Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie aktywowanego osocza bogatopłytkowego do hodowli ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60480

⸱

4 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Kansai Medical University, 2Department of Plastic Surgery, Zhejiang Provincial People's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

W tym raporcie opisujemy metodę podwójnego wirowania do przygotowania aktywowanego osocza bogatopłytkowego (PRP). Za pomocą autologicznej trombiny wyhodowano ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (hASC). Wykazano, że aktywowany PRP sprzyja proliferacji hASC.

Streszczenie

Aktywowane osocze bogatopłytkowe (PRP) przygotowane z pełnej krwi za pomocą wirowania wykazało efekt stymulujący proliferację w kilku rodzajach hodowanych komórek, co sugeruje możliwe zastosowanie w medycynie regeneracyjnej. W tym przypadku zastosowano metodę podwójnego wirowania do przygotowania PRP z krwi pełnej. PRP był dalej aktywowany przez autologiczną trombinę. Zmierzono liczbę płytek krwi w aktywowanym PRP i zbadano działanie stymulujące proliferację w ludzkich komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hASC). Uzyskana liczba płytek krwi była 11,5 razy wyższa w PRP niż w osoczu krwi pełnej. Namnażanie się hASC zostało znacznie zwiększone przez inkubację z 1% PRP. Opisana metoda może być stosowana do powtarzalnego otrzymywania PRP o wysokim stężeniu płytek krwi. PRP przygotowany tą metodą wyraźnie sprzyja proliferacji hASC.

Wprowadzenie

Aktywowane osocze bogatopłytkowe (PRP) jest przygotowywane przez odwirowanie pełnej krwi i okazuje się, że zawiera płytki krwi znacznie powyżej poziomu wyjściowego1. Autologiczny RPP jest szeroko stosowany w leczeniu chirurgicznym, w tym w gojeniu ran2, urazach kostnych3 i operacjach estetycznych4,5. Po aktywacji płytek krwi w PRP, α-granulki obecne w płytkach krwi uwalniają kilka czynników wzrostu, takich jak płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), insulinopodobne czynniki wzrostu (IGF), transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) i inne1,6,7. Te czynniki wzrostu odgrywają ważną rolę w proliferacji komórek8, migration9 i differentiation9.

Do tej pory kilka badań wykazało stymulujący proliferację wpływ PRP na różne rodzaje komórek10,11,12,13,14,15,16. Jednym z tych typów komórek są ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (hASC); hASC występują w ludzkiej tkance tłuszczowej i mogą być łatwo zbierane w dużych ilościach. Efekt regeneracyjny hASC sugeruje potencjalne zastosowanie w zastosowaniach klinicznych8. Nasze poprzednie badania wykazały, że w porównaniu z nieaktywowanym PRP, aktywowany PRP miał wyraźny wpływ proliferacyjny na hASC i ludzkie fibroblasty skóry (hDFs)8. Ponadto informowaliśmy, że PRP promuje proliferację hDF poprzez szlak sygnałowy ERK1/217. Niedawno informowaliśmy również, że PRP promuje proliferację hASC poprzez szlaki sygnałowe ERK1/2, JNK i Akt18. W hASC PRP odgrywa ważną rolę jako suplement sprzyjający proliferacji. Wiedza na temat wpływu PRP na hASC pomoże w opracowaniu metod hodowli na dużą skalę i umożliwi dalsze badania nad mechanizmem proliferacji w hASC.

W tym raporcie przedstawiamy i opisujemy metodę przygotowania PRP z pełnej krwi za pomocą wirowania. Metoda ta wykorzystuje metodę podwójnego wirowania w celu łatwego przygotowania stabilnej próbki PRP. Aby ocenić biologiczną funkcję PRP, zmierzyliśmy skoncentrowaną liczbę płytek krwi i stężenie kilku czynników proliferacji. Potwierdzono również działanie stymulujące wzrost poprzez zastosowanie przygotowanego PRP do hodowli hASC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki Uniwersytetu Medycznego Kansai zgodnie z wytycznymi etycznymi Deklaracji Helsińskiej z 1975 roku. Wszystkie próbki zostały pobrane i wykorzystane za świadomą zgodą dawców.

1. Przygotowanie

  1. Po uzyskaniu świadomej zgody należy pobrać krew od zdrowych dorosłych dawców. Tutaj pobrano krew od czterech dawców krwi płci męskiej w wieku od 28 do 38 lat.
    1. Zaleca się dawcom wypicie 500 ml wody na 6 godzin przed pobraniem krwi.
      UWAGA: Zakresy referencyjne dla hemoglobiny (Hb), liczby czerwonych krwinek (RBC) i stężenia płytek krwi (PL) u zdrowych osób dorosłych są opisane przez Vajpayee19. Aby dawca mógł zostać dopuszczony do oddania krwi, musi zostać poddany analizie krwi w tych zakresach.

2. Pobieranie krwi

  1. Niech dawcy krwi będą siedzieć podczas zabiegu.
  2. Nosić rękawice. Załóż opaskę uciskową na ramię dawcy, podczas gdy dawca zaciśnie pięść.
  3. Po znalezieniu odpowiedniej żyły wysterylizuj skórę dwukrotnie 70% alkoholem i wbij igłę.
  4. Do pobrania krwi należy użyć strzykawki o strzykawce 21 g. Nie poluzuj opaski uciskowej podczas pobierania krwi.
    1. Użyj probówki o pojemności 8,5 ml do pobrania krwi. Obserwuj stan krwi w probówce i zmień ją na nową, gdy tylko przepływ krwi zwolni.
    2. Zbierz wystarczającą ilość krwi, aby wykonać PRP. Zebrać cztery probówki z antykoagulowaną krwią o całkowitej objętości 34 ml. Odwróć probówki 10 razy, aby wymieszać krew z antykoagulantem.
    3. Użyj probówki do pobierania krwi w surowicy o pojemności 10 ml (patrz tabela materiałów) bez antykoagulantu, aby pobrać krew do wykonania aktywatora (patrz krok 4). Zbierz 10 ml krwi nieprzeciwzakrzepowej.

3. Metoda podwójnego spinu do tworzenia PRP

  1. Weź 40 μl antykoagulowanej krwi pełnej do oceny liczby płytek krwi. Używaj końcówek do pipet z filtrem, aby chronić pipetę przed zanieczyszczeniem krwi.
  2. Odwirowywać antykoagulowaną krew pełną przez 7 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze pokojowej. Jest to pierwszy wir, w którym uzyskano warstwowe próbki krwi. Górna warstwa to frakcja osocza, środkowa warstwa to cienka łódź kożuchowa, a najniższa warstwa składa się z czerwonych krwinek.
  3. Użyj markera, aby narysować linię 2 mm poniżej kożucha.
  4. Użyj strzykawki o pojemności 20 ml z długą kaniulą, aby zebrać osocze dokładnie do znaku 2 mm poniżej kożuchowego płaszcza. Żółte osocze z kożuchową sierścią zawiera płytki krwi, leukocyty i niektóre erytrocyty. Pobrać osocze z dwóch probówek do probówki do pobierania krwi w surowicy. Połączyć zawartość 4 probówek w 2 probówki, aby uzyskać łączną objętość 16 ml zebranego osocza.
  5. Odwirować osocze z kożuchem przez 5 minut w temperaturze 1 600 x g i temperaturze pokojowej. To jest drugi obrót. Supernatantem warstwowych próbek krwi jest osocze ubogie w płytki krwi (PPP).
  6. Za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z długą kaniulą przenieść środek ochrony roślin do probówki o pojemności 50 ml z surowicą krwi zawierającej 1 ml płynu jako miarę. Płytki krwi, które zgromadziły się w osadzie trombocytów w pozostałym 1 ml osocza zastosowano jako PRP. Całkowita objętość pobranego PRP wynosiła 2 ml.
  7. Zmieszaj PRP w każdej probówce, a następnie zbierz w jednej probówce (łącznie 2 ml).
  8. Weź 400 μl PRP do liczby płytek krwi.
  9. Podzielić PRP na kilka probówek o pojemności 1,5 ml, zawierających około 400 μl w każdej probówce. W sumie są cztery rurki. Zalecane jest około 500 μl PRP na probówkę.

4. Przygotuj aktywator

  1. Pozostawić 10 ml krwi bez antykoagulantu w probówce do pobierania krwi w surowicy (krok 2.3.3) na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odwirować próbkę krwi bez antykoagulantu przez 8 minut przy 2,015 x g i temperaturze pokojowej w wirówce laboratoryjnej.
  3. Zebrać supernatant w postaci trombiny autologicznej.
  4. Zmieszać 0,5 M CaCl2 i autologiczną trombinę w stosunku 1:1 (v/v) jako aktywator. Na przykład 500 μl CaCl2 zmieszano z 500 μl autologicznej trombiny. Przygotować całkowitą objętość aktywatora wynoszącą 1 ml.

5. Aktywacja PRP

  1. Wymieszaj PRP i aktywator w proporcji 10:1 (v/v). Wymieszaj 400 μl PRP z 40 μl aktywatora w każdej probówce o pojemności 1,5 ml, a następnie inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Jest to aktywowane PRP w postaci skoagulowanej.

6. Przechowywanie PRP

  1. Odwirować aktywowane PRP przy 9 000 x g przez 10 minut w wirówce laboratoryjnej o temperaturze 4 °C.
  2. Pobrać supernatant za pomocą pipety do strzykawki o odpowiedniej objętości.
  3. Przefiltrować supernatant przez membranę 0,22 μm.
  4. Przechowuj końcowy PRP w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

7. Pomiar stężenia płytek krwi i poziomów czynnika wzrostu

  1. Policz liczbę płytek krwi w całym osoczu i PRP za pomocą zautomatyzowanego systemu hematologicznego (patrz tabela materiałów).
  2. Analizuj stężenia poziomów PDGF-BB, IGF i EGF w całym osoczu i aktywowanym PRP przy użyciu dostępnych na rynku zestawów ELISA (patrz tabela materiałów).

8. Test proliferacji komórek

  1. Wyizoluj hASC za pomocą wcześniej opisanej metody18.
    1. Wysiewać hASC o gęstości 1,0 x 104 komórki/basenik na 24-dołkowych płytkach hodowlanych i inkubować w DMEM zawierającym 10% FBS i antybiotyki przez noc w temperaturze 37 °C. W eksperymentach należy stosować hASC z pasaży 7-9.
  2. Zastąp pożywkę komórkową DMEM bez surowicy. Po 6 godzinach dodać PRP w wyznaczonych stężeniach i kontynuować inkubację przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
  3. Inkubować z roztworem WST-8 (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Odczytać absorbancję przy 450 nm za pomocą wielodołkowego czytnika płytek.
  4. Skonstruuj krzywą standardową: Wysiewaj hASC o gęstości 0, 6 250, 12 500, 25 000, 50 000 i 100 000 komórek/dołek na 24-dołkowych płytkach w DMEM z 10% FBS przez 3 godziny. Odczytać absorbancję przy 450 nm po inkubacji z roztworem WST-8 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C
    1. Narysuj krzywą standardową, wykreślając liczbę komórek w funkcji A450 nm.
  5. Oszacuj liczbę hASC na podstawie absorbancji na podstawie krzywej wzorcowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wzbogacone stężenia płytek krwi i PDGF-BB w PRP
Stężenia płytek krwi i PDGF-BB w PRP wzrosły odpowiednio 11,5-krotnie i 25,9-krotnie tak samo jak w całym osoczu. Jednak stężenia EGF w PRP nie uległy zmianie, a IGF wynosił tylko 70% stężenia w całym osoczu (Tabela 1). Eksperymenty powtórzono czterokrotnie metodą podwójnego spinu.

Zwiększona proliferacja hASC przez stymulację PRP
Proliferacja komórek została zwiększona przez leczenie 0,2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Po aktywacji PRP kilka czynników wzrostu, takich jak PDGF, EGF, IGF, TGF-β i VEGF 1,6,7 "aktywuje" komórki i tkanki ran, przyspieszając gojenie się ran20,21. W przypadku chirurgii rekonstrukcji plastycznej wykazano, że aktywowane komórki indukują gojenie i poprawiają estetykę22,23. Alternatywnie, ludzkie komórki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Nie dotyczy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 20 ml, blokada strzykawki Terumo typuTerumo, Tokio, Japonia.Probówka SS-20LZP
50 ml, polipropylenowa rurka stożkowaCorning, NY, USA.352070
Zautomatyzowany system hematologicznySysmex Corp., Tokio, JaponiaXE-2100,
zestaw SafeTouch PSV z adapterem luer, 21 G x 3/4"Nipro, Osaka, Japonia.32-384
Probówka do pobierania krwi, roztwór ACD Probówka do pobierania krwi, 8,5 mlBD Vacutainer, NJ, USA.
Probówka do pobierania krwi, probówka do pobierania krwi w surowicy/monovette, 10 mlBD Vacutainer, NJ, USA.366430
Chlorek wapnia, 1 mEq / ml,Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japonia.3215400A1061
Kaniula, igła BS bez skośności, 18 G (1,2 mm) x 75 mmBS Medical, Tokio, Japonia.BS-81007Nie na sprzedaż
Zestaw do liczenia komórek-8Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, JaponiaCK04
Kokusan, Tokio, Japonia.H-19F
Eppendorf, Hamburg, Niemcy.5415R
EnSpire 2300 Czytnik wielu etykietPerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Jednostka filtrującaMerck Millipore, Co. Cork, Irlandia.
Ludzki zestaw EGF Quantikine ELISAR& D Systems, Minneapolis, MN, USADEG00
Ludzki zestaw IGF-I Quantikine ELISA R& D Systems, Minneapolis, MN, USADG100
Ludzki zestaw PDGF-BB Quantikine ELISA R& D Systems, Minneapolis, MN, USADBB00
ART 1000 Końcówka barierowa ThermoScientific, MA, USA.2079-05-HR
Pipeta nichipet EXII 100-1000 μ LNichiryo, Saitama, Japonia.00-NPX2-1000
Bezprądowe rękawice egzaminacyjne z nitryluKimberly-Clark50707
Alkohol Yamazen do dezynfekcjiYamazen Pharmaceutical, Osaka, Japonia.A7L07
Igła do pobierania krwi 364606 Wirówka Wirówka SLGP033RS Końcówka do pipet , powiedział:

Bibliografia

  1. Eppley, B. L., Woodell, J. E., Higgins, J. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 114 (6), 1502-1508 (2004).
  2. Salcido, R. S. Autologous platelet-rich plasma in chronic wounds. Advances in Skin & Wound. 26 (6), 248(2013).
  3. Marx, R. E., et al. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 85 (6), 638-646 (1998).
  4. Bhanot, S., Alex, J. C. Current applications of platelet gels in facial plastic surgery. Facial Plastic Surgery. 18 (1), 27-33 (2002).
  5. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 107 (1), 238(2001).
  6. Eppley, B. L., Pietrzak, W. S., Blanton, M. Platelet-rich plasma: a review of biology and applications in plastic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 147-159 (2006).
  7. Lubkowska, A., Dolegowska, B., Banfi, G. Growth factor content in PRP and their applicability in medicine. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 26, 2 Suppl 1 3-22 (2012).
  8. Kakudo, N., et al. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 122 (5), 1352-1360 (2008).
  9. Kakudo, N., Morimoto, N., Kushida, S., Ogawa, T., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma releasate promotes angiogenesis in vitro and in vivo. Medical Molecular Morphology. 47 (2), 83-89 (2014).
  10. Liu, Y., Kalen, A., Risto, O., Wahlstrom, O. Fibroblast proliferation due to exposure to a platelet concentrate in vitro is pH dependent. Wound Repair and Regeneration. 10 (5), 336-340 (2002).
  11. Lucarelli, E., et al. Platelet-derived growth factors enhance proliferation of human stromal stem cells. Biomaterials. 24 (18), 3095-3100 (2003).
  12. Kilian, O., et al. Effects of platelet growth factors on human mesenchymal stem cells and human endothelial cells in vitro. European Journal of Medical Research. 9 (7), 337-344 (2004).
  13. Kanno, T., Takahashi, T., Tsujisawa, T., Ariyoshi, W., Nishihara, T. Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 63 (3), 362-369 (2005).
  14. Gruber, R., et al. Platelet-released supernatants increase migration and proliferation, and decrease osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells under in vitro conditions. Platelets. 15 (1), 29-35 (2004).
  15. Koellensperger, E., von Heimburg, D., Markowicz, M., Pallua, N. Human serum from platelet-poor plasma for the culture of primary human preadipocytes. Stem Cells. 24 (5), 1218-1225 (2006).
  16. Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25 (5), 1270-1278 (2007).
  17. Hara, T., et al. Platelet-rich plasma stimulates human dermal fibroblast proliferation via a Ras-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway. Journal of Artificial Organs. 19 (4), 372-377 (2016).
  18. Lai, F., et al. Platelet-rich plasma enhances the proliferation of human adipose stem cells through multiple signaling pathways. Stem Cell Research and Therapy. 9 (1), 107(2018).
  19. Vajpayee, N., Graham, S. S., Bem, S. Basic examination of blood and bone marrow. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22, 509-535 (2011).
  20. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound. 24 (4), 176-181 (2011).
  21. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  22. Cervelli, V., et al. platelet rich lipotransfert: our experience and current state of art in the combined use of fat and PRP. BioMed Research International. 2013, 434191(2013).
  23. Gentile, P., et al. Platelet-Rich Plasma and Micrografts Enriched with Autologous Human Follicle Mesenchymal Stem Cells Improve Hair Re-Growth in Androgenetic Alopecia. Biomolecular Pathway Analysis and Clinical Evaluation. Biomedicines. 7 (2), (2019).
  24. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 3 (6), 406(2015).
  25. Gentile, P., Casella, D., Palma, E., Calabrese, C. Engineered Fat Graft Enhanced with Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells for Regenerative Medicine: Clinical, Histological and Instrumental Evaluation in Breast Reconstruction. Journal of Clinical Medicine. 8 (4), (2019).
  26. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and Potentiality of Human Adipose-Derived Stem Cells (hASCs) Obtained from Enzymatic Digestion of Fat Graft. Cells. 8 (3), (2019).
  27. Scioli, M. G., Bielli, A., Gentile, P., Cervelli, V., Orlandi, A. Combined treatment with platelet-rich plasma and insulin favours chondrogenic and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in three-dimensional collagen scaffolds. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (8), 2398-2410 (2017).
  28. Marx, R. E., Garg, A. K. Dental and craniofacial applications of platelet-rich plasma. , Quintessence Publishing Company. (2005).
  29. Kakudo, N., Kushida, S., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma: the importance of platelet separation and concentration. Plastic and Reconstructive Surgery. 123 (3), author reply 1136-1137 1135-1136 (2009).
  30. Kakudo, N., Kushida, S., Minakata, T., Suzuki, K., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma promotes epithelialization and angiogenesis in a splitthickness skin graft donor site. Medical Molecular Morphology. 44 (4), 233-236 (2011).
  31. Kushida, S., et al. Platelet and growth factor concentrations in activated platelet-rich plasma: a comparison of seven commercial separation systems. Journal of Artificial Organs. 17 (2), 186-192 (2014).
  32. Morimoto, N., et al. Exploratory clinical trial of combination wound therapy with a gelatin sheet and platelet-rich plasma in patients with chronic skin ulcers: study protocol. British Medical Journal Open. 5 (5), 007733(2015).
  33. Kushida, S., Kakudo, N., Morimoto, N., Mori, Y., Kusumoto, K. Utilization of Platelet-Rich Plasma for a Fistula With Subcutaneous Cavity Following Septic Bursitis: A Case Report. Eplasty. 15, 31(2015).
  34. Eby, B. W. Platelet-rich plasma: harvesting with a single-spin centrifuge. Journal of Oral Implantology. 28 (6), 297-301 (2002).
  35. Castillo, T. N., Pouliot, M. A., Kim, H. J., Dragoo, J. L. Comparison of growth factor and platelet concentration from commercial platelet-rich plasma separation systems. The American Journal of Sports Medicine. 39 (2), 266-271 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda podw jnego wirowaniaautologiczna aktywacja trombinpomiar liczby p ytek krwitest proliferacjiprotok wirowaniatechnika hodowli kom rkowychzastosowanie w medycynie regeneracyjnejproliferacja kom rek macierzystych
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.