywrócenie przepływu krwi. Chociaż zabiegi te przywracają przepływ krwi poprzez zmniejszenie obciążenia blaszką miażdżycową, uszkadzają ścianę naczynia, co inicjuje reakcję gojenia tętnic. Przedłużona reakcja gojenia powoduje restenozę tętnic lub ponowne zwężenie, ostatecznie ograniczając długoterminowy sukces tych zabiegów rewaskularyzacji. W związku z tym przedkliniczne modele zwierzęce są integralną częścią analizy patofizjologicznych mechanizmów napędzających restenozę i dają możliwość testowania nowych strategii terapeutycznych. Modele mysie są tańsze i łatwiejsze w obsłudze niż duże modele zwierzęce. Uraz balonowy lub druciany to dwie powszechnie akceptowane metody urazów stosowane w modelach mysich. W szczególności modele uszkodzeń balonów naśladują procedurę angioplastyki klinicznej i powodują odpowiednie uszkodzenie tętnicy do rozwoju restenozy. W niniejszym artykule opisano szczegóły chirurgiczne dotyczące wykonywania i analizy histologicznej zmodyfikowanego, kontrolowanego ciśnieniem modelu uszkodzenia balonu tętnicy szyjnej szczura. Ponadto protokół ten podkreśla, w jaki sposób miejscowe okołoprzybytkowe zastosowanie środków terapeutycznych może być wykorzystane do zahamowania przerostu neointhems. Na koniec przedstawiamy mikroskopię fluorescencyjną arkuszy świetlnych jako nowatorskie podejście do obrazowania i wizualizacji uszkodzenia tętnicy w trzech wymiarach.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia (CVD) pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie1. Miażdżyca jest podstawową przyczyną większości zachorowalności i śmiertelności związanej z chorobami układu krążenia. Miażdżyca to nagromadzenie blaszki miażdżycowej wewnątrz tętnic, które powoduje zwężenie światła, utrudniając prawidłową perfuzję krwi do narządów i tkanek dystalnych2. Interwencje kliniczne w leczeniu ciężkiej miażdżycy obejmują angioplastykę balonową z umieszczeniem stentu lub bez. Interwencja ta polega na przesunięciu cewnika balonowego do miejsca blaszki miażdżycowej i napompowaniu balonu w celu ściśnięcia płytki nazębnej do ściany tętnicy, poszerzając obszar światła. Ta procedura uszkadza jednak tętnicę, inicjując reakcję na uszkodzenie tętnicy3. Przedłużona aktywacja tej reakcji na uraz prowadzi do restenozy tętniczej lub ponownego zwężenia, wtórnego do przerostu neointimy i przebudowy naczyń. Podczas angioplastyki dochodzi do obnażenia błony wewnętrznej z komórek śródbłonka, co prowadzi do natychmiastowej rekrutacji płytek krwi i miejscowego stanu zapalnego. Sygnalizacja lokalna indukuje zmiany fenotypowe w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) i fibroblastach przybyszowych. Prowadzi to do migracji i proliferacji VSMC i fibroblastów do wewnątrz do światła, co prowadzi do przerostu neointimy 4,5. Krążące komórki progenitorowe i komórki odpornościowe również przyczyniają się do ogólnej objętości restenozy6. Tam, gdzie ma to zastosowanie, stenty uwalniające leki (DES) są aktualnym standardem hamowania restenozy7. DES hamuje jednak reendotelializację tętnic, tworząc w ten sposób środowisko prozakrzepowe, które może skutkować późną zakrzepicą w stencie8. Dlatego modele zwierzęce są niezbędne zarówno do zrozumienia patofizjologii restenozy, jak i do opracowania lepszych strategii terapeutycznych w celu przedłużenia skuteczności procedur rewaskularyzacji.

Kilka dużych i małych modeli zwierzęcych9 są wykorzystywane do badania tej patologii. Należą do nich balloon-injury3,10 lub wire-injury11 po stronie światła tętnicy, a także częściowe podwiązanie12 lub umieszczenie mankietu13 wokół tętnicy. Uraz balonu i drutu obnaża warstwę śródbłonka tętnicy, naśladując to, co dzieje się klinicznie po angioplastyce. W szczególności modele uszkodzeń balonowych wykorzystują podobne narzędzia, jak w warunkach klinicznych (tj. cewnik balonowy). Uszkodzenie balonu najlepiej wykonać w modelach szczurzych, ponieważ tętnice szczurów mają odpowiedni rozmiar dla dostępnych na rynku cewników balonowych. W tym miejscu opisujemy segmentowe uszkodzenie tętnicy kontrolowane ciśnieniem, dobrze ugruntowaną, zmodyfikowaną wersję uszkodzenia balonika tętnicy szyjnej szczura. To kontrolowane ciśnienie podejście ściśle naśladuje procedurę klinicznej angioplastyki i pozwala na powtarzalne tworzenie się przerostu neointimy dwa tygodnie po urazie14,15. Dodatkowo, to kontrolowane ciśnieniem uszkodzenie tętnicy powoduje całkowite odtworzenie warstwy śródbłonka w ciągu 2 tygodni po operacji16. To bezpośrednio kontrastuje z oryginalnym modelem uszkodzenia balonu, opisanym przez Clowesa, w którym warstwa śródbłonka nigdy nie wraca do pełnego pokrycia3.

Po operacji, terapia może być stosowana lub kierowana na uszkodzoną tętnicę poprzez kilka podejść. Opisana tu metoda polega na okołoprzybytkowym zastosowaniu małej cząsteczki osadzonej w roztworze żelu Pluronic. W szczególności nakładamy roztwór 100 μM aldehydu cynamonowego w 25% żelu Pluronic-F127 na tętnicę natychmiast po urazie, aby zahamować powstawanie przerostu neointimalnego15. Pluronic-F127 to nietoksyczny, termoodwracalny żel zdolny do lokalnego dostarczania leków w kontrolowany sposób17. Tymczasem uszkodzenie tętnic ma charakter miejscowy, stąd miejscowe podawanie pozwala na testowanie substancji czynnej przy jednoczesnej minimalizacji skutków niezamierzonych. Niemniej jednak skuteczne dostarczenie leku przy użyciu tej metody będzie zależało od składu chemicznego zastosowanej małej cząsteczki lub leku biologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill.

1. Procedury przedoperacyjne

  1. Sterylizacja instrumentów chirurgicznych. Wszystkie instrumenty chirurgiczne należy poddać autoklawowaniu przed operacją. W przypadku wykonywania wielu zabiegów tego samego dnia należy sterylizować instrumenty pomiędzy operacjami, używając suchego sterylizatora kuleczkowego.
  2. Przygotowanie preparatu terapeutycznego w 25% żelu Pluronic-127 (rozcieńczonym w sterylnej wodzie destylowanej).
  3. Podłączenie cewnika z balonikiem Fogarty 2F do insuflatora i umieszczenie końcówki cewnika z balonikiem w strzykawce 1 mL wypełnionej roztworem soli fizjologicznej.
  4. Indukcja znieczulenia poprzez umieszczenie szczura w komorze z 5% izofluranem.
    1. Wyjęcie szczura z komory i zapisanie jego masy ciała. Użycie trymera do ogolenia futra w brzusznej części szyi.
    2. Umieszczenie szczura ponownie w komorze z 5% izofluranem w celu zapewnienia indukcji znieczulenia.
  5. Umieszczenie szczura w pozycji na plecach na platformie chirurgicznej, z nosem w stożku do narkozy, tak aby pyszczek zwierzęcia był skierowany w stronę chirurga.
    1. Zmniejszenie stężenia znieczulenia wziewnego do 1,5% izofluranu. Weryfikacja głębokości znieczulenia poprzez odruch zaciśnięcia palców u wszystkich czterech łap.
    2. Przymocowanie wszystkich czterech kończyn do platformy chirurgicznej za pomocą taśmy.
  6. Włączenie lampy grzewczej.
  7. Podskórne wstrzyknięcie atropiny (0,01 mg/kg) w celu zmniejszenia wydzieliny z dróg oddechowych.
  8. Podskórne wstrzyknięcie karprofenu (5 mg/kg) w ramach profilaktycznego leczenia przeciwbólowego. Jeśli leki przeciwzapalne nie są dopuszczalne w danym eksperymencie, należy odnieść się do kroków 3.2.2 i 3.2.3.
  9. Nałożenie smarującej maści do oczu na oba oczy za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego, aby zapobiec wysychaniu rogówek podczas operacji.
  10. Trzykrotne przemycie szyi okrężnymi ruchami, naprzemiennie 70% alkoholem etylowym oraz Betadyną, od środka ogolonego obszaru na zewnątrz, w celu sterylizacji miejsca ncięcia.
  11. Infiltracja linii cięcia s.c. 0,25% bupiwakainą.
  12. Założenie sterylnych rękawiczek chirurgicznych przed kontaktem ze sterylnymi instrumentami i materiałami chirurgicznymi.
  13. Rozłożenie wszystkich autoklawowanych instrumentów chirurgicznych na sterylnej ściereczce chirurgicznej.
  14. Odcięcie trzech niezależnych, 1-calowych odcinków sterylnej nici chirurgicznej Prolene 7-0.
  15. Umieszczenie patyczków bawełnianych i gazy na ściereczce chirurgicznej.
  16. Przykrycie szczura sterylną ściereczką chirurgiczną, pozostawiając odsłonięty jedynie wysterylizowany obszar szyi.
  17. Wycięcie dodatkowego niewielkiego otworu w ściereczce, odsłaniającego część stożka do narkozy. Będzie to miejsce przymocowania cewnika z balonikiem za pomocą taśmy podczas urazu.

2. Procedury operacyjne

  1. Przez cały czas trwania procedury chirurgicznej oceniaj głębokość znieczulenia, monitorując częstotliwość oddychania (powinna być stabilna i uznana za prawidłową), a także wykonując co 15 min test ucisku palca u stopy. Jeśli częstotliwość oddychania wzrośnie lub pojawi się reakcja na ucisk palca u stopy, należy przerwać manipulacje chirurgiczne i zwiększyć stężenie izofluranu do 2,5%.
  2. Odsłoń wspólną tętnicę szyjną (CCA).
    1. Wykonaj powierzchowne, proste, podłużne cięcie w linii szyi między kośćmi żuchwy szczura. Cięcie powinno mieć długość około 1,5-2 cm.
    2. Wykonaj nacięcie przez tkankę łączną pod skórą, aż do odsłonięcia warstwy mięśniowej. Odsuń ślinianki znajdujące się pod skórą, aby uzyskać dostęp do tkanki mięśniowej.
    3. Oddziel tępym sposobem tkankę łączną od mięśnia, wsuwając zamknięte nożyczki między warstwę mięśniową a tkankę łączną i delikatnie rozwierając nożyczki, jednocześnie odciągając skórę do góry.
  3. Przeprowadź podłużną dyssekcję dwóch widocznych mięśni (mięśnia mostkowo-gnykowego i mostkowo-obojczykowo-sutkowatego) wzdłuż lewej strony tchawicy, aż do momentu zaobserwowania trzeciego mięśnia (mięśnia mostkowo-wejściowego), który biegnie prostopadle do dwóch mięśni powierzchownych.
  4. Używając pęsety, utwórz okno oddzielające ten mięsień prostopadły (mostkowo-wejściowy) od mięśnia podłużnego (mostkowo-gnykowego) biegnącego nad tchawicą. Wykonaj to oddzielenie delikatnie, aby zapobiec urazom tępym tchawicy.
  5. Wsuń pęsetę pod mięsień prostopadły i przetnij tkankę, aby rozdzielić dwa mięśnie podłużne i odsłonić CCA.
  6. Przeprowadź dyssekcję CCA.
    1. Wykonaj dyssekcję CCA w pobliżu rozwidlenia, aż do odsłonięcia wewnętrznej tętnicy szyjnej (ICA) i zewnętrznej tętnicy szyjnej (ECA).
    2. Wykonaj dyssekcję górnej tętnicy tarczyowej (STA), która odgałęzia się od ECA.
    3. Za pomocą wcześniej przygotowanych szwów Prolene podwiąż STA oraz ECA w pobliżu ich odpowiednich rozgałęzień. Pozostaw większość nici po jednej stronie węzła i chwyć każdy szew zakrzywionym hemostatem.
    4. Zakończ dyssekcję wokół ICA, wsuń pęsetę pod i wokół ICA, a następnie użyj nieurazowego zacisku naczyniowego, aby uzyskać kontrolę dystalną. Zaciśnij tętnicę potyliczną wraz z ICA.
    5. Wykonaj dyssekcję CCA proksymalnie względem rozwidlenia, dbając o oddzielenie nerwu błędnego od CCA.
    6. Wsuń pęsetę pod i wokół CCA i użyj nieurazowego zacisku naczyniowego, aby uzyskać kontrolę proksymalną. Umieść zacisk co najmniej 5 mm od rozwidlenia.
  7. Wykonaj uraz balonowy.
    1. Zmanipuluj zakrzywione hemostaty trzymające każdą podwiązaną gałąź tętniczą, aby odsłonić rozwidlenie między ECA a gałęzią górną.
    2. Delikatnie zdyssekuj tkankę w miejscu rozwidlenia, a następnie wykonaj nacięcie arteriotomii między ECA a gałęzią górną za pomocą nożyczek do mikrodysekcji.
    3. Użyj patyczka bawełnianego, aby wypchnąć całą krew z CCA i oczyścić miejsce arteriotomii.
    4. Wprowadź nienapompowany cewnik balonowy przez arteriotomię i posuń go do CCA, aż proksymalny koniec balonu znajdzie się poza rozwidleniem.
    5. Przymocuj cewnik taśmą do stożka nosowego, aby balon nie wysunął się z tętnicy podczas pompowania.
    6. Powoli napompuj balon do ciśnienia 5 atmosfer i pozostaw w CCA przez 5 min, aby wywołać uraz tętnicy. Upewnij się, że ciśnienie pozostaje stałe przez całe 5 min.
    7. Po 5 min spuść powietrze z balonu i delikatnie usuń go z CCA przez miejsce arteriotomii.
    8. Przepłucz CCA, delikatnie uciskając zacisk na CCA. Nie usuwaj zacisku.
    9. Podwiąż ECA proksymalnie względem arteriotomii, a następnie zdejmij zaciski z CCA i ICA, aby przywrócić przepływ krwi przez CCA do ICA. Upewnij się, że wokół arteriotomii nie ma widocznego krwawienia i że CCA pulsuje.
  8. Aplikuj 100 µL żelu terapeutycznego lub samego nośnika żelu Pluronic okożylnie wzdłuż uszkodzonej CCA. Zrób to, aplikując 50 µL po lewej stronie CCA, a następnie 50 µL po prawej stronie CCA, aby zapewnić równomierną powłokę uszkodzonej tętnicy.
  9. Zamknij miejsce rany.
    1. Odetnij nadmiar szwów Prolene.
    2. Zamknij ranę, stosując przerywane szwy z nici vicryl 4-0 lub 6-0 wzdłuż tkanki łącznej.
    3. Zakończ zamykanie rany, stosując szew ciągły z nici nylonowej 4-0 wzdłuż skóry.

3. Procedury pooperacyjne

  1. Umieścić szczura samotnie w czystej klatce, z połową klatki pod lampą grzewczą, i monitorować go do czasu odzyskania przez zwierzę wystarczającej świadomości, aby mógł utrzymać pozycję leżenia na brzuchu. Przetrzymywać szczura w oddzielnej klatce do czasu pełnego wybudzenia i odzyskania sprawności ruchowej przed przeniesieniem z powrotem do oryginalnej klatki.
  2. Monitorować szczura codziennie przez kolejne trzy dni, a następnie trzy razy w tygodniu aż do momentu eutanazji. Eutanazję przeprowadzić poprzez przedawkowanie izofluranu, a następnie dwustronną torakotomię, zgodnie z opisem poniżej.
    1. Wykorzystać skalę grymasów National Centre for the Replacement Refinement & Reduction of Animals in Research (NC3Rs) w celu oceny poziomu bólu pooperacyjnego. Jeśli jakikolwiekt zwierzę będzie wykazywać oznaki bólu lub rozwiną się jakiekolwiek deficyty neurologiczne, należy je natychmiast poświęcić.
    2. W przypadku zwierząt, które nie otrzymują karprofenu, podawać paracetamol w dawce 6 mg/mL w wodzie pitnej od 24 h przed operacją do 48 h po operacji. Paracetamol zapewnia analgezję przy minimalnym działaniu przeciwzapalnym.
    3. Alternatywnie można zastosować inne strategie przeciwbólowe o minimalnym działaniu przeciwzapalnym, takie jak buprenorfina lub buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu. Należy skonsultować się z zespołem weterynaryjnym w swojej instytucji.

4. Pobieranie i obrazowanie tkanek

  1. Dwa tygodnie po operacji uśmierć szczura poprzez przedawkowanie środka znieczulającego (5% izofluranu). Alternatywnie, uśmierć szczury w wcześniejszym punkcie czasowym, aby przeanalizować różne aspekty odpowiedzi na uszkodzenie tętnicy.
    1. Po ustaniu oddechu należy przeprowadzić obustronną torakotomię jako drugą metodę eutanazji.
  2. Wykonaj nacięcie boczne przez brzuch, a następnie przetnij tkanki ku górze, przez przeponę i żebra, odsłaniając jamę klatki piersiowej.
  3. Przeprowadzić perfuzję i utrwalić tętnice.
    1. Wprowadź kaniulę 18 G podłączoną do grawitacyjnego systemu perfuzji-fiksacji przez lewą komorę serca. Aby zapewnić równoważne ciśnienie u wszystkich szczurów, zaznacz wysokość systemu perfuzyjnego względem blatu stołu laboratoryjnego (wysokość 120 cm, co odpowiada 91 ± 3 mmHg).
    2. Zaciśnij kaniulę wraz z komorą za pomocą zakrzywionego kleszczyka hemostatycznego.
    3. Wykonaj nacięcie w prawym przedsionku, otwierając obieg naczyniowy, a następnie rozpocznij perfuzję przy użyciu PBS, a po nim 2-4% paraformaldehydu (po około 250 ml każdego z roztworów).
    4. Przygotuj paraformaldehyd rozcieńczony w PBS w dniu poświęcenia zwierząt lub najpóźniej w noc poprzedzającą poświęcenie. W przypadku przygotowania roztworu w dniu poświęcenia, upewnij się, że paraformaldehyd ostygł do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem perfuzji. Przechowuj paraformaldehyd w 4 °C.
  4. Po utrwaleniu wyizolować lewą i prawą tętnicę szyjną i przechowywać w 4 °C przez 2 h w 2-4% paraformaldehydzie.
  5. Przenieść tętnice do 30% sacharozy i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Po 16–24 h należy zatopić tętnice w związku OCT (optimal cutting temperature), a następnie zamrozić tak przygotowane bloki tkanek.
    1. Kondycjonować tętnice w OCT w temperaturze pokojowej przez 10 min. Umieścić tętnicę równolegle do płaszczyzny formy do mrożenia wypełnionej OCT, zaznaczając stronę formy, w którą skierowana jest bifurkacja tętnicy. Gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie.
    2. Przechowywać zamrożone bloki długoterminowo w temperaturze -80 °C.
  7. Wykonaj przekroje bloków mrożonych przy użyciu kriostatu.
    1. Pobrać sześć 5 µm grube przekroje poprzeczne tętnic na każdym preparacie, przy czym preparat 1 zaczyna się od miejsca rozwidlenia.
    2. Wykonaj seryjne cięcia bloków mrożonych aż do momentu, gdy hiperplazja nie będzie już widoczna (około 100 preparatów).
  8. Hematoksylina & eozyna (H&E) barwienie preparatów18
    1. Oblicz powierzchnię uszkodzenia, barwiąc co dziesiąty przekrój wzdłuż całej tętnicy, zaczynając od miejsca rozwidlenia (np. przekroje 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100).
    2. Przebarw barwne dodatkowe skrawki wokół miejsca urazu, aby zidentyfikować skrawka z maksymalnym stopniem niedrożności (np. jeśli na skrawkach 20, 30 i 40 widoczna była hiperplazja, należy przebarwić skrawki 15, 25, 35 i 45).
    3. Przebarwić i poddać analizie ilościowej preparat z maksymalną okluzją oraz preparaty równodstale położone przed i po preparacie z maksymalną okluzją (np. jeśli maksymalna okluzja została stwierdzona w preparacie nr 35, należy przebarwić i przeanalizować ilościowo preparaty nr 25, 45 itd.), łącznie od 3 do 10 preparatów na szczura.
  9. W celu obrazowania metodą mikroskopii fluorescencyjnej z płatowym światłem (light sheet fluorescence microscopy), tętnice należy przechowywać przez noc w 4 °C po utrwaleniu w kroku 4.4.
    1. Inkubować tętnicę z pierwotnym przeciwciałem królika anty-CD31 w rozcieńczeniu 1:500 w rozcieńczalniku (pH 7,4) przez 3 dni. Następnie przeprowadzić barwienie kontrastowe tętnicy z użyciem wtórnego przeciwciała anty-króliczego Alexa Fluor 647 w rozcieńczeniu 1:500 przez 2 dni.19.
    2. Przezroczystość tętnicy z wykorzystaniem metody iDISCO+20.
    3. Wykonaj obrazowanie tętnicy przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu z płatą światła21Wygeneruj obrazy za pomocą oprogramowania (np. Imaris)19.
  10. Ilościowo określ hiperplazję neointimy. Jeśli to możliwe, przeprowadź analizę ilościową w sposób zaślepiony.
    1. Użyj oprogramowania ImageJ, aby obrysować obwód tuniki wewnętrznej (intima), wewnętrznej błony elastycznej (IEL) oraz zewnętrznej błony elastycznej (EEL) tętnicy na każdym z 3–10 preparatów określonych powyżej (krok 4.8.3).
    2. Określ pole powierzchni każdego obrysowanego obszaru w programie ImageJ i wyeksportuj te wartości. Obrys błony wewnętrznej (intima) pozwala wyznaczyć pole światła naczynia, obrys wewnętrznej elastycznej błony (IEL) pozwala wyznaczyć pole IEL, a obrys zewnętrznej elastycznej błony (EEL) pozwala wyznaczyć pole EEL.
    3. Oblicz średnią z wartości uzyskanych z 3–10 preparatów, aby wyznaczyć średni stopień uszkodzenia (% zatorowości, stosunek grubości warstwy wewnętrznej do środkowej (I:M), hiperplazja neointimy) dla tętnicy szyjnej każdego szczura.
      Hiperplazja neointimy = powierzchnia IEL - powierzchnia światła naczynia
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia wszystkie materiały i narzędzia chirurgiczne wykorzystane do wykonania tego zabiegu. Hematoksylina & eozyna (H&E) barwienie przekrojów poprzecznych tętnic po dwóch tygodniach od uszkodzenia pozwala na wyraźną wizualizację hiperplazji neointimy. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy H&Przekroje poprzeczne tętnic barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E) pochodzące z tętnicy zdrowej, uszkodzonej oraz poddanej lecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej szczura jest jednym z najszerzej stosowanych i badanych modeli zwierzęcych restenozy. Zarówno oryginalny model uszkodzenia balonu3, jak i zmodyfikowana zmienność uszkodzenia segmentowego kontrolowanego ciśnieniem10 dostarczyły informacji na wiele aspektów reakcji na uszkodzenie tętnic, która występuje również u ludzi, z nielicznymi ograniczeniami polegającymi na tym, że skrzeplina bogata w fibrynę rzadko się rozwija, a miejscowy stan zapal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie zachodzą konflikty interesów w związku z publikacją niniejszego manuskryptu.

Podziękowania

N.E.B. był wspierany przez grant szkoleniowy z National Institute of Environmental Health Sciences (5T32ES007126-35, 2018) oraz stypendium przeddoktoranckie American Heart Association (20PRE35120321). E.S.M.B. był stypendystą KL2 częściowo wspieranym przez UNC Clinical and Translational Science Award-K12 Scholars Program (KL2TR002490, 2018) oraz National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). Autorzy dziękują dr Pablo Arielowi z UNC Microscopy Services Laboratory za pomoc w LSFM. Mikroskopię fluorescencyjną arkusza świetlnego wykonano w Laboratorium Usług Mikroskopowych. Laboratorium Usług Mikroskopowych, Zakład Patologii i Medycyny Laboratoryjnej, jest częściowo wspierane przez P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant dla UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml strzykawkaFisher14955450
1 ml strzykawka z igłąBD309626
2 Francuski cewnik do embolektomii balonowej FogartyEdwards LifeSciences120602F
4-0 Szew etylonowy (nylonowy)Ethicon Inc662H
4-0 Szew VicrylEthicon IncJ214H
7-0 Szew prolenowyEthicon Inc8800H
70% alkohol
Anti-Rabbit Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA21245
Siarczan atropinyVedco Incdo użytku weterynaryjnego
Waciki bawełnianePuritan806-WC
Zakrzywione hemostatykiFine Science Tools13009-12
Cienkie zakrzywione kleszczeFine Science Tools11203-25
Drobne nożyczkiFine Science Tools14090-11
GauzeCovidien2252
IHC-Tek Diluent (pH 7,4)IHC WorldIW-1000
InsufflatorMerit MedicalIN4130
Roztwór
joduMaść nawilżająca do oczuDechrado użytku weterynaryjnego
Nożyczki MayoFine Science Tools14010-15
Micro SerrefinesFine Science Tools18055-05
Nożyczki do mikrodysekcjiFine Science Tools15004-08
Micro-Serrefine Zacisk do kleszczy FineScience Tools18057-14
Uchwyt igłyFine Science Tools12003-15
Pluronic-127 (rozcieńczony w sterylnej wodzie)Sigma-AldrichP244325% przygotowany
Królik Anti-CD31Abcamab28364
RetraktorWygięte spinacze do papieru działają dobrze
Rimadyl (Carprofen)Zoetis Incdo użytku weterynaryjnego
Roztwórsoli fizjologicznej
Standardowe kleszczeFine Science Tools11006-12
Sterylna serwetaDynarex4410
T-Pins
etylowy

Bibliografia

  1. American Heart Association. Cardiovascular Disease: A Costly Burden for America, Projections Through 2035. American Heart Association CVD Burden Report. , (2017).
  2. Singh, R. B., Mengi, S. A., Xu, Y. J., Arneja, A. S., Dhalla, N. S. Pathogenesis of atherosclerosis: A multifactorial process. Experimental and Clinical Cardiology. 7 (1), 40-53 (2002).
  3. Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation. 49 (2), 208-215 (1983).
  4. Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation. 49 (3), 327-333 (1983).
  5. Sartore, S., et al. Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling: from innocent bystander to active participant. Circulation Research. 89 (12), 1111-1121 (2001).
  6. Tanaka, K., et al. Circulating progenitor cells contribute to neointimal formation in nonirradiated chimeric mice. The FASEB Journal. 22 (2), 428-436 (2008).
  7. Henry, M., et al. Carotid angioplasty and stenting under protection. Techniques, results and limitations. The Journal of Cardiovascular Surgery. 47 (5), Torino. 519-546 (2006).
  8. Kounis, N. G., et al. Thrombotic responses to coronary stents, bioresorbable scaffolds and the Kounis hypersensitivity-associated acute thrombotic syndrome. Journal of Thoracic Disease. 9 (4), 1155-1164 (2017).
  9. Jackson, C. L. Animal models of restenosis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (3), 122-130 (1994).
  10. Shears, L. L., et al. Efficient inhibition of intimal hyperplasia by adenovirus-mediated inducible nitric oxide synthase gene transfer to rats and pigs in vivo. Journal of the American College of Surgeons. 187 (3), 295-306 (1998).
  11. Takayama, T., et al. A murine model of arterial restenosis: technical aspects of femoral wire injury. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  12. Zhang, L. N., Parkinson, J. F., Haskell, C., Wang, Y. X. Mechanisms of intimal hyperplasia learned from a murine carotid artery ligation model. Current Vascular Pharmacology. 6 (1), 37-43 (2008).
  13. Jahnke, T., et al. Characterization of a new double-injury restenosis model in the rat aorta. Journal of Endovascular Therapy. 12 (3), 318-331 (2005).
  14. Gregory, E. K., et al. Periadventitial atRA citrate-based polyester membranes reduce neointimal hyperplasia and restenosis after carotid injury in rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (10), 1419-1429 (2014).
  15. Buglak, N. E., Jiang, W., Bahnson, E. S. M. Cinnamic aldehyde inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia in Zucker Diabetic Fatty rats. Redox Biology. 19, 166-178 (2018).
  16. Bahnson, E. S., et al. Long-term effect of PROLI/NO on cellular proliferation and phenotype after arterial injury. Free Radical Biology and Medicine. 90, 272-286 (2016).
  17. Gilbert, J. C. W., Davies, M. C., Hadgraft, J. The behaviour of Pluronic F127 in aqueous solution studied using fluorescent probes. International Journal of Pharmaceutics. 40 (1-2), 93-99 (1987).
  18. Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
  19. Buglak, N. E., et al. Light Sheet Fluorescence Microscopy as a New Method for Unbiased Three-Dimensional Analysis of Vascular Injury. Cardiovascular Research. , (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  21. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. , (2018).
  22. Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
  23. Xiangdong, L., et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review. Protein Cell. 2 (3), 189-201 (2011).
  24. Chen, H., Li, D., Liu, M. Novel Rat Models for Atherosclerosis. Journal of Cardiology and Cardiovascular Sceinces. 2 (2), 29-33 (2018).
  25. Xing, D., Nozell, S., Chen, Y. F., Hage, F., Oparil, S. Estrogen and mechanisms of vascular protection. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (3), 289-295 (2009).
  26. Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
  27. Pellet-Many, C., et al. Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury. Cardiovascular Research. 108 (2), 288-298 (2015).
  28. Wu, B., et al. Perivascular delivery of resolvin D1 inhibits neointimal hyperplasia in a rat model of arterial injury. Journal of Vascular Surgery. 65 (1), 207-217 (2017).
  29. Tan, J., Yang, L., Liu, C., Yan, Z. MicroRNA-26a targets MAPK6 to inhibit smooth muscle cell proliferation and vein graft neointimal hyperplasia. Scientific Reports. 7, 46602(2017).
  30. Pearce, C. G., et al. Beneficial effect of a short-acting NO donor for the prevention of neointimal hyperplasia. Free Radical Biology and Medicine. 44 (1), 73-81 (2008).
  31. Cao, T., et al. S100B promotes injury-induced vascular remodeling through modulating smooth muscle phenotype. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (11), 2772-2782 (2017).
  32. Madigan, M., Entabi, F., Zuckerbraun, B., Loughran, P., Tzeng, E. Delayed inhaled carbon monoxide mediates the regression of established neointimal lesions. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1026-1033 (2015).
  33. Khurana, R., et al. Angiogenesis-dependent and independent phases of intimal hyperplasia. Circulation. 110 (16), 2436-2443 (2004).
  34. Tsihlis, N. D., Vavra, A. K., Martinez, J., Lee, V. R., Kibbe, M. R. Nitric oxide is less effective at inhibiting neointimal hyperplasia in spontaneously hypertensive rats. Nitric Oxide. 35, 165-174 (2013).
  35. Chen, J., et al. Inhibition of neointimal hyperplasia in the rat carotid artery injury model by a HMGB1 inhibitor. Atherosclerosis. 224 (2), 332-339 (2012).
  36. Mano, T., Luo, Z., Malendowicz, S. L., Evans, T., Walsh, K. Reversal of GATA-6 downregulation promotes smooth muscle differentiation and inhibits intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation Research. 84 (6), 647-654 (1999).
  37. Becher, T., et al. Three-Dimensional Imaging Provides Detailed Atherosclerotic Plaque Morphology and Reveals Angiogenesis after Carotid Artery Ligation. Circulation Research. 126 (5), 619-632 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model uszkodzenia balonowego tętnicy szyjnejuszkodzenie balonowe sterowane ciśnieniemmikroskopia fluorescencyjna z arkuszem światłaanaliza hiperplazji neointimytechnika zacisku naczyniowegometoda nacięcia arteriotomiiwspólna tętnica szyjnaanaliza histologiczna tętnicyaplikacja żelu terapeutycznego
Segmentowe uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej szczura z kontrolowanym ciśnieniem z okołoprzybytkowym zastosowaniem terapeutycznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.