Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Summary

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Abstract

Bakterie wewnątrzkomórkowe wydzielają czynniki wirulencji zwane białkami efektorowymi do cytozolu gospodarza, które działają w celu obalenia białek gospodarza i/lub powiązanych z nimi szlaków biologicznych na korzyść bakterii. Identyfikacja przypuszczalnych bakteryjnych białek efektorowych stała się łatwiejsza do opanowania dzięki postępom w sekwencjonowaniu genomu bakteryjnego i pojawieniu się algorytmów, które umożliwiają identyfikację in silico genów kodujących kandydatów na wydzielanie i/lub domen eukariopodobnych. Jednak identyfikacja tych ważnych czynników wirulencji to dopiero pierwszy krok. Oczywiście celem jest określenie funkcji molekularnej białek efektorowych i wyjaśnienie, w jaki sposób oddziałują one z gospodarzem. W ostatnich latach techniki takie jak dwuhybrydowe badanie przesiewowe drożdży i immunoprecypitacja na dużą skalę w połączeniu ze spektrometrią mas pomogły w identyfikacji interakcji białko-białko. Chociaż identyfikacja partnera wiążącego gospodarza jest kluczowym pierwszym krokiem w kierunku wyjaśnienia funkcji molekularnej bakteryjnego białka efektorowego, czasami okazuje się, że białko gospodarza ma wiele funkcji biologicznych (np. aktyna, klatryna, tubulina) lub białko bakteryjne może nie wiązać fizycznie białek gospodarza, pozbawiając badacza kluczowych informacji na temat dokładnego szlaku gospodarza, którym manipuluje się. Zmodyfikowane badanie przesiewowe toksyczności drożdży w połączeniu z ekranem supresorowym zostało przystosowane do identyfikacji szlaków gospodarza, na które wpływają bakteryjne białka efektorowe. Badanie toksyczności opiera się na toksycznym działaniu drożdży spowodowanym przez białko efektorowe zakłócające szlaki biologiczne gospodarza, co często objawia się wadą wzrostu. Ekspresja biblioteki genomowej drożdży służy do identyfikacji czynników gospodarza, które hamują toksyczność bakteryjnego białka efektorowego, a tym samym do identyfikacji białek w szlaku, do którego dąży białko efektorowe. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące zarówno badań przesiewowych toksyczności, jak i supresorów. Techniki te można wykonać w dowolnym laboratorium zdolnym do klonowania molekularnego i hodowli drożdży i Escherichia coli.

Introduction

Pierwszy raport o procedurach podobnych do tych przedstawionych tutaj scharakteryzował efektor Legionella pneumophila typu IV SidD, deAMPylase, który modyfikuje Rab1¹. Porównywalne techniki wykorzystano do scharakteryzowania kilku efektorów L. pneumophila^1,2,3. Test został dostosowany do scharakteryzowania białka efektorowego Coxiella burnetii typu IV⁴, a ostatnio użyteczność tej techniki została rozszerzona do charakterystyki białek błonowych inkluzji Chlamydia trachomatis^5<....

Protocol

1. Przygotowanie pożywek i odczynników

UWAGA: Płytki powinny być przygotowane przed dniem testu i są dobre przez 1 miesiąc. Pożywki i odczynniki można przygotować w dowolnym momencie i są one ważne przez 1 miesiąc.

1. Przygotować 1 l roztworu glukozy (10% w/v), rozpuszczając 100 g D-(+)-glukozy w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Dostosuj objętość do 1 l za pomocą wody destylowanej. Przefiltrować przez sterylny filtr 0,2 μm do sterylnej butelki do przechowywania pożywek o pojemności 1 l.
2. Przygotować 1 l roztworu galaktozy (10% w/v), rozpuszczając 100 g D-(+)-galaktozy w 800 ml wody destylowanej w zl....

Results

Zanim będzie można przeprowadzić badanie przesiewowe supresora drożdży, interesujące nas białko efektorowe musi zostać przetestowane pod kątem toksyczności drożdży. Osiąga się to poprzez ekspresję interesującego białka w drożdżach pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą. Wzrost stężenia glukozy (warunki nieindukujące) powinien być najpierw porównany, aby upewnić się, że toksyczność jest specyficznie spowodowana ekspresją białka będącego przedmiotem zainteresowania i nie jest wadą ogólną. Jak pokazano na

Discussion

Protokół ten przedstawia procedury krok po kroku służące do identyfikacji szlaków biologicznych gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, przy użyciu zmodyfikowanego ekranu toksyczności drożdży i supresorów. Zastosowany szczep drożdży, S. cerevisiae W303, jest auksotroficzny zarówno dla uracylu, jak i leucyny. Auksotrofia uracylu szczepu jest stosowana do selekcji drożdży przenoszących białko będące przedmiotem zainteresowania na wektorze pYesNTA-Kan, podczas gdy auksotrofia leucyny jes.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galactose	MilliporeSigma	G0750-1KG
Zestaw do ekstrakcji żelu GeneJet Zestaw do oczyszczania	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR	ThermoFisher Scientific	K0701
Zestaw minipreparacyjny plazmidu GeneJet	Thermo	K0503
	Glikofilaria MilliporeSigma	G8270-1KG
Plemniki śledzia DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Octan litu dwuwodny	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptone	Fisher Scientific
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności	New England Biolabs	M0530
Poli(glikol etylenowy) 3350	MiliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
Ligaza DNA T4	New England Biolabs	M0202S
Tryptofan	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S Ekstrakt drożdżowy
	Fisher Scientific	BP1422-500
Zestaw do miniprzygotowania drożdży	Zymo	D2001
Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów	MilliporeSigma	Y0626-250G
Drożdże Syntetyczne pożywki drop-out Suplementy	MilliporeSigma	Y1501-20G	bez uracylu
Drożdże Syntetyczne Drop-out Podłoże Suplementy	MilliporeSigma	Y1771-20G	bez uracyl, leucyna, tryptofan