Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Summary

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Abstract

Elektrozwilżanie to efekt, dzięki któremu zmienia się kąt zwilżania kropli wystawionej na działanie ładunku powierzchniowego. Elektrozwilżanie na dielektryku (EWOD) wykorzystuje właściwości dielektryczne cienkich warstw izolatorów w celu zwiększenia gęstości ładunku, a tym samym wzmocnienia efektu elektrozwilżania. Obecność ładunków powoduje elektrycznie indukowane rozprzestrzenianie się kropli, co pozwala na celową manipulację na powierzchni hydrofobowej. W tym miejscu demonstrujemy oparty na EWOD protokół przetwarzania próbek i wykrywania czterech kategorii antygenów, przy użyciu zautomatyzowanej platformy aktywacji powierzchniowej, za pomocą dwóch wariantów metody testu immunoenzymatycznego (ELISA). Test ELISA jest wykonywany na kulkach magnetycznych z unieruchomionymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, które można wybrać tak, aby były ukierunkowane na określony antygen. Przeciwciało sprzężone z HRP wiąże się z antygenem i miesza się z_H2O2/Luminol w celu ilościowego określenia wychwyconych patogenów. Osiągnięto czas wykonania testu od 6 do 10 minut, przy użyciu niewielkich objętości odczynników.

Introduction

Proponowana metoda ma na celu ułatwienie automatycznego przygotowania próbki do testu ELISA z ilościowym wykrywaniem antygenów przy użyciu podejścia opartego na EWOD z cyfrowymi mikroprzepływami (DMF) i separacją magnetoforetyczną. Wykazano dla wielu zastosowań biologicznych, że DMF w połączeniu z magnetoforezą jest interesującą alternatywą dla zastosowań związanych z cieczami¹. Mówiąc dokładniej, wykrywanie patogenów jest ukrytym aspektem w wielu sektorach, począwszy od opieki zdrowotnej² po rolnictwo i środowisko^3,4 po bezpieczeństwo narodowe⁵. Technologia wykrywania zdolna do przeciwdziałania zagrożeniom ze strony patogenów musi charakteryzować się wysoką przepustowością (np. krótki czas testu), wydajnością (dolna granica wykrywalności – LoD – i wysoką czułością) oraz swoistością (w stosunku do docelowego typu patogenu), aby była funkcjonalna⁶.

Poprzednio, DMF oparty na EWOD został z powodzeniem zaimplementowany do reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), wykrywania patogenu opornego na antybiotyki (Staphylococcus aureaus oporny na metycylinę lub MRSA), M.pneumonia i C.albicans przy użyciu niskobudżetowego układu scalonego na płytce drukowanej i magnetoforezy⁷. Technika ta została również zastosowana do wykrywania mutacji kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) poprzez pirosekwencjonowanie i detekcję chemiluminescencyjną⁸. Platformy oparte na EWOD rozszerzają również swoją funkcjonalność o zastosowania w testach immunologicznych, umożliwiając w ten sposób jednoczesne odzyskiwanie i wykrywanie próbek w ramach jednej, zintegrowanej platformy. Na przykład, pojedynczy projekt chipa EWOD został pomyślnie zademonstrowany z platformą DMF do testów przyłóżkowych zarówno dla testów immunologicznych troponiny I serca opartych na kulkach z próbki krwi pełnej, jak i jako oddzielny eksperyment RT-PCR do wykrywania MRSA². Chip ten wykorzystuje wlew oleju, który zapobiega parowaniu kropel i ułatwia niezawodną automatyczną manipulację objętościami nanolitrów. Zbadano wszechstronne zastosowania biologiczne z zastosowaniem podobnych podejść DMF obejmujących ilościowe jednorodne i heterogeniczne testy immunologiczne^9,10, w tym projektowanie eksperymentów (DoE) w celu optymalizacji parametrów testu¹¹.

Pomimo oczywistych zalet intensyfikacji procesów ze względu na niewielkie objętości robocze, platforma DMF wypełniona olejem może być wyzwaniem i wymaga pewnego poziomu wiedzy specjalistycznej do obsługi. Systemy wypełnione olejem, ponieważ wymagają uszczelnionego komponentu, nie są idealne do niektórych zastosowań w terenie, w których ważna jest przenośność systemu. Ponadto system oparty na oleju byłby bardzo trudny, jeśli nie niemożliwy, do wykorzystania w niektórych konkretnych zastosowaniach wykorzystujących zbieranie suchego materiału na powierzchni, takich jak proponowane przez Zhao i Cho¹², Jönsson-Niedziółka et al.¹³ oraz Foat et al.¹⁴. W przeciwieństwie do tego, systemy bezolejowe są łatwe do zintegrowania i mają tę zaletę, że zapewniają łatwą translację próbki chip-do-chip. Z tych powodów proponowana metoda została opracowana, aby zapewnić test immunologiczny oparty na EWOD na DMF, który nie wymagałby oleju, skutecznie upraszczając obsługę urządzenia.

W tym wpisie informujemy o użyciu specjalnie zaprojektowanej, niezależnej, w pełni zautomatyzowanej platformy DMF do testów immunologicznych i omawiamy protokół szybkiego wykrywania biomolekuł, a mianowicie: białek, bakterii wegetatywnych, zarodników bakterii i wirusów. Połączenie chipa EWOD z cząstkami magnetycznymi do automatycznego przygotowania próbki i immunoprecypitacji zostało już zademonstrowane za pomocą dodatkowego pomiaru MS off-line¹⁵. Ostatnio diagnostyka terenowa przeciwko odrze i różyczce IgG została zademonstrowana w odległej populacji północno-zachodniej Kenii przez grupę Wheelera¹⁶. Zarówno system Wheeler, jak i nasz, będąc przenośnym, samowystarczalnym, w pełni zautomatyzowanym z dołączonymi pomiarami chemiluminescencyjnymi w czasie rzeczywistym, są prawdopodobnie jednymi z najbardziej zaawansowanych dostępnych systemów biodetekcji DMF.

Oba systemy zostały zaprojektowane z myślą o bardzo różnych zastosowaniach. System Wheelera jest ukierunkowany na biomarkery, aby umożliwić diagnostykę biomedyczną pacjentów, podczas gdy nasz system biodetekcji jest zbudowany w oparciu o wymóg obrony w celu bezpośredniego wykrywania patogenu pobranego wcześniej z powietrza. Podobieństwo między nimi wynika z podstawowej zasady uruchamiania kropel, która pokazuje szeroki zakres sektorów wpływających na życie, na które może wpływać technologia oparta na EWOD. Mianowicie, platforma wykrywania oparta na DMF i związany z nią system EWOD mogą znaleźć kluczowe implikacje w dziedzinie zdrowia (diagnostyka biomedyczna); ochrona wojskowa i cywilna (wykrywanie zagrożeń); Agrotechnika (monitoring upraw) i bezpieczeństwo pracy (monitorowanie kontrolowanego środowiska)

Wydajność naszej platformy DMF jest oceniana pod kątem w pełni automatycznego wykrywania albuminy ludzkiej surowicy (HSA, białko globularne), Escherichia coli (E. coli, bakteria wegetatywna), Bacillus atrophaeus (BG, zarodnik bakterii) i MS2 (wirus bakteriofagowy). Co ważniejsze, proponowana metoda DMF jest niezwykle wszechstronna w tym sensie, że przeciwciała wychwytujące mogą być wymieniane w celu wykrycia innych antygenów innych niż cztery, które są rozważane w tym artykule. Całkowicie rezygnując z wykrywania opartego na przeciwciałach, platforma DMF może stać się potencjalnym zastosowaniem opartym na biodetekcji aptamerowej, w której kulki magnetyczne przenoszą określone aptamery do wychwytywania i/lub wykrywania nukleotydów. Projekt i realizacja różnych komponentów składających się na zintegrowaną, całkowicie samodzielną platformę DMF, w tym generatora przebiegów wysokiego napięcia i elektroniki napędowej, jest ujawniony w innym miejscu⁶.

Protocol

1. Wstępne kroki niezbędne do przeprowadzenia testu

UWAGA (WAŻNE): Wszystkie wstępne kroki muszą być przeprowadzone w sterylnym środowisku, aby uniknąć zanieczyszczeń. Azydek sodu nie powinien być stosowany do przechowywania, ponieważ hamowałby on aktywność enzymu peroksydazy chrzanowej (HRP).

1. Przygotować bufor do pracy (100 mM HEPES, pH 7,5), używając kwasu (4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego, i dodać Tween 80 do stężenia 0,01% (v/v).
2. Unieruchomić przeciwciała pierwszorzędowe (przeciwciała wychwytujące) na powierzchni mikrokulek magnetycznych aktywowanych przez NHS, postępując zgodnie z protokołem dostarczonym przez dostawcę. Krótko mówiąc, protokół Magnetic IP/Co-IP Kit (tabela materiałów) obejmuje następujące kroki.
   1. Podaniec 0,2 ml granulek (2 mg) do plastikowej probówki i usunąć supernatant.
   2. Umyj kulki, dodając 1 ml lodowatego 1 ml lodowatego 1 mM HCl.
   3. Zwiąż wybrane przeciwciało (albuminę surowicy ludzkiej [15C7], poliklonalną anty-BG Rb, poliklonalną anty-E.coli MRE 162 lub poliklonalną anty-MS2 przeciw MS2 kozy), 40 μg/ml w 67 mM buforze boranowym, kowalencyjnie z kulkami przez 1 godzinę z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C. Tabela 1 zawiera listę wszystkich przeciwciał stosowanych w obecnym protokole i patogenach antygenowych⁶.
   4. Przemyć niezwiązane przeciwciała dwukrotnie 0,8 ml buforu elucyjnego.
   5. Ugasić reakcję 1 ml buforu hartowniczego przez 1 godzinę.
   6. Przemyj kulki raz zmodyfikowanym buforem boranowym i raz buforem IP Lysis/Washer.
   7. Ponownie zawiesić kulki w 0,5 ml buforu do lizy/płukania IP i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą potrzebne do użycia.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, nowa partia mikrogranulek jest sprzęgana z przeciwciałami na dzień przed izolacją EWOD i testem ELISA na chipie. Jednak mikrogranulki sprzężone z przeciwciałem pierwszorzędowym mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. W przypadku wystąpienia aglomeracji należy stuknąć w fiolkę, aby rozbić osad i ponownie zawiesić kulki w roztworze.
   8. Zablokuj mikrogranulki sprzężonym przeciwciałem przez noc, stosując końcowe stężenie 4 mg / ml dla mikrogranulek, w kazeinie blokującej (1% w/v) w 100 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
      UWAGA: Etap blokowania jest zawsze przeprowadzany dzień przed przebiegiem testu biodetekcji.
   9. Oddziel kulki od kazeiny blokującej za pomocą magnesu i usuń supernatant.
   10. Zawiesić w 1 ml bieżącego buforu i mieszać przez 1 minutę.
   11. Oddziel koraliki za pomocą magnesu i usuń supernatant.
   12. Powtórzyć powyższe kroki mycia (1.2.10 i 1.2.11) dwukrotnie.
       UWAGA: Wystarczą trzy etapy mycia, aby zmniejszyć przyleganie kulek do powierzchni i ułatwić swobodne przemieszczanie się kropli.
   13. Zawiesić kulki w buforze bieżącym w stężeniu 2,5 mg/ml. To rozwiązanie mikrogranulek jest gotowe do użycia z chipem EWOD.
3. Przygotować roztwór peroksydazy chrzanowej sprzężonej z neutrawidyną (HRP) i drugorzędowego przeciwciała biotynylowanego do końcowego stężenia dla każdego z 1 μg/ml w buforze biegowym (używanym do wykrywania BG⁶).
   UWAGA: Aby celować w antygeny (Tabela 1), z powodzeniem przetestowano różne stężenia drugorzędowego przeciwciała biotynylowego, w zakresie od 0,5 do 4,0 μg/ml.
4. Zmieszać równe objętości luminolu z roztworem nadtlenku wodoru tuż przed przeprowadzeniem testu
   UWAGA: Luminol służy do ilościowego określania liczby zdarzeń wiązania w oparciu o enzym HRP, który jest kowalencyjnie związany z przeciwciałem drugorzędowym, które jest skierowane przeciwko antygenowi (np. patogenowi). Jednak do wykrywania można użyć różnych cząsteczek raportujących i strategii¹⁷ zamiast chemiluminescencji i Luminolu.

2. Produkcja i obróbka powierzchni komponentów chipa EWOD

UWAGA: Układ EWOD składa się z płytki uruchamiającej z wzorzystymi elektrodami chromowymi do zmiany pozornego kąta zwilżania kropli oraz płytki pokrywowej do określania wysokości kropel.

1. Narysuj projekt elektrod i złączy w 2D za pomocą standardowego oprogramowania CAD. Dołącz również pojemnik na odpady o wymiarach 5 x 5 mm² do przechowywania zużytych rozpuszczalników (Rysunek 1).
   UWAGA: Do manipulowania kropelkami używamy 47 elektrod, każda o wymiarach 1,7 x 1,7 mm². Ten rozmiar elektrody może pomieścić objętości kropel w zakresie od 1,5 μl do 3 μl (dla odstępu 500 μm). Z doświadczenia wynika, że podczas pracy ze szczeliną 500 μm minimalna wielkość kropli, którą można uruchomić, wynosi 1,5 μl. Odpowiada on w przybliżeniu konturowi kropli (rzutowanemu) opisanemu na kwadratowej podkładce. Nie ma jednak teoretycznego ograniczenia wielkości innego niż spowodowane oporem (tarciem) ciała płynu. Niemniej jednak zaleca się, aby objętość nie przekraczała 3 μl, aby zapewnić niezawodne uruchamianie przy użyciu szczeliny 500 μm. Elektrody są adresowane przez 48-kanałową elektronikę.
   UWAGA: Wymiary konstrukcyjne i rozmiary elektrod mogą się różnić w zależności od zamierzonych objętości i operacji jednostki laboratoryjnej (LUO), które składają się na protokół.
2. Wyślij rysunek projektowy do firmy produkującej maski w celu wydrukowania maski chromowej na szklanym podłożu. Grubość warstwy chromu wynosi 100 nm.
   UWAGA: Warstwa chromu na fotomasce używanej jako podłoże dla chipa EWOD jest z definicji nieprzezroczysta. Konstrukcja każdej z naszych elektrod obejmuje układ siatki, aby zapewnić półprzezroczystość.
3. Przytnij płytę do rozmiaru 56 x 56 mm² za pomocą precyzyjnej piły CNC do krojenia w kostkę/cięcia.
4. Przyklej taśmę maskującą na styki elektryczne, aby je odizolować podczas dwóch etapów powlekania.
5. Pokryj płytkę ze szkła chromowego warstwą dielektryczną, osadzając na jej powierzchni 6 μm Parylenu-C. Metoda Gorhama¹⁸ jest używana z 7,4 g DPX-C w systemie osadzania parylenu (Tabela materiałów).
6. Przędzić amorficzne fluoropolimery (tabela materiałów) za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 1500 obr./min przez 30 s na wierzchu płyty i piec w temperaturze 140 °C przez 30 min.
   UWAGA: Powoduje to, że powierzchnia jest hydrofobowa. Można sprawdzić, czy powłoka została pomyślnie osadzona, umieszczając kroplę wody na powierzchni. Kąt zwilżania kropli i płytki musi wynosić około 110º.
7. Usuń taśmę maskującą ze styków elektrycznych.
8. Powlekaj amorficzne fluoropolimery (tabela materiałów) za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 1500 obr./min przez 30 s na wierzchu 4-calowej płytki krzemowej i wypalaj ją w temperaturze 140 °C przez 30 min.
   UWAGA: Ważne jest, aby zarówno powierzchnia płyty uruchamiającej, jak i pokrywy były hydrofobowe, aby ułatwić płynny ruch dyskretnych kropel podczas testu.

3. Ładowanie, montaż i eksploatacja układu EWOD na platformie DMF

UWAGA: Układ EWOD działa w konfiguracji równoległej z precyzyjnie zdefiniowaną szczeliną 0,5 mm między płytką uruchamiającą a przewodzącą, uziemioną płytą pokrywy. Ten zespół warstwowy jest opisany w bieżącym rozdziale.

1. Zdejmij pokrywę z platformy DMF⁶ i umieść ją na ławce.
   UWAGA: Ciemna komora klatki Faradaya jest niezbędna, aby zapobiec rozproszonemu światłu i zakłóceniom elektromagnetycznym podczas wykrywania. Na pokrywie nie ma blokady, dzięki czemu platforma pozwala nam obserwować ruch kropel.
2. Umieść czystą płytkę uruchamiającą na obracającym się stage, chromem skierowanym do góry. Płytka musi być wyrównana z lewym górnym rogiem stolika wpuszczanego (Rysunek 2A).
3. Zacisnąć płytkę uruchamiającą od góry za pomocą panelu z 47 kołkami stykowymi. To zabezpiecza płytkę na miejscu i ułatwia wyrównanie z kołkami stykowymi.
4. Ułożyć podkładkę o średnicy 0,5 mm i separator z polimetakrylanu metylu (PMMA) o średnicy 2 mm na stoliku obrotowym, aby zapewnić kontrolowaną szczelinę między elementem uruchamiającym a płytami pokrywy.
   UWAGA: Opcjonalnie papier odprowadzający wilgoć można umieścić na podkładce do usuwania odpadów przed podzielonym kropelkami przed następnym krokiem. W miarę postępu testu odpady są bezpośrednio wchłaniane do papieru, który można usunąć po zakończeniu testu.
5. Załaduj kropelki na proponowane podkładki ładujące (Rysunek 1).
   1. Podwielokrotnić cztery krople o pojemności 2,5 μl z buforu biegnącego na elektrodki oznaczone w B, A, R, E, po jednej kropli na każdą elektrodę.
   2. Podwielokrotność 2,5 μl roztworu Luminolu:H₂O₂ (1:1, v/v) na podkładkę oznaczoną D.
   3. Podwielokrotność 2,5 μl neutrawidyny sprzężonej z HRP (1 μg/ml) na podkładce oznaczonej F.
   4. Podwielokrotność 2,5 μl biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego (1 μg/ml) na podkładkę oznaczoną G.
   5. Podwielokrotność 2,5 μl mikrogranulek ze sprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym (2,5 mg/ml) trafia na podkładkę oznaczoną symbolem I.
   6. Podwielokrotność 2,5 μl nieznanej próbki na oznaczoną C pad.
      UWAGA: Proponowany wzorzec ładowania jest tylko jednym z przykładów układu eksperymentalnego, jednak wzorzec ładowania może być zmieniany w celu dopasowania do potrzeb użytkowników, o ile zmiany te są zgodne z sekwencją zdefiniowaną w oprogramowaniu (Plik uzupełniający 1).
6. Umieść pokrywę na powierzchni zestawu, poza okrągłym wgłębieniem, i wsuń ją bocznie do wgłębienia i na górze płyty uruchamiającej (Rysunek 2B).
7. Umieść magnes trwały na górze pokrywy i zabezpiecz go, przesuwając dwa zatrzaski (Rysunek 2C).
8. Obróć stolik o 180° i sprawdź wzrokowo, czy załadowane kropelki są nadal na swoim miejscu (Rysunek 1C).
   UWAGA: Powinno być w stanie dostrzec położenie i kształt kropel przez przezroczysty stolik i tylną część płytki uruchamiającej (Rysunek 2D). Test jest gotowy do uruchomienia, jeśli na wierzchu elektrod ładujących można zobaczyć okrągłe kropelki. W przypadku przemieszczenia kropli można usunąć magnes i pokrywę, a następnie odzyskać przemieszczoną kroplę za pomocą czystej pipety i ponownie umieścić ją na podkładce ładującej.
9. Sprawdź, czy pozycja ładowania dla każdej kropli jest zgodna z zaprogramowaną sekwencją uruchamiania w oprogramowaniu (szczegółowe informacje na temat oprogramowania znajdują się w pliku uzupełniającym 1).
   UWAGA: Aby móc wizualnie sprawdzić położenie kropel, fotodetektor musi zostać zdemontowany (Rysunek 2D).
10. Umieść ekranowany fotodetektor "puszkę" w szczelinie obracającego się stolika.
    UWAGA: System fotodetekcji obraca się wokół fotodiody, która ma duży obszar zbierania (10 x 10 mm²), aby zmaksymalizować zbieranie światła bez dodatkowej optyki, oraz wzmacniacz transimpedancji, aby zminimalizować szumy⁶. Jednak system jest niezwykle czuły i może zbierać minutowe sygnały. Aby zmniejszyć poziom hałasu, wdrożono szereg strategii opartych na elektronice (np. system fotodetekcji został zabezpieczony poprzez umieszczenie go w klatce Faradaya, metalowej obudowie zwanej ekranowaną "puszką").
11. Podłącz do fotodetektora z ekranem "can".
    UWAGA: Po wyrównaniu układu EWOD z fotodetektorem, platforma DMF jest całkowicie zmontowana i jest teraz gotowa do pracy.
12. Umieść pokrywę na platformie DMF i rozpocznij sekwencję programu za pomocą interfejsu oprogramowania opracowanego na Uniwersytecie w Hertfordshire.
    UWAGA: Dodatkowe oprogramowanie służy do odczytu i zapisu luminescencji z kropli w funkcji czasu w pliku CSV (patrz Plik uzupełniający 2).
    1. Upewnij się, że na interfejsie pojawią się komunikaty informacyjne zaprogramowanej sekwencji (patrz Plik uzupełniający 1) informujące operatora, że "Kropla luminolu jest gotowa do zebrania wyekstrahowanych kulek magnetycznych" lub "Kropla wykrywania jest gotowa do przeniesienia do miejsca detekcji". W obu przypadkach wymagane jest potwierdzenie od operatora, aby kontynuować sekwencję.

4. Praca w trybie wizualnym (opcjonalnie do optymalizacji protokołów)

UWAGA: Jeśli jest to pożądane, aby zobrazować każdą operację opartą na kropelkach, test można przeprowadzić pomijając kroki 3.10-3.12 i zastępując je następującymi operacjami.

1. Uruchom sekwencję programu za pomocą interfejsu oprogramowania.
   UWAGA: Ruch kropli można zaobserwować podczas pracy w trybie wizualnym, co jest przydatne podczas optymalizacji protokołu. Po pierwsze, aby sprawdzić powtarzalność operacji separacji magnetycznej. Na przykład, jeśli ilość użytych kulek jest zbyt niska, separacja magnetyczna nie nastąpi, odwrotnie, jeśli ilość kulek jest zbyt duża, kropla może zostać unieruchomiona przez granulkę kulki. Po drugie, aby upewnić się co do wiarygodności nowego testu, ponieważ niektóre preparaty kropelkowe mogą powodować upośledzenie uruchamiania, które można wykryć za pomocą obserwacji.
2. Zamontuj fotodetektor z ekranowaną "puszką" w szczelinie obracającego się stolika, gdy zostaniesz o to poproszony.
3. Podłącz do fotodetektora ekranowanego "puszka", wkładając piny w gniazdko.
4. Umieść pokrywę na platformie DMF i wznów test.
   UWAGA: Użyj dodatkowego oprogramowania do odczytu i zapisu luminescencji z kropli w funkcji czasu w pliku CSV (patrz Plik uzupełniający 2)

5. Usuwanie odpadów płynnych i czyszczenie chipa

UWAGA: Upewnij się, że sprzęt jest wyłączony i odłączony od źródeł zasilania (komputer, główny) przed czyszczeniem. Podczas wyjmowania próbek biologicznych z chipa należy nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne ze szkła ochronnego (PPE)!

1. Aby uzyskać dostęp do elektrod i zużytych rozpuszczalników na płycie uruchamiającej, otwórz pokrywę platformy DMF i obróć stolik o 180°.
2. Odkręć obudowę magnesu, wyjmij magnes z obracającego się stage i umieść go na stole.
3. Zdejmij pokrywę, wafel silikonowy, ze szczeliny za pomocą pęsety, spłucz ją wodą DI, osusz sprężonym powietrzem i umieść na szalce Petriego, gdzie wafel może być przechowywany i ponownie używany.
4. Użyj mikropipety, aby usunąć płynne odpady z podkładki bez dotykania powierzchni.
5. Oczyść powierzchnię, odprowadzając płyn z płytki uruchamiającej za pomocą papieru chłonnego (materiału filtracyjnego).
   UWAGA: Utrzymanie powierzchni w stanie nienaruszonym wydłuży żywotność płytki uruchamiającej, co pozwala na wielokrotne użycie.
6. Wyczyść płytkę uruchamiającą, delikatnie zamiatając powierzchnię elektrod czystą kroplą wody DI za pomocą czystej pipety. Następnie usuń kroplę za pomocą bibuły odprowadzającej wilgoć (materiału filtracyjnego).
   UWAGA: Chusteczki higieniczne, papiery, końcówki do pipet i rękawiczki, które są zanieczyszczone materiałem biologicznym, należy wyrzucić do pojemnika na bioodpady.
7. Użyj płytki uruchamiającej do innego testu lub wyjmij ją z platformy DMF w celu przechowywania lub recyklingu.

Results

Wpływ napięcia aktywacji został zbadany w celu wyjaśnienia, jakie są optymalne warunki do przeprowadzenia testów. Kropla z bufora była napędzana przy różnych napięciach zadziałania i rejestrowano jej ruch. Wyniki wykazały (Rysunek 3) istnienie korelacji między średnim kwadratowym napięciem aktywacji (V_rms) a średnią prędkością. Jednak żywotność płytki uruchamiającej uległa zmniejszeniu, gdy zastosowano wysokie wartości V_rms. Na podstawie tych wyników jako standardowe napięcie zadziałania wybrano 105 V_rms, 120 V_rms okazało się najlepsze dla kropli_H2O2/Luminol, a 165 V_rms dla ekstrakcji LUO. Napięcia te zostały uwzględnione w sekwencji programowania automatycznego (plik uzupełniający 1).

Dwa testy immunologiczne (Rysunek 4) zostały pomyślnie przetestowane przy użyciu chipa EWOD z platformą DMF dla czterech różnych patogenów (Tabela 1). Chip EWOD ułatwił kolejne przemieszczanie kropel z podkładek załadowczych do obszaru mieszania, a na końcu do odpadów. Istniały dwa podstawowe LUO, które powtarzano w całym protokole w celu zakończenia testu ELISA. Pierwszym z nich była ekstrakcja LUO; pokrótce opisana tutaj, kropla zawierająca zawieszone kulki została skierowana do miejsca separacji w środku strefy mieszania, magnes został aktywowany automatycznie, aby zbliżyć się do wióra i zebrać kulki magnetyczne w granulkę (Rysunek 5). Następnie kropla została przesunięta w kierunku podkładki odpływowej, pozostawiając kulki na płytce uruchamiającej, kończąc w ten sposób ekstrakcję LUO. Miksowanie było kolejnym kluczowym LUO, które miało miejsce na chipie EWOD. Próbkę analitu o nieznanym stężeniu patogenów przeniesiono na kulki za pomocą elektrozwilżania. Następnie kulki zostały ponownie zawieszone, przesuwając kroplę ze zbitymi kulkami po obszarze mieszania (w sumie 10 padów). Te dwa LUO były niezbędne, ponieważ ułatwiły zminiaturyzowane, szybkie i powtarzalne przetwarzanie próbek z kolejnym wykrywaniem patogenów w ciągu 6 do 10 minut. Rysunek 6 przedstawia pełną sekwencję LUO z testu immunologicznego wykonanego za pomocą chipa EWOD.

Aby osiągnąć pożądane poziomy automatyzacji, można wprowadzić różne warianty protokołu. Na przykład, kulki oddzielono od kropli zubożonej w antygen, którą następnie przeniesiono do podkładki na odpady, powtarzając ekstrakcję podstawową LUO. Na tym etapie protokół może się rozgałęziać w zależności od tego, czy przeciwciało detekcyjne było już sprzężone z HRP, skutecznie wykorzystując łącznie osiem LUO do wykrywania różnych antygenów (Figura 7A-C). W tych przypadkach kropla z przeciwciałem wykrywającym została doprowadzona do kulek, a następnie zmieszana przez aktywację. Alternatywnie, wiązanie przeciwciała detekcji ze koniugatem Neutrawidyna-HRP może być wykonywane sekwencyjnie in situ na chipie EWOD, jak wykazano w przypadku kwantyfikacji E. coli (Figura 7D). Oba protokoły, ośmio- i dziesięcioetapowy test ELISA (Rysunek 4), zapewniły powtarzalne wykrywanie antygenów.

Czasy inkubacji i stężenia koniugatów były zróżnicowane, aby eksperymentalnie znaleźć optymalne warunki dla testu (Rysunek 7A). Stwierdzono, że czas inkubacji wynoszący 160 s i stężenie sprzężone 2 μg/ml osiągnęły najlepszy stosunek sygnału do szumu przy 36% wzroście siły sygnału i praktycznie braku zmian w poziomie szumów tła. Wszystkie rysunki i dane użyte w sekcji reprezentatywnych wyników zostały zmodyfikowane w stosunku do wcześniejszego work⁶.

Przeciwciało pierwotne / wychwytujące	Przeciwciało detekcyjne	antygen
Albumina surowicy antyludzkiej [15C7] (anty-HSA, Abcam ab10241)	Peroksydaza chrzanowa (HRP) oznaczona jako anty-HSA [1A9] (Abcam ab24438)	Albumina surowicy ludzkiej (HSA, Abcam)
Poliklonalny anty-BG Rb	Biotynylowany anty-BG poliklonalny Rb	Zarodniki B. globigii (BG)
Rb anty-E.coli MRE 162 poliklonalny	Biotynylowany Rb anty-E.coli 162 MRE poliklonalny	E. coli MRE 162
Kozia anty-MS2 poliklonalna	Biotynylowany anty-MS2 poliklonalny Rb	Wirus bakteriofagowy MS2

Tabela 1: Antygeny i przeciwciała testowane za pomocą tego protokołu. Wykorzystano cztery typy antygenów patogenów, aby zademonstrować możliwości chipa EWOD z platformą DMF.

Rysunek 1: Konstrukcja płyty EWODA. (a) Schematyczny zapis płytki uruchamiającej EWOD ze złączami (kwadraty, góra), które są połączone (linie) z elektrodami (kwadraty, dół). Każdy pad ma przypisany numer i może być adresowany z kodu oprogramowania (plik uzupełniający 1). Elektrody ładujące są oznaczone strzałkami i oznaczone wielką literą powyżej lub poniżej każdej elektrody. Kluczową cechą platformy DMF jest strefa mieszania składająca się z dziesięciu padów (nr 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Jako wizualny przewodnik, strefa mieszania jest oznaczona czerwonym prostokątem. b) Mikrofotografia konstrukcji mikrosiatki klocków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ilustracja 2: Komponenty i kluczowe stopnie montażu cyfrowego systemu mikroprzepływowego (DMF). (A) Zamocuj płytkę uruchamiającą EWOD, umieść podkładkę na obracającym się stage i załaduj krople. (B) Założyć pokrywę. (C) Zamontuj obudowę magnesu, zapnij zatrzaski i obróć stolik o 180°. (D) Automatyczny magnes jest skierowany w dół. Sprawdź położenie i kształt kropel, sprawdź, czy styki płytki drukowanej (PCB) są wyrównane ze stykami na chipie EWOD, podłącz fotodetektor i umieść go w gnieździe fotodetektora. Po podłączeniu elektroniki sterującej do komputera, system jest gotowy do uruchomienia testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ilustracja 3: Powtarzające się użycie płytek uruchamiających i ich wpływ na napięcie uruchamiania. Średnią prędkość kropli z pracującego bufora wykreśla się jako funkcję napięcia załączającego (niebieskie kółka) i odchylenia standardowego z trzech niezależnych pomiarów (N = 3). W tym przypadku liczba testów na płytkę (szare paski) wskazuje na zwiększony rozpad powierzchni przy wyższych napięciach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Schemat testów immunologicznych testowanych za pomocą EWOD. Każdy okrąg na tym schemacie reprezentuje objętość 2,5 μl załadowaną na chip EWOD. Pierwszy protokół (po lewej stronie) pokazuje osiem LUO przy użyciu wstępnie zmieszanego koniugatu przeciwciało-HRP; podczas gdy drugi protokół obejmuje dziesięć LUO, oddzielnie dodając biotynylowane przeciwciało detekcyjne, ekstrakcję kulek i kolejne wiązanie koniugatu neutrawidyna-HRP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ekstrakcja kulek magnetycznych. Proces ten dzieli się na (a-c) uruchamianie kropli z zawieszonymi kulkami magnetycznymi do miejsca separacji magnetycznej w środku strefy mieszania (podkładka nr 33), (d, e) magnes przesuwa się do pozycji skupiającej kulki, (f, g, h) kulki są utrzymywane w miejscu przez siłę magnetyczną, podczas gdy kropla jest uruchamiana przez EWOD w kierunku podkładki odpływowej (podkładka nr 41). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Pełna sekwencja testu immunologicznego przy użyciu EWOD, pokazująca odczynniki, ładowanie próbki i operacje jednostki laboratoryjnej. Każdy wiersz zawiera sekwencję przykładowych obrazów z charakterystycznych operacji na kropli. Działania robocze są podzielone na kolumny. Mieszanie nie odbywa się dla kulek w zawiesinie, oznaczonych czarną przerywaną linią. Kierunki kropel są oznaczone niebieskimi strzałkami, koraliki są podświetlone na jednym z obrazów pomarańczową strzałką. Szare pole (prawy dolny róg) oddziela dwa obrazy, które reprezentują ruch i pozycję w obszarze wykrywania, a kółko z linią przerywaną podświetla obszar wykrywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Krzywe kalibracyjne z testów immunologicznych przeprowadzonych na chipie EWOD za pomocą platformy DMF. Jak wcześniej informowaliśmy⁶ napięcia wyjściowe (mV) w funkcji stężeń są pokazane dla: (A) albuminy surowicy ludzkiej, która jest używana do badania wpływu stężenia sprzężonego przeciwciała [C] i czasu inkubacji, t_inc, mierzonego od zmieszania kulek ze znanym analitem do ekstrakcji LUO, (B) B. zarodniki atrophaeus (BG) wykazujące odtwarzalność testu immunologicznego, (C) Test immunologiczny bakteriofaga MS2 i (D) wyniki protokołu ten-LUOs dla E. coli. Skróty: jednostki tworzące kolonie (cfu), jednostki tworzące blaszki miażdżycowe (pfu), liczba niezależnych eksperymentów (N), operacje jednostek laboratoryjnych (LUO). Rysunek zmodyfikowany w stosunku do poprzedniej publikacji⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Pełna sekwencja, aby uruchomić platformę DMF do automatycznego testu ELISA z Neutrawidyną-HRP jako koniugatem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Pokazany jest graficzny interfejs użytkownika do pomiaru chemiluminescencji oraz przykład z pomiaru za pomocą oprogramowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Protokół testu immunologicznego EWOD jest elastyczny i może obejmować różną liczbę operacji jednostki laboratoryjnej (np. wychwytywanie antygenu, mieszanie, inkubacja, ekstrakcja kulek, mycie) w zależności od rodzaju odczynnika, stabilności i wymagań dotyczących użycia określonych w protokole testu. Jako dowód zasadności, w niniejszym artykule rozważane są dwa protokoły testów immunologicznych pokazujące implementację ośmiu lub dziesięciu LUO (ryc. 4) z opisanym chipem EWOD. Taka miniaturyzacja zasługuje na mikrolitrowe, dyskretne objętości odczynników/analitu, które zwiększają skuteczność testu ELISA poprzez zmniejszenie zarówno zużycia odczynników, czasu wymaganego na operację, jak i zasadniczo całkowitego czasu eksperymentu (od 6 do 10 minut). Co więcej, test jest zautomatyzowany dzięki czasowej manipulacji kropelkami, co zmniejsza zmiany i poprawia precyzję testu immunologicznego¹⁷. W obecnym formacie eksperyment polega na ręcznym obchodzeniu się z kropelkami na początku każdego testu, co jest punktem do dalszej dyskusji w następnej sekcji.

Jednym z krytycznych kroków w obecnej metodzie DMF jest dozowanie kropel na powierzchnię chipa EWOD. Zazwyczaj mikropipeta z jednorazową końcówką służy do pomiaru dokładnej objętości i jej załadowania. Jednak unieruchomienie kropli na hydrofobowej powierzchni płytki uruchamiającej może stać się trudne ze względu na interakcje między kroplą a naładowaną powierzchnią jednorazowej końcówki. W rezultacie kropla może wystrzelić w górę zgodnie z zewnętrzną powierzchnią końcówki, zamiast pozostać na płytce. Aby tego uniknąć, mikropipetę należy trzymać w pozycji pionowej, prostopadle do powierzchni wióra, nie dotykając jej, a następnie kroplę można dozować na podkładkę ładującą, doprowadzając ją do kontaktu z powierzchnią. Jeśli kropla przyklei się do końcówki pipety, włóż ją z powrotem do roztworu podstawowego, wymień końcówkę i ponownie włóż nową kroplę. W ramach dalszego rozwoju obecnego systemu proof-of-concept można przewidzieć automatyczne dostarczanie kropli.

Kolejnym krytycznym krokiem, przed uruchomieniem testu, jest zamknięcie pokrywy zespołu równoległej płytki. Jak stwierdzono wcześniej w protokole, pokrywę należy nasunąć na płytkę uruchamiającą. Hydrofobowa powierzchnia pokrywy zapobiega zniekształceniom i przemieszczaniu się kropel znajdujących się na płytce uruchamiającej. Aby zagwarantować płynny ruch kropli, zdecydowanie zaleca się stosowanie nieskazitelnej płytki uruchamiającej, prawidłowe ładowanie kropel i montaż wiórów. Możliwe jest ponowne użycie płytek uruchamiających; jednak liczba cykli zależy od napięć uruchamiających (rysunek 3) i osadzania się analitu/odczynnika na powierzchni, czyli biofoulingu. Prezentowana platforma wykorzystywała chromowany układ scalony EBUD, który mógł być niezawodnie ponownie wykorzystany do kolejnych pomiarów do czterech razy przy napięciu roboczym 120 V i pośrednim czyszczeniu płytki po każdym eksperymencie. Płytki poddano recyklingowi, aby obniżyć koszt eksperymentu, poprzez odkażenie (szczotkowanie powierzchni nierozcieńczonym środkiem czyszczącym przed dokładnym spłukaniem) powłoki biofouled amorficznych fluoropolimerów (Tabela materiałów) i wirowanie świeżej powłoki na wierzchu płytki. Recykling płytek uruchamiających wymaga jednak ręcznej obsługi, kosztownych odczynników (amorficzne fluoropolimery (tabela materiałów)) i specjalistycznego sprzętu (powlekarka spinowa). Alternatywne układy scalone EWOD są z powodzeniem badane na opłacalnych podłożach, takich jak papier¹⁹, folie octanowe lub płytki obwodów drukowanych (PCB)^20,21. Takie jednorazowe materiały eksploatacyjne mogą ułatwić niezawodne i niedrogie korzystanie z platformy DMF i mogą zapewnić środki do ominięcia problemu biofoulingu.

Zanieczyszczenie biologiczne jest głównym ograniczeniem EWOD do zastosowań biologicznych^22,23. Wcześniejsze badania nad DMF zidentyfikowały dwa mechanizmy, które przyczyniają się do biofoulingu, a mianowicie pasywną adsorpcję spowodowaną oddziaływaniami hydrofobowymi oraz adsorpcję napędzaną elektrostatycznie, która objawia się po przyłożeniu pola elektrycznego²⁴. Odkrycia zawarte w niniejszym artykule są zgodne z tą teorią, ponieważ udokumentowano, że możliwość ponownego użycia płytki uruchamiającej zmniejsza się przy wysokich napięciach uruchamiania. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że białka łatwo adsorbują się na powierzchniach pokrytych fluoropolimerem (teflonowych) i agregują się szybciej na zanieczyszczonych powierzchniach w porównaniu z nieskazitelnymi powierzchniami²⁴. W związku z tym testy związane z białkami DMF są trudne do określenia ilościowego i mogą powodować utratę analitu, zanieczyszczenie krzyżowe i zmniejszoną precyzję¹⁷. Najgorszym scenariuszem jest sytuacja, w której krytyczna ilość białka adsorbuje się, co sprawia, że urządzenie staje się bezużyteczne. Aby zminimalizować zanieczyszczenie biologiczne, badano różne podejścia, począwszy od minimalizacji czasu przebywania kropli na chipie, poprzez powłoki²³, aż po dodatki (tj. środki powierzchniowo czynne lub kwas pluronowy) do kropelek zawierających biomateriał^6,22. Dlatego ważnym aspektem testu immunologicznego na EWOD jest wybór strategii przeciwporostowych, które są zgodne z konkretnym protokołem.

Zautomatyzowana platforma DMF została zaprojektowana do wykonywania pojedynczego testu ELISA typu sandwich na przebieg przy użyciu mikrolitrów objętości zarówno dla odczynników, jak i analitu. Gdy jest to wymagane, dostępne są konwencjonalne zestawy ELISA typu sandwich oparte na wstępnie powlekanych płytkach 96-dołkowych lub 384-dołkowych, które w połączeniu z pomocniczym sprzętem laboratoryjnym zapewniają wyższą przepustowość na serię; tylko na podstawie ceny odczynników, przybliżony koszt testu / dołka wynosi odpowiednio 6,04 USD (580 USD / 96) i 0,33 USD (2×580 USD / 384). To sprawia, że konwencjonalne metody ELISA są idealne dla dużej liczby próbek przetwarzanych zazwyczaj przez przeszkolony personel techniczny w scentralizowanych obiektach laboratoryjnych. Jednak w odległych lokalizacjach szczegółowa analiza kosztów testu ELISA do monitorowania środowiska wykazała, że po uwzględnieniu kosztów kapitałowych (tj. kosztów operacyjnych laboratorium, kosztów stałych, transportu próbek, materiałów eksploatacyjnych i personelu) rzeczywista cena za test ELISA wynosiła 60 USD, z czego 34 USD przypadło na dostawy na próbkę²⁵. W przeciwieństwie do tego, proponowana platforma DMF jest przenośna, wymaga minimalnego szkolenia w obsłudze, a dzięki wstępnie powlekanym kulkom może zapewnić analizę od próbki do odpowiedzi w ciągu kilku minut. W związku z tym prezentowana technologia może być wdrażana w miejscach zapotrzebowania i uzupełniać analizy dostępne w scentralizowanych laboratoriach.

W sekcji reprezentatywnych wyników wykorzystano zautomatyzowaną platformę testów immunologicznych DMF do bezpośredniego wykrywania patogenów do zastosowań obronnych. Inne możliwe zastosowania platformy DMF obejmują między innymi biodiagnostykę, ciągłe monitorowanie i automatyczne pobieranie próbek. Potencjalnie DMF może mieć wpływ na różne sektory, od opieki nad pacjentem w miejscu opieki nad pacjentem w celu zapewnienia spersonalizowanej opieki zdrowotnej, poprzez kontrolowane monitorowanie środowiska w celu ochrony pacjentów przed zakażeniami szpitalnymi przenoszonymi drogą powietrzną, aż po system monitorowania upraw w rolnictwie i produkcji żywności.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas (4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anty-ludzka albumina surowicy [15C7]	Abcam	ab10241
Anty-ludzka albumina surowicy [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) zarodniki	Dstl, Wielka Brytania	N/A
Biotynylowany Rb anty-BG poliklonalny	Dstl, Wielka Brytania	N/
a Biotynylowany Rb anty-E. coli MRE 162 poliklonalny	Dstl, Wielka Brytania	Nie dotyczy
Biotynylowanego Rb anty-MS2 poliklonalnego	Dstl, Wielka Brytania	Nie dotyczy kazeiny
blokującej Thermo	Scientific	TFS 37582
Piła do krojenia / cięcia CNC	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japonia	CTL-809M	Amorficzne fluoropolimery. Jest to powłoka dwuskładnikowa.
E. coli MRE 162	Dstl, Wielka Brytania	Nie dotyczy
koziego anty-MS2 poliklonalnego	Dstl, Wielka Brytania	Nie dotyczy
fotodiody Hamamatsu	Hamamatsu, Japonia	S9270
Kwas hidrochlorowy (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Usługa produkcji masek	Compugraphics, Szkocja, Wielka Brytania	Nie dotyczy
wirusa MS2	Dstl, Wielka Brytania	Nie dotyczy
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	Nr CAS: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Zawiera wszystkie i odczynniki wymagane do immobilizacji enzymów. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Rb anty-BG poliklonalny	Dstl, Wielka Brytania	Nie
Rb anty-E. coli MRE 162 poliklonalny	Dstl, UK	Nie dotyczy
rekombinowanego białka albuminy ludzkiej surowicy, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Wafel krzemowy, 4'', typ p, < 100>, 1– 10 Ω cm	Pi Kem Ltd	/A
Powlekarka wirowa	SÜ SS MicroTec AG, Niemcy
SuperSignal ELISA Femto Podłoże o maksymalnej czułości	Thermo Scientific	37075	Zawiera 50 ml roztworów luminolu / wzmacniacza i stabilnego nadtlenku. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	Producentem jest Surfact-Amps Detergent Solution.