Method Article

Sterowanie prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D na bazie mikrotubul za pomocą temperatury

DOI:

10.3791/60484

⸱

November 26th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest wykorzystanie temperatury do kontrolowania prędkości przepływu trójwymiarowych płynów aktywnych. Zaletą tej metody jest nie tylko regulacja prędkości przepływu in situ, ale także dynamiczna kontrola, taka jak okresowe dostrajanie prędkości przepływu w górę i w dół.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę wykorzystania temperatury do dostrojenia prędkości przepływu trójwymiarowych (3D) płynów aktywnych napędzanych kinezyną, opartych na mikrotubulach. Metoda ta pozwala na dostrajanie prędkości in situ bez konieczności wytwarzania nowych próbek w celu osiągnięcia różnych pożądanych prędkości. Co więcej, metoda ta umożliwia dynamiczną kontrolę prędkości. Cykliczne zmiany temperatury powodują, że płyny przepływają okresowo szybko i wolno. Sterowalność ta opiera się na charakterystyce Arrheniusa dla reakcji kinezyna-mikrotubula, wykazującej kontrolowany średni zakres prędkości przepływu 4–8 μm/s. Przedstawiona metoda otworzy drzwi do projektowania urządzeń mikroprzepływowych, w których natężenia przepływu w kanale są lokalnie regulowane bez konieczności stosowania zaworu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Materia aktywna różni się od konwencjonalnej materii pasywnej ze względu na jej zdolność do przekształcania energii chemicznej w pracę mechaniczną. Materiał, który posiada taką zdolność, może składać się z żywych lub nieożywionych jednostek, takich jak bakterie, owady, koloidy, ziarna i włókna cytoszkieletu1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Te materialne byty wchodzą w interakcje ze swoimi sąsiadami. Na większą skalę organizują się samoorganizując się w wiry przypominające turbulenty (turbulencje aktywne) lub przepływy materiałów11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Zrozumienie samoorganizacji materii aktywnej doprowadziło do różnych zastosowań w molekularnych wahadłowcach, urządzeniach optycznych i obliczeniach równoległych21,22,23. Przeniesienie aplikacji na wyższy poziom wymaga kontroli wykraczającej poza samoorganizację. Na przykład Palacci i in. opracowali koloid otoczony hematytem, który samonapędzał się tylko wtedy, gdy był wystawiony na ręcznie kontrolowane niebieskie światło, co doprowadziło do pojawienia się żywych kryształów24. Morin i in. ustalili kontrolę toczących się koloidów Quinckego za pomocą przestrajalnego zewnętrznego pola elektrycznego, co spowodowało koloidalne flokowanie w kanale podobnym do toru wyścigowego25. Te wcześniejsze prace pokazują rolę sterowania lokalnego w zastosowaniach i rozwijają bazę wiedzy o materii aktywnej.

W tym artykule skupiamy się na sterowalności aktywnych płynów 3D opartych na kinezynie, opartych na mikrotubulach (MT). Płyny składają się z trzech głównych składników: MT, silników molekularnych kinezyny i zupleantów. Zubożenia indukują siłę zubożającą, która wiąże MT, które są później mostkowane przez klastry motoryczne. Silniki te chodzą wzdłuż MT w kierunku końca plusa. Gdy para zmostkowanych MTsów jest antyrównoległa, odpowiadające im silniki poruszają się w przeciwnych kierunkach. Jednak silniki są związane w klaster i nie są w stanie się rozdzielić, więc wspólnie rozsuwają pary MT (ślizganie międzywłókienkowe, Rysunek 1A). Ta dynamika ślizgu kumuluje się, powodując, że wiązki MTs, rozciągają się, aż osiągną punkt niestateczności wyboczeniowej i pękają (wiązki rozciągliwe, Rysunek 1B)26. Zerwane wiązki są wyżarzane przez siłę zubożającą, która następnie ponownie się wydłuża i dynamika się powtarza. Podczas procesu powtarzalnej dynamiki ruchy wiązki mieszają pobliską ciecz, indukując przepływy, które można zobrazować przez domieszkowanie znacznikami w skali mikronowej (Rysunek 1C). Sanchez i in. oraz Henkin i wsp. scharakteryzowali średnie prędkości znaczników, stwierdzając, że prędkości te były regulowane przez zmianę stężeń trifosforanu adenozyny (ATP), zubożeńców, klastrów motorycznych i MTs19,27. Jednak taka przestrajalność istniała tylko przed aktywną syntezą płynów. Po syntezie zdolność do przestrajania została utracona, a płyny samoorganizowały się na swój własny sposób. Aby kontrolować aktywną aktywność płynów po syntezie, Ross.et al. opisali metodę wykorzystującą aktywowaną światłem dimeryzację białek motorycznych, co pozwala na włączanie i wyłączanie aktywności płynu za pomocą light28. Podczas gdy kontrola światła jest wygodna pod względem lokalnej aktywacji płynów, metoda ta wymaga przeprojektowania struktur białek motorycznych, a także modyfikacji ścieżek optycznych w mikroskopie. W tym przypadku zapewniamy łatwą w użyciu metodę lokalnego kontrolowania przepływu płynów bez modyfikacji mikroskopu przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej struktury silnika.

Nasza metoda lokalnego dostrajania aktywnego przepływu płynu opiera się na prawie Arrheniusa, ponieważ reakcja kinezyna-MT wzrasta wraz z temperaturą29,30,31,32. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że zależność od temperatury średniej prędkości przepływu płynu aktywnego jest zgodna z równaniem Arrheniusa: v = A exp(-Ea/RT), gdzie A jest czynnikiem przedwykładniczym, R jest stałą gazową, Ea jest energią aktywacji, a T jest temperaturą systemu33. W związku z tym aktywność płynu jest wrażliwa na temperaturę otoczenia, a temperatura systemu musi być stała, aby ustabilizować wydajność silnika, a co za tym idzie, prędkość przepływu płynu34. W tym artykule pokazujemy, jak wykorzystać zależność temperatury silnika do ciągłego dostrajania prędkości przepływu płynów aktywnych poprzez regulację temperatury układu. Demonstrujemy również przygotowanie aktywnej próbki płynu, a następnie zamontowanie próbki na stoliku mikroskopowym, którego temperatura jest kontrolowana za pomocą oprogramowania komputerowego. Zwiększenie temperatury z 16 °C do 36 °C przyspiesza średnią prędkość przepływu z 4 do 8 μm/s. Dodatkowo możliwość przestrajania jest odwracalna: wielokrotne zwiększanie i zmniejszanie temperatury sekwencyjnie przyspiesza i zwalnia przepływ. Zademonstrowana metoda ma zastosowanie do szerokiego zakresu systemów, w których główne reakcje są zgodne z prawem Arrheniusa, takich jak test ślizgowy MT 29,30,31,32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie MT

UWAGA: W tym kroku oczyszczamy tubuliny z tkanki mózgowej bydła. Mózg bydlęcy może powodować wariant choroby Creutzfeldta-Jakoba (vCJD)35. W związku z tym odpady mózgowe i związane z nimi roztwory, butelki i końcówki do pipet powinny być zbierane w worku na bioodpady i utylizowane jako odpady niebezpieczne biologicznie zgodnie z przepisami instytucji.

  1. Oczyść tubuliny z mózgu bydlęcego (zmodyfikowane z Castoldi et al.36).
    1. Przetransportować około 1,5 kg świeżych mózgów bydlęcych z lokalnej rzeźni do chłodni uniwersyteckiej. Podczas transportu przechowuj mózgi w buforze fosforanowym (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,2) na lodzie.
      UWAGA: Aby zmaksymalizować ostateczną wydajność tubuliny, kluczowa jest początkowa ilość funkcjonalnej tubuliny w świeżej tkance mózgowej. Świeższe mózgi zawierają bardziej funkcjonalną tubulinę. Aby uzyskać najświeższe mózgi z rzeźni, zalecamy poproszenie rzeźnika o dostarczenie mózgów od ostatnio ubitych krów. Mózg nie powinien być starszy niż 3 godziny w momencie rozpoczęcia zabiegu, ponieważ skrócenie czasu między ubojem a rozpoczęciem procedury zapewni lepsze plony.
    2. Homogenizuj i klaruj mózgi.
      1. Oczyść mózg za pomocą skalpeli do przecięcia naczyń krwionośnych i tkanki łącznej na mniejsze kawałki i ręcznego usunięcia ich z mózgu.
        UWAGA: Oczyszczone mózgi powinny być różowe.
      2. Zanurz oczyszczoną tkankę mózgową w 1 l buforu depolimeryzacyjnego (DB: 50 mM kwasu 2-(N-morfolino) etanosulfonowego, 1 mM CaCl2, pH 6,6) na kilogram mózgu.
      3. Homogenizuj mózgi za pomocą blendera kuchennego.
      4. Odwirować homogenizowany roztwór mózgu w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 4 °C przez 150 minut.
    3. Polimeryzacja MT (pierwsza polimeryzacja).
      1. Zebrać i wymieszać supernatant z równymi objętościami następujących roztworów w temperaturze 37 °C: glicerol, wysokomolowy bufor PIPES (HMPB: 1 M RURY, 10 mM MgCl2, 20 mM glikol etylenowy-bis(β-aminoehyl eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas [EGTA], pH 6,9)
      2. Do mieszaniny dodać 1,5 mM ATP i 0,5 mM trifosforanu guanozyny (GTP).
      3. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    4. Depolimeryzacja MT (pierwsza depolimeryzacja MT).
      1. Granulat MT przez odwirowanie w temperaturze 151 000 x g i temperaturze 37 °C przez 30 min.
      2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą granulkę MT w 10 ml w temperaturze 4 °C DB.
      3. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
      4. Mieszaj mieszaninę co 5 minut za pomocą końcówki pipety, aby uniknąć sedymentacji MT.
        UWAGA: Mieszanina powinna stać się klarowna w ciągu 30 minut, co wskazuje na zakończenie depolimeryzacji MT.
    5. Polimeryzacja MT (druga polimeryzacja MT).
      1. Klarować roztwór, odwirowując w temperaturze 70 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      2. Zebrać i zmieszać supernatant z równymi objętościami glicerolu i HMPB o temperaturze 37 °C.
      3. Do mieszaniny dodać 1,5 mM ATP i 0,5 mM GTP.
      4. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    6. Powtórzyć krok 1.1.4, zastępując HMPB buforem do ponownego montażu Brinkleya (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8), a następnie sklarować oczyszczoną mieszaninę przez odwirowanie w temperaturze 79 000 x g i 4 °C przez 30 min.
    7. Zebrać supernatant. Zmierzyć absorbancję 280 nm za pomocą spektrometru. Określ stężenie tubuliny za pomocą prawa Beera-Lamberta (współczynnik ekstynkcji tubuliny: 1,15 (mg/mL)-1 cm-1)37,38.
    8. Przechowywać białko w temperaturze -80 °C.
  2. Recykling tubuliny (zmodyfikowane z Castoldi et al.36).
    UWAGA: Aby zwiększyć czystość tubuliny, oczyszczona tubulina jest ponownie polimeryzowana i depolimeryzowana.
    1. Polimeryzować MT przez zmieszanie oczyszczonej tubuliny (etap 1.1.7) z 500 μM ditiotreitolem (DTT) i 20 μM GTP, a następnie przez 30 minut inkubacji w temperaturze 37 °C.
    2. Granuluj MT.
      1. Załaduj 1 ml poduszki glicerolowej (80 mM RURKI, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerolu, pH 6,8) na dno probówki wirówkowej.
      2. Połóż spolimeryzowane MT na wierzchu poduszki.
      3. Wirować przy 172 000 x g przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Depolimeryzacja MT.
      1. Usunąć supernatant i poduszkę.
      2. Zawiesić każdą granulkę MT w 150 μl buforu MT o temperaturze 4 °C (M2B: 80 mM RURY, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8).
      3. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut.
      4. Mieszać mieszaninę końcówką pipety co 5 minut. Mieszanina powinna stać się klarowna.
    4. Klarować mieszaninę przez odwirowanie w temperaturze 172 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    5. Zebrać supernatant. Zmierz stężenie białka. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Oznacz tubulinę barwnikiem fluorescencyjnym39.
    1. Spolimeryzować MTs. Wymieszać oczyszczoną tubulinę (etap 1.1.7) z 500 μM DTT i 16,7 μM GTP i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Granuluj MT.
      1. Umieścić 1 ml poduszki o wysokim pH o temperaturze 37 °C (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerolu, pH 8,6) w probówce wirówkowej.
      2. Połóż spolimeryzowane MT na poduszce.
      3. Wirować przy 327 000 x g przez 50 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Oznacz tubulinę.
      1. Zawiesić każdą granulkę MT w 700 μl buforu do znakowania o temperaturze 37 °C (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 40% v/v glicerolu, pH 8,6).
      2. Wymieszać zawiesinę z 10–20 molowym nadmiarem farby fluorescencyjnej dalekiej czerwieni funkcjonalizowanej estrem sukcynimidylu.
      3. Mieszaninę inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności, aby umożliwić MT reakcję z estrem barwnika fluorescencyjnego.
      4. Zatrzymać reakcję znakowania, nasycając ester barwnika zawieszającego 50 mM K-glutaminianem, inkubując przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Osadzać oznaczone MTs: Powtórz krok 1.3.2, zastępując poduszkę o wysokim pH poduszką o niskim pH (rurki 80 mM, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6,8).
    5. Depolimeryzacja MT.
      1. Odrzucić supernatant i poduszkę.
      2. Zawiesić osad w 700 μl o temperaturze 4 °C M2B.
      3. Zawiesinę inkubować na lodzie.
      4. Mieszać co 5 minut końcówką pipety, aż roztwór będzie klarowny.
    6. Klarować oczyszczony roztwór przez odwirowanie w temperaturze 184 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 35 minut.
    7. Zwiększyć czystość znakowanego roztworu tubuliny, powtarzając kroki 1.2.1–1.2.4.
    8. Zmierz stężenie białek i barwnika fluorescencyjnego. Użyj tych pomiarów, aby określić stężenie tubuliny i frakcje znakowanej tubuliny, zdefiniowane jako stosunek stężeń barwnika fluorescencyjnego do tubuliny.
    9. Przechowywać oznakowany roztwór tubuliny w temperaturze -80 °C.
  4. Polimeryzuj MT (zaczerpnięte z Sanchez et al.19):
    1. Wymieszaj tubulinę z recyklingu (krok 1.2.5) z oznakowaną tubuliną (krok 1.3.9) w proporcji, która daje 3% znakowaną frakcję tubuliny.
    2. Mieszaninę tubuliny o stężeniu 8 mg/ml zmieszać z 1 mM DTT i 0,6 mM trifosforanu guanozyno-5'[(α,β)-metyleno]trifosforanu (GMPCPP), a następnie przez 30 minut inkubować w temperaturze 37 °C.
    3. Po inkubacji wyżarzać MT w temperaturze pokojowej w ciemności przez 6 godzin.
    4. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Synteza klastrów kinezynowych

UWAGA: Bakterie są wszechobecne i mogą rozwijać się w pożywce i zanieczyszczać proces przygotowania. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, czynności związane z kontaktem z kulturami komórkowymi (np. pipetowanie) MUSZĄ być wykonywane w pobliżu płomienia. Narzędzia takie jak kolby, pipety, końcówki do pipet, media i płytki MUSZĄ być autoklawowane przed użyciem.

  1. Ekspresowe silniki kinezynowe w Escherichia coli40.
    1. Przekształć komórki.
      1. Odpipetować 1 μl plazmidu K401-BCCP-H6 do 10 μl kompetentnych komórek.
      2. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
      3. Szok termiczny w temperaturze 42,5 °C przez 45 s.
      4. Inkubować komórki na lodzie przez 2 minuty, aby umożliwić regenerację.
      5. Wymieszaj komórki z 300 μl 2XYT bez antybiotyków (5 g/L NaCl, 10 g/L ekstraktu drożdżowego, 16 g/L tryptonu).
      6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1 h.
        UWAGA: O ile nie określono inaczej, monitorowanie wzrostu komórek nie jest wymagane podczas inkubacji.
    2. Zaszczepić podłoże płytkowe.
      1. Rozłóż hodowlę komórkową na płytce 2XYT (10 g/L NaCl, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L tryptonu, 15 g/L agaru, 100 μg/ml ampicyliny, 25 μg/ml chloramfenikolu).
      2. Inkubować płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Zaszczepić płynne podłoże.
      1. Z talerza na noc zbierz jedną izolowaną kolonię za pomocą końcówki pipety.
      2. Wysunąć końcówkę do kolby zawierającej 50 ml 2XYT.
      3. Inkubować i wstrząsać pożywką w temperaturze 37 °C i 200 obr./min przez 12–16 godzin.
    4. Rozwiń komórki.
      1. Wymieszaj 2,5 ml kultury komórkowej w 500 ml 2XYT.
      2. Inkubować i wstrząsać 500 ml kultury w temperaturze 37 °C i 250 obr./min przez 3–6 godzin.
    5. Indukuj ekspresję białka.
      1. Podczas inkubacji należy monitorować wzrost komórek, mierząc absorbancję przy 600 nm, używając 2XYT jako punktu odniesienia. Mierzyć absorbancję co 60 minut, aż osiągnie OD600 = 0,3. Następnie mierz absorbancję co 30 minut, aż osiągnie 0,5–0,6.
      2. Pozwól komórkom rosnąć, aż absorbancja osiągnie OD600 = 0,5–0,6
      3. Dodać 24 μg/ml biotyny i 1 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do hodowli komórkowej.
        UWAGA: IPTG stosuje się do indukowania ekspresji białek w silnikach kinezynowych, które są znakowane białkiem nośnikowym karboksylu biotyny (BCCP) i sześcioma histydynami (H6). Znacznik H6 jest używany w procesie oczyszczania (krok 2.2), podczas gdy BCCP wiąże się z dodanymi cząsteczkami biotyny w celu biotynylacji ekspresji silników kinezynowych.
      4. Inkubować i wstrząsać kulturą komórkową w temperaturze 20 °C i 250 obr./min przez 12–20 godzin.
    6. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant. Przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C.
  2. Oczyść białko motoryczne kinezyny (zmodyfikowane z Spriestersbach et al.41):
    1. Zawiesić osad komórkowy (krok 2.1.6) z równą objętością buforu do lizy (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 10 mM 2-merkaptoetanolu (βME), 20 mM imidazolu, pH 7,2), a następnie dodać jedną tabletkę inhibitora proteazy, 2 mg fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 2 mg lizozymu.
    2. Poddać komórki lizie przez błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie (LN) 3x i rozmrażanie mieszaniny komórek.
      UWAGA: Po lizie mieszanina powinna stać się lepka.
    3. Klarować mieszaninę komórek zlizowanych, odwirowując w temperaturze 230 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    4. Zebrać supernatant i przepuścić go przez kolumnę grawitacyjną, a następnie przemyć kolumnę 10 ml buforu do lizy.
      UWAGA: Białka ze znacznikiem H6, takie jak kinezyna K401-BCCP-H6, powinny pozostać w kolumnie.
    5. Eluować znakowane białko za pomocą 5 ml buforu elucyjnego (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 500 mM imidazolu, pH 7,2). Zebrać przepływ sekwencyjnie we frakcjach o pojemności 1 ml. Aby oznaczyć frakcje zawierające białko, należy zmieszać 3 μl każdej frakcji ze 100 μl barwnika trifenylometanowego. Frakcje zawierające białko powinny zmienić kolor na niebieski. Połącz te frakcje i rozcieńczyć 5x buforem do lizy.
    6. Stężyć roztwór białka.
      1. Załaduj roztwór do odśrodkowej rurki filtracyjnej.
      2. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      3. Delikatnie wstrząsnąć probówką i ponownie odwirować, aż objętość roztworu wyniesie <3 ml.
    7. Zmierz stężenie białka za pomocą spektrometru (współczynnik ekstynkcji: 0,549 (mg/mL)-1 cm-1)42,43. Rozcieńczyć białko do 1 mg/ml, dodając 35% w/v sacharozy.
    8. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Zmierz stężenie kinezyny za pomocą żelu do elektroforezy (zmodyfikowanego z Taylor et al.44).
    UWAGA: Do pomiaru stężenia kinezyny za pomocą żelu do elektroforezy, tubulina jest idealną drabiną stężeń ze względu na jej wysoką czystość i mierzalne stężenie za pomocą spektrometru (Rysunek 2A)36.
    1. Przygotować próbki tubuliny o stężeniach 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 i 1,25 mg/ml. Zmieszać 15 μl każdej próbki tubuliny i próbki kinezyny (etap 2.2.8) oddzielnie z 5 μl buforu próbki (200 mM Tris-HCl, 8% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 400 mM DTT, 0,2% błękitu bromofenolowego, 40% glicerolu, pH 6,8) i inkubować w temperaturze 90 °C przez 3 min.
    2. Przygotuj elektroforezę.
      1. Zablokuj żel do elektroforezy w pudełku z żelem.
      2. Napełnij pudełko buforem do biegania (50 mM MOPS, 50 mM zasada Tris, 0,1% SDS, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), pH 7,7).
        UWAGA: Upewnij się, że poziom bufora znajduje się powyżej górnego otworu żelu.
    3. Załaduj 10 μl standardowej drabinki białkowej, próbki tubuliny i próbkę kinezyny do oddzielnych studzienek i nałóż 200 V na żel przez 45 minut.
    4. Barwienie żelem.
      1. Inkubować i rozdrabniać żel w przegotowanym (około 95 °C) roztworze barwiącym A (0,5 g/l barwnika trifenylometanowego, 10% v/v kwasu octowego, 25% izopropanolu) przez 5 minut, a następnie płukać żel wodą dejonizowaną (DI).
      2. Powtórzyć kolejno z roztworami barwiącymi B (0,05 g/l barwnika trifenylometanowego, 10% v/v kwasu octowego, 10% izopropanolu), C (0,02 g/l barwnika trifenylometanowego, 10% v/v kwasu octowego) i D (10% v/v kwasu octowego). Inkubuj i kołysz żel w wodzie DI przez noc.
    5. Zeskanuj żel. Przekształć obraz żelu w obraz w skali szarości, a następnie dokonaj czarno-białej inwersji i poprawy kontrastu, aby odsłonić jasne pasma białkowe na czarnym tle.
    6. Zmierz jasność każdego pasma, sumując wartości pikseli. Zastosuj dopasowanie liniowe C = aB + b, gdzie B to jasność pasma tubuliny, C to odpowiednie stężenie, a a i b to parametry dopasowania. Określ stężenie kinezyny Ck, używając jasności pasma kinezyny Bk do obliczenia równania liniowego: Ck = aBk + b.
  4. Zgrupuj silniki kinezynowe.
    1. Zmieszaj 1,5 μM kinezyny (krok 2.2.8) ze 120 μM DTT i streptawidyną 120 nM. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
    2. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Przygotuj szkiełka i szkiełka nakryte pokryte poliakrylamidem (zmodyfikowane z Lau et al.45)

  1. Załaduj nowe szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe do odpowiednich pojemników. Zanurz szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe w 1% v/v detergentu w wodzie DI, a następnie zagotuj wodę w kuchence mikrofalowej.
  2. Sonikować szkiełka i szkiełka nakrywkowe przez 5 minut, a następnie spłukać wodą DI w celu usunięcia detergentu.
  3. Zanurz i poddaj sonikacji szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe w etanolu na 5 minut. Spłucz wodą DI.
  4. Zanurzyć i poddać sonikacji szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe w 100 mM wodorotlenku potasu (KOH) na 5 minut. Spłukać wodą DI.
  5. Szkiełka podstawowe i nakrywkowe inkubować w roztworze silanu (1% kwasu octowego i 0,5% metakrylanu 3-(trimetysylilo)propylu w etanolu) przez 15 minut, a następnie płukać wodą demineralizowaną.
  6. Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe inkubować w roztworze akrylamidu (2% m/w akrylamidu, 0,7 mg/ml nadsiarczanu amonu i 0,0035% v/v tetrametyloetylenodiaminy w wodzie demineralizowanej) przez ≥3 godziny.
  7. Szkiełka podstawowe i nakrywkowe należy przechowywać w roztworze akrylamidu.

4. Przygotuj aktywne płyny na bazie MT napędzane kinezyną

  1. Przygotuj aktywne płyny (zmodyfikowane z Sanchez et al.19).
    UWAGA: Poniższe kroki pokazują proces przygotowania 100 μl płynu aktywnego na przykładowych wywarach. Ostateczny wolumen jest skalowalny, a stężenia przykładowych zapasów można dostosowywać, o ile utrzymane jest końcowe stężenie każdego składnika.
    1. Wymieszaj 16,7 μl MT 8 mg/ml (krok 1.4.4) z 6,7 μl 1,8 μM kinezynowych klastrów motorycznych (krok 2.4.2) i 1,1 μl 500 mM DTT w wysokosolnym M2B (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Połącz MTs, dodając 11,4 μl 7% w/w glikolu polietylenowego (PEG).
    3. Aktywuj silniki kinezynowe, dodając 2,8 μl 50 mM ATP.
    4. Utrzymać stężenie ATP, dodając 2,8 μl podstawowej kinazy pirogronianowej/dehydrogenazy mleczanowej (PK/LDH) i 13,3 μl 200 mM pirogronianu fosfenolu (PEP).
    5. Zmniejsz efekt fotowybielania, dodając 10 μl 20 mM Trolox, 1,1 μl 3,5 mg/ml katalazy, 1,1 μl 20 mg/ml oksydazy glukozowej i 1,1 μl 300 mg/ml glukozy.
    6. Śledź ruch płynu, dodając 1,6 μl cząstek znacznikowych o stężeniu 0,025% v/v.
    7. Dodać M2B o wysokiej zawartości soli, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μL.
      UWAGA: Kolejność mieszania w krokach 4.1.1–4.1.6 jest wymienna. Jednak po zmieszaniu ATP, MT i silników silniki zaczynają zużywać ATP podczas przechodzenia wzdłuż MT. Próbka jest aktywowana o skończonym czasie życia ze względu na ograniczoną ilość paliw (ATP i PEP), dlatego eksperyment należy rozpocząć niezwłocznie. Końcowy płyn aktywny powinien zawierać 1,3 mg/ml MT, 120 nM kinezynowych klastrów motorycznych, 5,5 mM DTT, 0,8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/ml katalazy, 0,22 mg/ml oksydazy glukozowej, 3,3 mg/ml glukozy i 0,0004% v/v koloidu w wysokosolnym M2B.
  2. Przygotuj próbkę w kanale przepływowym (zmodyfikowanym z Chandrakar et al.46):
    1. Szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywane poliakrylamidem (krok 3.7) spłukać wodą demineralizowaną. Osusz okulary sprężonym powietrzem. Umieść na czystej, płaskiej powierzchni.
    2. Wytnij dwa paski folii woskowej o szerokości 3 mm i tej samej długości co szkiełko nakrywkowe (20 mm). Włóż paski między szkiełko nakrywkowe a szkiełko nakrywkowe jako przekładki kanału.
    3. Przyklej szkło do filmu woskowego, umieszczając kompleks szkło-wosk na płycie grzejnej o temperaturze 80 °C, aby stopić wosk. Podczas topienia delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe końcówką pipety, aby równomiernie przykleić film woskowy do powierzchni szkła. Po przyklejeniu schłodzić kompleks szklany do temperatury pokojowej.
    4. Załaduj płyny aktywne (krok 4.1) do kanału przepływowego. Uszczelnij kanał klejem UV.

5. Kontroluj temperaturę próbki

  1. Zbuduj konfigurację kontroli temperatury (zmodyfikowaną na podstawie projektów z Lowensohn et al. i Wu et al.47,48,49).
    1. Przygotuj aluminiowy blok chłodzący.
      1. Frezuj aluminiową płytę o wymiarach około 30 mm × 30 mm × 5 mm.
      2. Wywierć wewnętrzny kanał przez płytę (Rysunek 3A) i zainstaluj złączki węży na końcach kanału.
      3. Zaczep każdą złączkę do rurki wodnej.
      4. Podłącz jedną rurkę do pompy zbiornika rybnego w zbiorniku wodnym, jednocześnie przedłużając drugą rurkę do zbiornika.
        UWAGA: Pompa będzie cyrkulować wodę ze zbiornika przez aluminiowe kanały wewnętrzne, aby utrzymać temperaturę bloku na poziomie zbliżonym do temperatury pokojowej.
    2. Podłącz chłodnicę termoelektryczną (TEC) i czujnik termiczny do regulatora temperatury. Podłącz kontroler do komputera za pomocą portu USB (Rysunek 3B).
    3. Podłącz regulator temperatury do źródła prądu stałego (DC). Włącz kontroler, podłączając zasilacz do gniazdka elektrycznego.
    4. Wykonaj wstępną konfigurację TEC zgodnie z instrukcją producenta sterownika. Przetestuj wyjście TEC. Zaleca się sterowanie regulatorem temperatury za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta, umożliwiającego rejestrację danych z czujnika termicznego i łatwiejszą manipulację regulatorem temperatury.
    5. Zidentyfikuj strony grzewcze i chłodzące TEC.
    6. Przymocuj stronę chłodzącą TEC do bloku chłodzącego (krok 5.1.1) za pomocą pasty termicznej.
    7. Przymocuj szafirowy dysk do strony grzewczej TEC za pomocą pasty termicznej.
    8. Konfiguracja została zakończona. Szafirowa powierzchnia i czujnik temperatury mogą stykać się z próbką w celu schłodzenia i ogrzania próbki w oparciu o jej temperaturę i temperaturę docelową.
      UWAGA: Zaleca się, aby TEC i blok chłodzący miały wyrównany otwór centralny do obrazowania próbek za pomocą mikroskopii jasnego pola (Rysunek 3C).
  2. Użyj ustawień kontroli temperatury, aby kontrolować temperaturę próbki33.
    1. Zamontuj próbkę w konfiguracji.
      1. Umieścić próbkę płynu aktywnego (krok 4.2.4) na powierzchni szafiru tak, aby strona szkiełka stykała się z powierzchnią.
      2. Zabezpiecz szkiełko taśmą papierową.
      3. Przymocuj czujnik termiczny do powierzchni szkiełka nakrywkowego za pomocą taśmy miedzianej.
    2. Zamontuj zestaw na stoliku mikroskopowym stroną szkiełka nakrywkowego skierowaną w stronę obiektywów. Na przykład w mikroskopie odwróconym strona szkiełka nakrywkowego powinna być skierowana w dół. Zabezpiecz zestaw taśmą papierową i igłą stolika mikroskopu clamp, jeśli dotyczy.
      UWAGA: Przedstawiona temperatura stage powinna działać ze zwykłymi mikroskopami, które są odwrócone lub pionowe. Aby upewnić się, że stolik temperaturowy nie zostanie przesunięty podczas eksperymentu, najlepiej przymocować stolik temperatury do stolika mikroskopu za pomocą taśmy.
    3. Kontrolować temperaturę próbki.
      1. Włącz regulator temperatury i pompę do akwarium.
      2. Postępuj zgodnie z instrukcją producenta, aby ustawić temperaturę docelową i włączyć kontrolę temperatury. Regulator dostosuje moc grzewczą lub chłodniczą w oparciu o temperaturę docelową i temperaturę próbki, zgodnie z oceną czujnika termicznego.
    4. Zapisz temperaturę próbki.
      1. Postępuj zgodnie z przewodnikiem producenta, aby rejestrować dane temperatury czujnika termicznego podczas eksperymentu.
        UWAGA: Temperatura próbki powinna być teraz kontrolowana przez sterownik i rejestrowana przez komputer (Rysunek 3D).

6. Scharakteryzuj aktywną aktywność płynu (zmodyfikowana na podstawie metod Henkina i wsp. oraz Wu i wsp.20,27)

UWAGA: Poprzednie sekcje służą do przygotowania próbek płynów aktywnych (sekcje 1-4) i kontrolowania ich temperatury (sekcja 5). Aby zademonstrować wykorzystanie temperatury do kontrolowania aktywnej aktywności płynu, obserwuj zachowanie płynów, analizuj ich aktywność i charakteryzuj ich reakcję na temperaturę.

  1. Śledzenie monitorów.
    1. Zobrazuj próbkę ze stałym odstępem Δt za pomocą fluorescencji białka zielonej fluorescencji (GFP) w celu uchwycenia ruchu cząstek znacznikowych.
      UWAGA: Δt należy wybrać, aby umożliwić śledzenie ruchu znacznika. Duże wartości Δt, takie jak 100 s, powodują utratę trajektorii znacznika, podczas gdy krótkie wartości Δt, takie jak 0,1 s, uniemożliwiają algorytmowi śledzenia wykrycie ruchu znacznika między ramkami. Robocze Δt powinno pozwalać na przemieszczenie znacznika między klatkami w granicach ~9 pikseli. W przypadku znaczników obrazowych poruszających się z prędkością 10 μm/s przy użyciu obiektywu 4x, zaleca się, aby Δt wynosił 1–5 s.
    2. Zapisz obrazy jako pliki TIFF, nazwij je na podstawie numeru klatki i przechowuj je w osobnym folderze. Procesy te są niezbędne, aby zapewnić, że uzyskane obrazy zostaną poprawnie przeanalizowane za pomocą dostarczonego skryptu MATLAB (krok 6.2.2).
  2. Śledzenie śladów wykorzystujące oprogramowanie śledzące opracowane przez Ouellette et al.50,51):
    1. Pobierz oprogramowanie śledzące z Laboratorium Złożoności Środowiskowej Uniwersytetu Stanforda (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Upewnij się, że każdy plik MATLAB znajduje się w tym samym folderze.
    2. Śledzenie śledzenia za pomocą niestandardowego skryptu MATLAB: particle_tracking.m. Skrypt odczytuje obrazy śledzenia (krok 6.1) i śledzi ruch znacznika za pomocą oprogramowania Ouellette et al.50,51. Wyświetla dwa pliki: 1) background.tif, reprezentujący tło obrazu, oraz 2) Tracking.mat, zawierający trajektorie i prędkości cząstek w każdej klatce (Rysunek 4A).
  3. Analizuj średnie prędkości śledzenia przy użyciu niestandardowego skryptu MATLAB: analysis.m. Skrypt odczytuje plik śledzenia (Tracking.mat) i wyprowadza średnią prędkość znaczników w funkcji czasu, wraz z uśrednioną w czasie średnią prędkością z określonymi oknami uśredniania (Rysunek 4B)33.
  4. Zapisać średnią prędkość uśrednioną w czasie.
  5. Zmierz średnią prędkość uśrednioną w czasie, powtarzając eksperyment (kroki 4, 5.2 i 6.1–6.4) w temperaturze 10–40 °C. Użyj zarejestrowanych średnich prędkości, aby wykreślić średnią prędkość w funkcji temperatury (Rysunek 4C)33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie aktywnych płynów na bazie kinezyny wymaga zarówno kinezyny, jak i MT. MT polimeryzowano z oznakowanych tubuliny (kroki 1.3 i 1.4), które zostały oczyszczone z mózgów bydlęcych (krok 1.1, Rysunek 2A), a następnie poddano recyklingowi w celu zwiększenia czystości (krok 1.2, Rysunek 2B). Białka motoryczne kinezyny uległy ekspresji i oczyszczeniu z E. coli (kroki 2.1 i 2.2, Rysunek 2B)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrolowanie materii czynnej in situ otwiera drzwi do ukierunkowanej samoorganizacji materii aktywnej 4,5,24,28,54. W tym artykule przedstawiamy protokół wykorzystania temperatury do kontroli in situ płynów aktywnych na bazie kinezyny i MT, w oparciu o charakterystykę Arrheniusa układu 29,30,31.<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmid K401-BCCP-H6 był prezentem od Dr. Zvonimira Dogicia. Badania te były wspierane przez fundusz start-upowy dr Kun-Ta Wu w Worcester Polytechnic Institute. Dziękujemy dr Zvonimirowi Dogicowi za protokoły oczyszczania i znakowania tubuliny oraz syntezy aktywnych płynów. Jesteśmy wdzięczni dr Marcowi Ridilli za jego wiedzę w zakresie ekspresji i oczyszczania białek. Dziękujemy dr Williamowi Benjaminowi Rogerowi za pomoc w budowie sceny z kontrolowaną temperaturą. Uznajemy Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) do użytku w Zakładzie Materiałów Biologicznych (BMF). Wyrażamy uznanie dla Królewskiego Towarzystwa Chemicznego za adaptację danych z Bate et al. na temat Soft Matter33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowySigma-Aldrich238813Trolox
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
3-(trimetoksysililo)propylokrylan, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3,2mm I.D. Tygon Rurka R-3603HACH2074038Rurki wodne
średnicy 31,75 mm niepowlekane, Szafirowe oknoEdmund Optics43-637Szafirowy dysk
3M 1181 Taśma miedziana - 1/2 cala szerokości x 18 jardów Długość - 2,6 MIL Grubość całkowita - 27551RS HUGHES054007-27551Taśma miedziana
Kwas octowySigma-AldrichA6283
Roztwór akrylamidu (40%/elektroforeza), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Hydrat soli dipotasowej adenozyno-5'-trifosforanuSigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester sukcynimidylu)Thermo Fisher ScientificA20006Far-red barwnik fluorescencyjny. Alexa 647 może być wstępnie zawieszona w dimetylosulfotlenku (DMSO) przed zmieszaniem z mikrotubulami (1.3.3.2.)
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4Sigma-AldrichUFC801024Odśrodkowa rurka filtracyjna. Odgraniczna masa cząsteczkowa: 10 kDa
Nadsiarczan amonu, 100g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829Sól
sodowa ampicyliny APS (krystaliczny proszek), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Ampicillin
Stół antywibracyjnyNikon63-7590S
Avanti J-E WirówkaBeckman Coulter369001
Środek sprzedający agar Bacto, BD DiagnosticsVWR90000-760Biotyna agarowa
Alfa AesarA14207
Wiadro plastikowe białe - 2 galonyBon84-715Wiadro na wodę
Chlorek wapniaSigma-Aldrich746495CaCl2
Katalaza z wątroby bydlęcejSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x obiektyw powietrzny
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372Kostka filtra GFP
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5Chłodnica termoelektryczna (TEC)
Chloramfenikol, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
Blok chłodzącyN/AN/ANiestandardowo frezowane aluminium
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Barwnik trifenylometanowy
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG7528
Dimetylosulfotlenek (certyfikowany ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Ditiothreitol, 99%, do biochemii, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 PastatermicznaDow1446622
ALKOHOL ETYLOWY, 200 PROOF ACS / USP / NF GRADE 5 GALONÓW POLY CUBEPharmco firmy Greenfield Global111000200CB05Etanol
Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowySigma-AldrichE3889EGTA
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReagents Dodatki do podłoży mikrobiologicznych: TryptoneFisher ScientificBP1421Tryptone
Fisher BioReagents Dodatki do mediów mikrobiologicznych: Ekstrakt drożdżowyFisher ScientificBP1422Ekstrakt
drożdżowy Fluoresbrite YG Microspheres, klasa kalibracji 3.00 i mikro; mPolysciences18861Cząstki znacznikowe
Oksydaza glukozowa z Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GlicerolSigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanozyna-5'[ (&alfa;,β)-metyleno]trifosforan (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 stóp, 99,9% skręcona miedź beztlenowa OFC, czerwono-2-żyłowy przewód zaciskowy zasilający / głośnikowy do samochodu, audio, kina domowegoAmazonB07428NBCWDrut miedziany
Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozynySigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Detergent
HEPES Sól sodowa (biały proszek), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
Wysokowydajny blenderAIMORESAS-UP1250Blender
Jego GraviTrapGE Healthcare11003399Kolumna grawitacyjna
ImidazolSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd
Alkohol izopropylowy 99%Pharmco firmy Greenfield Global231000099Rotor Isopropanol
JA-10Beckman Coulter369687
Kwas L-glutaminowy jednowodny sól potasowaSigma-AldrichG1501K-glutaminian
Lizozym z białka jaja kurzegoSigma-AldrichL6876
Chlorek magnezu sześciowodnySigma-AldrichM2670MgCl2• 6H2O
Sól sodowa MESSigma-AldrichM5057Sól sodowa kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego
MOPSSigma-AldrichM1254Kwas 3-(N-Morfolino)propanosulfonowy
MP-3022TE TechnologyMP-3022Termopara
N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Spektrofotometr UV-VIS Nanodrop 2000c SpektrofotometrThermo Fisher ScientificE112352
Nikon Ti2-E Mikroskop odwrócony NikonMEA54000
Norland Klej optyczny 81Norland ProductsNOA81Klej UV
Novex Sharp Wstępnie barwione białko StandardThermo Fisher ScientificLC5800Standardowa drabina białkowa
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe, 1,5 mm, 10-dołkoweThermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS żel Optima
L-90K UltrawirówkaBeckman Coulter365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" szerokość; 125 ft/rolkaCole-ParmerEW-06720-40Folia woskowa
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide Control Zasilacz NikonPE-300-UT-L-SB-40Fajny oświetlacz LED Fluorek
fenylometanosulfonyluSigma-Aldrich78830PMSF
Sól monopotasowa kwasu fosfoenolopigronowego, 99%BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Zestaw do oznaczania białekThermo Fisher Scientific23200
Inhibitor proteazy Pierce Mini tabletkiThermo Fisher ScientificA32953
RURYSigma-AldrichP6757Kwas 1,4-piperazynodietanosulfonowy
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Poli(glikol etylenowy)Sigma-Aldrich81300PEG. Średnia masa cząsteczkowa 20 000 Da
Wodorotlenek potasu (granulki/certyfikowany ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W Zasilacz (115 VAC)ThermoFisher ScientificPS0300Zasilanie DC pudełka żelowego
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4AZasilanie DC regulatora temperatury
Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królikaSigma-AldrichP-0294PK/LDH
Cicha pompa fontannowa Lifegard, 296 galonów na godzinęAmazonB005JWA612Pompa do akwarium
Rosetta 2(DE3)pLysS Kompetentne komórki - NovagenMillipore Sigma71403Kompetentne komórki
Sharp Microwave ZSMC0912BS Kuchenka mikrofalowa Sharp 900 W, 0,9 stopy sześciennej, stal nierdzewnaAmazonkaB01MT6JZMRKuchenka mikrofalowa do gotowania wody
Chlorek sodu (krystaliczny / certyfikowany ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771SDS
Fosforan sodu jednozasadowySigma-AldrichS8282NaH2PO4
Białko streptawidynyThermo Fisher Scientific21122
SacharozaSigma-AldrichS7903
TC-720TE TechnologyTC-720Regulator temperatury
Tris Base, klasa biologii molekularnej - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Typ 45 Ti RotorBeckman Coulter339160
Typ 70 Ti RotorBeckman Coulter
Typ 70.1 Ti RotorBeckman Coulter342184
Uniwersalna taśma do etykietowania laboratoryjnego VWRVWR89097-916Taśmy papierowe
Okulary VWR Micro Cover Glass, kwadratowe, nr 1 1/2VWR48366-227Szkiełka nakrywkowe
VWR Plain i Frosted Micro Slides, PremiumVWR75799-268Szkiełka szklane
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001Pudełko żelowe
ZYLA 5.5 USB3.0 AparatNikonZYLA5.5-USB3Monochromatyczny aparat CCD
o do radiatorów 337922

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002(2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102(2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114(2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375(2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470(2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688(2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1(2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246(2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564(2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486(2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601(2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037(2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102(2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142(2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102(2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333(1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006(2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304(2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microtubule Based Active FluidsKinesin Driven Flow ControlTemperature Tuning MethodFlow Speed RegulationActive Fluid PreparationFluorescent Microscopy ImagingTracer Particle TrackingTemperature Control SetupMicrofluidic Device DesignArrhenius Characteristic Analysis

Related Articles