Method Article

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie wewnątrzkomórkowe wydzielają czynniki wirulencji zwane białkami efektorowymi do cytozolu gospodarza, które działają w celu obalenia białek gospodarza i/lub powiązanych z nimi szlaków biologicznych na korzyść bakterii. Identyfikacja przypuszczalnych bakteryjnych białek efektorowych stała się łatwiejsza do opanowania dzięki postępom w sekwencjonowaniu genomu bakteryjnego i pojawieniu się algorytmów, które umożliwiają identyfikację in silico genów kodujących kandydatów na wydzielanie i/lub domen eukariopodobnych. Jednak identyfikacja tych ważnych czynników wirulencji to dopiero pierwszy krok. Oczywiście celem jest określenie funkcji molekularnej białek efektorowych i wyjaśnienie, w jaki sposób oddziałują one z gospodarzem. W ostatnich latach techniki takie jak dwuhybrydowe badanie przesiewowe drożdży i immunoprecypitacja na dużą skalę w połączeniu ze spektrometrią mas pomogły w identyfikacji interakcji białko-białko. Chociaż identyfikacja partnera wiążącego gospodarza jest kluczowym pierwszym krokiem w kierunku wyjaśnienia funkcji molekularnej bakteryjnego białka efektorowego, czasami okazuje się, że białko gospodarza ma wiele funkcji biologicznych (np. aktyna, klatryna, tubulina) lub białko bakteryjne może nie wiązać fizycznie białek gospodarza, pozbawiając badacza kluczowych informacji na temat dokładnego szlaku gospodarza, którym manipuluje się. Zmodyfikowane badanie przesiewowe toksyczności drożdży w połączeniu z ekranem supresorowym zostało przystosowane do identyfikacji szlaków gospodarza, na które wpływają bakteryjne białka efektorowe. Badanie toksyczności opiera się na toksycznym działaniu drożdży spowodowanym przez białko efektorowe zakłócające szlaki biologiczne gospodarza, co często objawia się wadą wzrostu. Ekspresja biblioteki genomowej drożdży służy do identyfikacji czynników gospodarza, które hamują toksyczność bakteryjnego białka efektorowego, a tym samym do identyfikacji białek w szlaku, do którego dąży białko efektorowe. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące zarówno badań przesiewowych toksyczności, jak i supresorów. Techniki te można wykonać w dowolnym laboratorium zdolnym do klonowania molekularnego i hodowli drożdży i Escherichia coli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszy raport o procedurach podobnych do tych przedstawionych tutaj scharakteryzował efektor Legionella pneumophila typu IV SidD, deAMPylase, który modyfikuje Rab11. Porównywalne techniki wykorzystano do scharakteryzowania kilku efektorów L. pneumophila1,2,3. Test został dostosowany do scharakteryzowania białka efektorowego Coxiella burnetii typu IV4, a ostatnio użyteczność tej techniki została rozszerzona do charakterystyki białek błonowych inkluzji Chlamydia trachomatis5.

Ten protokół można podzielić na dwie główne części: 1) badanie toksyczności drożdży, w którym interesujące białko efektorowe bakterii jest wyrażane w drożdżach, a klony są badane pod kątem toksycznego fenotypu, co potwierdza wada wzrostu, oraz 2) badanie przesiewowe supresora drożdży, w którym toksyczny fenotyp jest tłumiony przez ekspresję biblioteki genomowej drożdży w toksycznym szczepie. Tak więc ekran toksyczności jest ekranem dla toksycznych fenotypów, które objawiają się jako defekty wzrostu, gdy efektor bakteryjny będący przedmiotem zainteresowania jest nadmiernie eksprymowany. Toksyczne klony, pomyślnie przekształcone z efektorem bakteryjnym i wykazujące ekspresję go, są wybierane i zapisywane do następnego kroku. Drugi ważny krok polega na nadekspresji częściowo strawionej biblioteki genomowej drożdży w toksycznym klonie drożdży. Plazmidy tworzące bibliotekę genomową drożdży sugerowaną do użycia w tym protokole zawierają inserty 5-20 kb, zwykle odpowiadające 3-13 otwartymi ramkami odczytu drożdży (ORF) o średniej wielkości genu ~ 1,5 kb we wszystkich plazmidach, reprezentujących cały genom drożdży pokryty około 10x. Ta część testu nazywana jest ekranem supresorowym, ponieważ celem jest stłumienie toksyczności bakteryjnego białka efektorowego. Potencjalne plazmidy supresorowe są izolowane od drożdży, sekwencjonowane i identyfikowane są tłumiące ORF. Uzasadnieniem leżącym u podstaw ekranu supresorowego jest to, że białko efektorowe wiąże, oddziałuje i/lub przytłacza składniki szlaku gospodarza, na który jest ukierunkowane, a dostarczenie tych białek gospodarza z powrotem w nadmiarze może uratować toksyczny wpływ na szlak, a tym samym wadę wzrostu. W związku z tym zidentyfikowane ORF, które hamują toksyczność, często reprezentują wielu uczestników szlaku gospodarza. Następnie przeprowadza się eksperymenty ortogonalne w celu sprawdzenia, czy efektor bakteryjny rzeczywiście oddziałuje z zaangażowanym szlakiem. Jest to szczególnie konieczne, jeśli zidentyfikowano czynnik wiążący, taki jak klatryna lub aktyna, ponieważ białka te biorą udział w wielu procesach gospodarza. Dalsze eksperymenty mogą następnie wyjaśnić fizjologiczną funkcję białka efektorowego podczas infekcji. Badania przesiewowe toksyczności i supresorów są również potężnymi narzędziami do rozszyfrowywania fizjologicznej funkcji bakteryjnych białek efektorowych, które nie wiążą fizycznie białek gospodarza z powinowactwem wystarczającym do wykrycia przez immunoprecypitację lub które oddziałują z gospodarzem w enzymatycznych interakcjach typu "uderz i uciekaj", które mogą nie zostać wykryte przez hybrydowe badanie przesiewowe drożdży i dwóch.

Chociaż ekran supresorowy może być skuteczną metodą ujawniania potencjalnych fizjologicznych interakcji między bakteryjnymi białkami efektorowymi a szlakami gospodarza, białko efektorowe bakteryjne musi wywołać defekt wzrostu drożdży, w przeciwnym razie użycie go w ekranie tłumiącym niewiele się zda. Co więcej, toksyczny fenotyp musi powodować deficyt wzrostu o co najmniej 2-3 log10, w przeciwnym razie trudno będzie zidentyfikować supresory. Jeśli laboratorium zostanie założone do hodowli komórkowej, badania przesiewowe białek efektorowych pod kątem toksyczności w popularnych liniach komórkowych, takich jak HeLa, często mogą dać wgląd w to, czy warto podjąć wysiłek, aby kontynuować badanie przesiewowe toksyczności drożdży. Ektopowa ekspresja białka efektorowego w komórkach HeLa czasami powoduje toksyczność, która bardzo silnie koreluje z toksycznością w szczepie drożdży używanym do tych ekranów4. Obserwowalne cechy stresu w komórkach HeLa obejmują utratę włókien stresowych, oderwanie komórek od płytki i kondensację jądrową wskazującą na apoptozę. Wszelkie wizualne oznaki stresu w komórkach HeLa sprawiają, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest dobrym kandydatem do wywołania defektu wzrostu u drożdży, które replikują się znacznie szybciej, a tym samym są bardziej wrażliwe na zakłócenia podstawowych szlaków.

Należy zauważyć, że ekran supresora nie zawsze identyfikuje partnerów wiążących gospodarza jako supresorów, ale nadal może implikować krytyczne składniki szlaku (szlaków) gospodarza, dając całościowy obraz procesów biologicznych przejmowanych przez bakteryjne białko efektorowe. Na pierwszy rzut oka wydaje się to sprzeczne z intuicją, ponieważ oczekiwanoby, że dostarczenie partnera wiążącego białka efektorowego w nadmiarze uratuje wadę wzrostu. W celu zidentyfikowania szlaków, na które ukierunkowane jest białko efektorowe CT229 (CpoS) C. trachomatis, które wiąże się z co najmniej 10 różnymi GTPazami Rab podczas infekcji5, żaden z partnerów wiążących Rab nie stłumił toksyczności CT229. Zidentyfikowano jednak liczne supresory biorące udział w transporcie pęcherzyków pokrytych klatryną (CCV), co doprowadziło do dalszych prac wykazujących, że CT229 specyficznie obala zależny od Rab transport CCV. Podobnie, podczas badania białka efektorowego C. burnetii Cbu0041 (CirA) zidentyfikowano kilka GTPaz Rho, które uratowały defekt wzrostu drożdży, a później stwierdzono, że CirA działa jako białko aktywujące GTPazę (GAP) dla RhoA4.

Nie można przecenić przydatności ekranu supresorów drożdży do wyjaśniania szlaków gospodarza atakowanych przez bakteryjne białka efektorowe, a inni badacze próbujący scharakteryzować wewnątrzkomórkowe bakteryjne białka efektorowe mogą znacznie skorzystać z tych technik. Testy te są przydatne, jeśli immunoprecypitacje i/lub badania przesiewowe hybrydowe drożdży nie wykazały znalezienia partnera wiążącego i mogą wyjaśnić, które szlaki są celem bakteryjnego białka efektorowego. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły badań przesiewowych toksyczności i supresorów w celu identyfikacji szlaków biologicznych gospodarza, do których ukierunkowane są wewnątrzkomórkowe białka efektorowe bakterii, a także niektóre z typowych przeszkód napotykanych podczas stosowania tych testów i odpowiadających im rozwiązań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek i odczynników

UWAGA: Płytki powinny być przygotowane przed dniem testu i są dobre przez 1 miesiąc. Pożywki i odczynniki można przygotować w dowolnym momencie i są one ważne przez 1 miesiąc.

  1. Przygotować 1 l roztworu glukozy (10% w/v), rozpuszczając 100 g D-(+)-glukozy w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Dostosuj objętość do 1 l za pomocą wody destylowanej. Przefiltrować przez sterylny filtr 0,2 μm do sterylnej butelki do przechowywania pożywek o pojemności 1 l.
  2. Przygotować 1 l roztworu galaktozy (10% w/v), rozpuszczając 100 g D-(+)-galaktozy w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 l. Dostosuj objętość do 1 ml za pomocą wody destylowanej i przefiltruj przez sterylny filtr 0,2 μm do sterylnej butelki do przechowywania pożywki o pojemności 1,000 ml.
  3. Przygotuj 1 l agaru z dekstrozą peptonową (YPD) z ekstraktem drożdżowym, rozpuszczając 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu, 20 g glukozy i 20 g agaru w 1,000 ml wody destylowanej. Autoklaw przez 20 minut i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C do ostygnięcia. Wlać do płytek o średnicy 100 mm, używając ~20 ml pożywki na płytkę.
  4. Przygotuj 1 l bulionu YPD, rozpuszczając 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu i 20 g glukozy w 1,000 ml wody destylowanej. Autoklaw przez 20 min.
  5. Przygotować syntetyczny agar glukozowy uracylowy (Ura-) syntetyczny dropout (SD). Na 1 l rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 1,9 g suplementu dropout bez uracylu i 15 g agaru w 800 ml wody destylowanej. Autoklaw przez 20 minut i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C do temperatury ~50−60 °C. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml lub sterylnego cylindra z miarką dodać 200 ml roztworu glukozy przygotowanego w kroku 1.1. Dobrze wymieszaj, delikatnie obracając lub umieść na talerzu do mieszania. Wlać do płytek o średnicy 100 mm, używając ~20 ml pożywki na płytkę.
  6. Przygotować syntetyczny agar uracylowy (Ura-) galaktozowy syntetyczny (SD). Na 1 l rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 1,9 g suplementu dropout bez uracylu i 15 g agaru w 800 ml wody destylowanej. Autoklaw przez 20 minut i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, aż temperatura osiągnie ~50−60 °C. Używając pipety serologicznej o pojemności 50 ml lub sterylnego cylindra z podziałką, dodaj 200 ml roztworu galaktozy przygotowanego w kroku 1.2. Dobrze wymieszaj, delikatnie obracając lub umieszczając na talerzu do mieszania. Wlać do płytek o średnicy 100 mm, używając ~20 ml pożywki na płytkę.
  7. Przygotować syntetyczny bulion glukozowy z uracylu (Ura-) syntetyczny dropout (SD). Na 1 l rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów i 1,9 g suplementu dropout bez uracylu w 800 ml wody destylowanej. Autoklaw przez 20 minut i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C do temperatury ~50−60 °C. Używając pipety serologicznej o pojemności 50 ml lub sterylnego cylindra z miarką, dodać 200 ml roztworu glukozy przygotowanego w kroku 1.1.
  8. Przygotować syntetyczny agar glukozowy z uracylem (Ura-) leucyną (Leu-) syntetycznym dropoutem (SD). Na 1 l rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów; 1,9 g suplementu dropout bez uracylu, leucyny i tryptofanu; 15 g agaru; i 0,076 g tryptofanu w 800 ml wody destylowanej. Autoklaw przez 20 minut i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C do temperatury ~50−60 °C. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml lub sterylnego cylindra z miarką dodać 200 ml roztworu glukozy przygotowanego w kroku 1.1. Wlać do płytek o średnicy 100 mm, używając ~20 ml pożywki na płytkę.
  9. Przygotować syntetyczny agar z agatozą uracylu (Ura-) leucyny (Leu-) galaktozy. Na 1 l rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów; 1,9 g suplementu dropout bez uracylu, leucyny i tryptofanu; 15 g agaru; i 0,076 g tryptofanu w 800 ml wody destylowanej. Autoklaw przez 20 minut i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, aż temperatura osiągnie ~50−60 °C. Używając pipety serologicznej o pojemności 50 ml lub sterylnego cylindra z podziałką, dodaj 200 ml roztworu galaktozy przygotowanego w kroku 1.2. Dobrze wymieszaj, delikatnie obracając lub umieszczając na talerzu do mieszania. Wlać do płytek o średnicy 100 mm, używając ~20 ml pożywki na płytkę.
  10. Przygotuj syntetyczny bulion glukozowy z uracylu (Ura-) i leucyny (Leu-). Na 1 l rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów; 1,9 g suplementu dropout bez uracylu, leucyny, tryptofanu; i 0,076 g tryptofanu w 800 ml wody destylowanej. Autoklaw przez 20 minut i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 56−60 °C, aż temperatura osiągnie ~50 °C. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml lub sterylnego cylindra z miarką dodać 200 ml roztworu glukozy przygotowanego w kroku 1.1.
  11. Przygotować roztwór glikolu polietylenowego (PEG). Dodaj 50% w/v glikolu polietylenowego 3350 do wody destylowanej. Sterylizuj w autoklawie.
  12. Przygotować 1 M octan litu (LiAc), rozpuszczając 10,2 g odwodnionego octanu litu w 200 ml wody destylowanej. Sterylizuj w autoklawie.
  13. Przygotuj DNA plemników śledzia. Rozcieńczyć 10 mg/ml DNA plemników śledzia do 2 mg/ml za pomocą wody destylowanej. Podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 5 minut i natychmiast umieścić na lodzie na 5 minut.

2. Klonowanie interesującego genu do plazmidu toksyczności drożdży pYesNTA-Kan

UWAGA: Obecnie istnieje wiele wektorów toksyczności drożdży dostępnych zarówno komercyjnie, jak i naukowo. Ekran supresorowy drożdży może być stosowany w połączeniu z wieloma z tych wektorów, pod warunkiem, że plazmid wyrażający interesujące nas białko efektorowe wykorzystuje selekcję dropout inną niż uracyl i marker antybiotykowy inny niż BlaR. W tej pracy wykorzystano zmodyfikowany wektor pYesNTA4,5, który zawiera kasetę oporności na kanamycynę dla łatwiejszego badania przesiewowego pod kątem potencjalnych tłumików. Schemat klonowania musi pozwalać na to, aby białko efektorowe znajdowało się w ramce z promotorem Gal i His-Tagiem. Białko błonowe inkluzji Chlamydia trachomatis CT229 wykorzystano jako dowód zasady dla tych testów.

  1. Użyj PCR do amplifikacji CT229 z genomowego DNA C. trachomatis zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu starterów CT229 +1 Kpn F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) i CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTACGACGGGATGCC). Stosować następujące warunki PCR: (1) 98 °C przez 30 s; (2) 98 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 2 min; (3) Powtórz krok 2, w sumie 25x; (4) 72 °C przez 10 min; i (5) 4 °C trzymać.
  2. Przeanalizuj 5 μl produktu PCR na 1% żelu agarozowym (Rysunek 1).
  3. Pozostałe 45 μl DNA należy oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Trawić 50 μl oczyszczonej wkładki PCR i pYesNTA-Kan (Ryc. 2) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przy użyciu KpnI-HF i XhoI-HF.
    UWAGA: W przypadku pYesNTA-Kan należy roztrawić 5 μg plazmidu przy użyciu 5 μl KpnI-HF, 5 μl XhoI-HF i 6 μl buforu w całkowitej objętości 60 μL. W przypadku insertu należy roztrawić całe 50 μl oczyszczonego produktu PCR, używając 2 μl KpnI-HF, 2 μl XhoI-HF i 6 μl buforu.
  5. Przeprowadź całe trawienie plazmidu na 1% żelu agarozowym. Przeprowadzić oczyszczanie strawionego plazmidu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Oczyść strawioną wkładkę do PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Sklonuj wstawkę do pYesNTA-Kan za pomocą 2 μl pYesNTA-Kan (krok 2.5), 2 μl buforu ligazy DNA, 1 μl ligazy T4 i 15 μl wkładki (krok 2.6). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  8. Dodać całą reakcję klonowania do 50 μl komórek kompetentnych dla E. coli i przeprowadzić reakcję przemiany.
  9. Całą reakcję przemiany należy umieścić na płytce LB zawierającej 100 μg/ml karbenicyliny.
  10. Zaszczepić 10 ml LB zawierającego 100 μg/ml karbenicyliny trzema indywidualnymi koloniami. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
  11. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu miniprep plazmidu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  12. Sekwencjonuj izolowane plazmidy za pomocą starterów specyficznych dla genu (krok 2.1).

3. Przetestuj interesujące białko pod kątem toksyczności drożdży

  1. Smugę Saccharomyces cerevisiae W303 na agarze YPD (krok 1.3) w celu uzyskania izolowanych kolonii. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.
  2. Zaszczepić 10 ml bulionu YPD (krok 1.4) pojedynczą kolonią z płytki agarowej (krok 3.1). Inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min przez noc.
  3. Dodać 0,5 ml nocnej kultury do 10 ml bulionu YPD (krok 1.4) i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min przez 4 godziny.
    1. Granulować 10 ml kultury w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Zawiesić osad w 1 ml sterylnej wody, przenieść do probówki mikrowirówki i osad o sile 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    3. Zawiesić osad w 1 ml 1 mM octanu litu (LiAc) i osadzać w temperaturze 3,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    4. Powtórz mycie LiAc 2x.
    5. Usuń pranie. Zawiesić granulat w 2,4 ml 50% PEG 3350. Dodaj 360 μl 1M LiAc, 500 μl 2 mg/ml DNA plemników śledzia i 400 μl sterylnej wody.
      UWAGA: Jest to wystarczające dla 20 transformacji.
    6. Dodać 180 μl mieszaniny transformacyjnej z kroku 3.3.5 do probówki mikrowirówki zawierającej 5 μl plazmidowego DNA pYesNTA-Kan CT229 (100−500 ng) z kroku 2.12.
    7. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
    8. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C przez 30 minut.
    9. Granulat o gramaturze 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    10. Usunąć mieszaninę transformacyjną za pomocą pipety. Zawiesić osad w 100 μl sterylnej wody. Umieść przemianę na agarze SD Ura z glukozą (krok 1.5).
    11. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
  4. Zaszczepić 5 ml bulionu SD Ura- zawierającego glukozę (krok 1.7) pojedynczą kolonią z płytki. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min. Uwzględnij drożdże przekształcone z samym wektorem jako kontrolę ujemną.
    1. Dodaj 180 μl sterylnej wody do 5 dołków na płytce 96-dołkowej (A2−A6).
    2. Zmieszaj kulturę przez noc, aby wymieszać.
    3. Dodać 180 μl drożdży do pierwszego dołka (A1). Seryjnie rozcieńczyć w stosunku 1:10 (w sumie sześć próbek, w tym nierozcieńczona).
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej naniec 5 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych SD Ura- glukoza (krok 1.5) i Ura-galaktoza (krok 1.6). Inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
  5. Ocenić toksyczność, porównując wzrost drożdży wyrażających białko efektorowe będące przedmiotem zainteresowania, wyhodowane na pożywce zawierającej galaktozę, ze wzrostem drożdży wykazujących ekspresję samego wektora.
  6. Potwierdź ekspresję białka fuzyjnego His-tag za pomocą Western blot.

4. Transformacja toksycznych drożdży za pomocą biblioteki genomu drożdży

  1. Zaszczepić 100 ml bulionu glukozowego SD Ura (krok 1.7) używając 1 ml bulionu z kroku 3.4. Inkubować przez 16−24 h w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min. Umieścić 900 ml bulionu glukozowego SD Ura w temperaturze 30 °C na noc, aby wstępnie podgrzać podłoże.
  2. Dodać całe 100 ml kultury posiewu na noc do podgrzanej kolby o pojemności 1 l. Inkubować przez 4-5 h w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
    1. Osadzać kulturę w temperaturze 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 250 ml sterylnej wody. Osadzać kulturę w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w 250 ml 1 mM LiAc. Osadzać kulturę w temperaturze 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usuń LiAc i ponownie zawieś granulat w 9,6 ml 50% PEG 3350. Dodać 1,44 ml 1M LiAc, 2 ml 2 mg/ml DNA plemników śledzia, 50 μg biblioteki genomowej pYep13 (ATCC 37323). Dostosuj objętość do 15 ml sterylną wodą. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.
    5. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
    6. Dodać 750 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu zwiększenia wydajności przemiany. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C przez 30 minut. Mieszaj przez delikatną inwersję co 10 minut.
    7. Drożdże osadzać w 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml jałowej wody. Granulat o gramaturze 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Zawiesić osad w 8 ml sterylnej wody.
    10. Aby określić wydajność przemiany, rozcieńczyć w stosunku 1:10 i nanieść 100 μl każdego rozcieńczenia na agarze z glukozą SD Ura-Leu-(krok 1.8).
    11. Umieścić 200 μl próbki na płytkach z agatorem SD Ura-Leu-galaktoza (krok 1.9). Użyj w sumie 50 talerzy.
    12. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 48−96 godzin lub do momentu pojawienia się kolonii.
      UWAGA: Kolonie zwykle pojawiają się na płytkach z agarem glukozowym po 48−72 godzinach, a na płytkach z agarem galaktozowym po 72−96 godzinach.
  3. Łat kolonie (potencjalne ratunki) na agarze SD Ura-Leu-galaktoza (krok 1.9) w celu ekspansji i wytworzenia zapasów. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24−48 godzin.
  4. Zaszczepić 5 ml bulionu SD Ura-Leu- glukozy (krok 1.10) za pomocą części plastra. Inkubować przez noc w temperaturze 26 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
    1. Dodaj 180 μl sterylnej wody do 5 dołków na płytce 96-dołkowej (A2−A6).
    2. Zmieszaj kulturę przez noc, aby wymieszać.
    3. Dodać 180 μl drożdży do pierwszego dołka (A1). Seryjnie rozcieńczyć w stosunku 1:10 (w sumie sześć próbek, w tym nierozcieńczona).
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 5 μl każdego rozcieńczenia na płytki agarowe z galaktozą SD Ura i galaktozą. Uwzględnij sam efektor toksyczny jako kontrolę.
    5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
  5. Porównaj wzrost drożdży wyrażających sam efektor toksyczny z drożdżami zawierającymi potencjalne supretory. Postępuj tylko z potencjalnymi supresorami, które mają zmniejszoną toksyczność w porównaniu z drożdżami wyrażającymi sam efektor.

5. Zidentyfikuj i potwierdź tłumiki

  1. Zaszczepić 5 ml bulionu glukozowego SD Ura-Leu-(krok 1.10) 100 μl drożdży z etapu 4.4 i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
    1. Drożdże osadzać na 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
    2. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu drożdżowego zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przekształć wyizolowany plazmid w kompetentne komórki E. coli i pokryj całą przemianę na agarze LB 100 μg/ml karbenicyliny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  3. Zaszczepić 10 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml karbenicyliny trzema koloniami z płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
    1. Kultury osadów w ilości 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu miniprep zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przekształć toksyczne drożdże z wyizolowanymi plazmidami z kroku 5.3.1, postępując zgodnie z krokami w części 3 protokołu.
    1. Zaszczepić 5 ml bulionu SD Ura-Leu-glukozy kolonią z płytki transformacyjnej. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
    2. Umieść na agarze Ura-Leu- glukoza i galaktoza, aby potwierdzić tłumienie toksyczności.
  5. Sekwencjonowanie przy użyciu starterów pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) i pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) w celu identyfikacji drożdżowych ORF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zanim będzie można przeprowadzić badanie przesiewowe supresora drożdży, interesujące nas białko efektorowe musi zostać przetestowane pod kątem toksyczności drożdży. Osiąga się to poprzez ekspresję interesującego białka w drożdżach pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą. Wzrost stężenia glukozy (warunki nieindukujące) powinien być najpierw porównany, aby upewnić się, że toksyczność jest specyficznie spowodowana ekspresją białka będącego przedmiotem zainteresowania i nie jest wadą ogólną. Jak pokazano na

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia procedury krok po kroku służące do identyfikacji szlaków biologicznych gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, przy użyciu zmodyfikowanego ekranu toksyczności drożdży i supresorów. Zastosowany szczep drożdży, S. cerevisiae W303, jest auksotroficzny zarówno dla uracylu, jak i leucyny. Auksotrofia uracylu szczepu jest stosowana do selekcji drożdży przenoszących białko będące przedmiotem zainteresowania na wektorze pYesNTA-Kan, podczas gdy auksotrofia leucyny jes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Shelby Andersen, Abby McCullough i Laurel Woods za pomoc w stosowaniu tych technik. Badanie to zostało sfinansowane ze środków start-upowych z Wydziału Mikrobiologii i Immunologii Uniwersytetu Iowa dla Mary M. Weber.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFisher ScientificBP2641500
GalactoseMilliporeSigmaG0750-1KG
Zestaw do ekstrakcji żelu GeneJet Zestaw do oczyszczaniaThermoFisher ScientificK0691
GeneJet PCRThermoFisher ScientificK0701
Zestaw minipreparacyjny plazmidu GeneJetThermoK0503
Glikofilaria MilliporeSigmaG8270-1KG
Plemniki śledzia DNAPromegaD1811
KpnI-HFNew England BiolabsR3142S
Octan litu dwuwodnyMilliporeSigmaL6883-250G
PeptoneFisher Scientific
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530
Poli(glikol etylenowy) 3350MiliporeSigma1546547-1G
pYep13ATCC37323
Ligaza DNA T4New England BiolabsM0202S
TryptofanMilliporeSigma470031-1G
XhoI-HFNew England BiolabsR0146S Ekstrakt drożdżowy
Fisher ScientificBP1422-500
Zestaw do miniprzygotowania drożdżyZymoD2001
Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasówMilliporeSigmaY0626-250G
Drożdże Syntetyczne pożywki drop-out SuplementyMilliporeSigmaY1501-20Gbez uracylu
Drożdże Syntetyczne Drop-out Podłoże SuplementyMilliporeSigmaY1771-20Gbez uracyl, leucyna, tryptofan

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119(1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070(1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21(2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989(2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Toxicity ScreenSuppressor ScreenBacterial Effector ProteinsHost Pathway IdentificationChlamydia trachomatisYeast Genomic LibraryPlasmid TransformationGrowth Defect AssaySerial DilutionDouble Drop out Agar

Related Articles