Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia przyżyciowa (IVM) jest szeroko stosowana do monitorowania procesów fizjologicznych i patofizjologicznych w kaskadzie rekrutacji leukocytów in vivo. Obecny protokół stanowi praktyczną i powtarzalną metodę wizualizacji interakcji śródbłonka leukocytów prowadzącej do rekrutacji leukocytów w tkance pochodzącej z mięśni szkieletowych w nienaruszonym organizmie myszy. Model ma zastosowanie we wszystkich dziedzinach badań, które koncentrują się na aktywacji granulocytów i ich roli w chorobie.
Udostępniamy protokół krok po kroku, aby przeprowadzić przez metodę i wskazać potencjalne pułapki i trudności techniczne. Protokół obejmuje następujące aspekty: warunki eksperymentalne i wymagany materiał, znieczulenie myszy, rozwarstwienie mięśnia cremaster oraz kaniulacja tchawicy i tętnicy szyjnej, zapisy IVM i analiza offline. Szczegółowo wyjaśniono formaty danych, takie jak przylegające leukocyty, strumień toczny (RF) i frakcja strumienia tocznego (RFF) oraz omówiono odpowiednie zastosowania. Reprezentatywne wyniki dotyczące myszy mdx z niedoborem dystrofiny znajdują się w sekcji wyników.
IVM jest potężnym narzędziem do oceny rekrutacji leukocytów w warunkach in vivo; jednak określenie na przykład funkcji śródbłonka i leukocytów może wymagać połączenia z układami ex vivo, takimi jak eksperymenty w komorze przepływowej. Co więcej, pochodzenie genetyczne zwierząt będących przedmiotem zainteresowania może mieć duży wpływ na rekrutację wyjściową, co wymaga indywidualnego dopracowania dostarczonego protokołu. Pomimo swoich ograniczeń, IVM może służyć jako platforma do łatwego przekładania wyników badań in vitro na żywy organizm kręgowca.
Wprowadzenie
Mikroskopia przyżyciowa (IVM) jest powszechnie stosowanym narzędziem w dziedzinie biologii leukocytów. Rekrutacja leukocytów następuje po kaskadzie dobrze zdefiniowanych zdarzeń zainicjowanych przez wychwyt, zwijanie i przyleganie leukocytów do ściany śródbłonka, a na końcu transmigrację i wynaczynienie leukocytów do właściwego miejsca zapalenia1. Każdy etap jest pośredniczony i kontrolowany przez różne chemokiny (np. IL-8/CXCL8), receptory (np. LFA-1, Mac-1) i odpowiadające im cząsteczki adhezyjne komórek śródbłonka (np. ICAM-1, VCAM-1 i E-Selectin)2,3. Interakcja różnych miejsc regula....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zwierzęta były utrzymywane w kontrolowanych warunkach, wolnych od specyficznych patogenów, w IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung) w Heidelbergu. Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez lokalną komisję IRB oraz Regierungspraesidium Karlsruhe, Badenia-Wirtembergia, Niemcy.
1. Podanie znieczulenia
- Zanurz mysz w narkozie poprzez dostrykalny (i.p.) bolusowy wtrysk 125 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny.
- Umieść i unieruchom mysz w pozycji grzbietowej na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia (36,5-38 °C). Użyj niewchłonnialnej sterylnej nici chirurgicznej ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
IVM przeprowadzone zgodnie z dostarczonym protokołem pozwoli na uzyskanie unikalnych informacji na temat kaskady rekrutacji leukocytów w mięśniach szkieletowych. Sekcja wyników skupi się na typowych rezultatach uzyskiwanych za pomocą IVM oraz zwróci uwagę na potencjalne problemy, które mogą wystąpić.
Układ eksperymentalny do mikroskopii intravitalnej przedstawiono w Rysunek 1Przygotowanie mięśnia opuszkowego oraz usunięcie tkanki łącznej są kluczowe dla uzyskania .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
IVM jako metoda jest szeroko stosowana do badania różnych typów komórek w różnych narządach i została szeroko opisana i omówiona19. Głównym celem tego badania jest zapewnienie skutecznego podejścia do ustawiania i wykonywania IVM w mięśniu cremaster. Praktykowanie tej metody przyniesie wiarygodne i powtarzalne wyniki. Dlatego planowanie i standaryzacja są kluczowymi czynnikami do opanowania tej techniki. Przede wszystkim technika ta jest w dużym stopniu zależna od parametrów hemodynamicznych i mik.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF) 01GL1746E jako część konsorcjum PRIMAL. Autorzy dziękują Brittie Heckmann i Silvii Pezer za umiejętną pomoc techniczną.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiał | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | znieczulenia. Nazwa rodzajowa / IUPAC: ketamina |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Nr artykułu: 1205 | znieczulenie. Nazwa ogólna / IUPAC: ksylazyna (jako chlorek hidrochlorku) |
| Roztwór soli | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | przygotowanie chirurgiczne. Ogólny / IUPAC Nazwa: chlorek sodu |
| Igła strzykawkowa Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | przygotowanie chirurgiczne |
| Szew 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | przygotowanie chirurgiczne |
| Rurka polietylenowa #10 | BD GmbH | Dostawca nr 427401 | przygotowanie chirurgiczne |
| Rurka polietylenowa #90 | BD GmbH | Dostawca nr 427421 | przygotowanie chirurgiczne |
| Rodamina 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Numer CAS 989-38-8 | barwienie leukocytów. Nazwa ogólna / IUPAC: 2-[3-(etyloamino)-6-etylomino-2,7-dimetyloksanten-9-ylo]benzoesan etylu |
| Setup Equipment | |||
| Mikroskop pionowy | Olimpia | Mikroskopia BX51W1 | |
| 40-krotny obiektyw | Mikroskopia Zeiss | Achroplan 40 & razy; /0,80 W | |
| Oprogramowanie ImSpector | Oprogramowanie Lavision Biotec GmbH | wersja 4.0.469 | |
| Oprogramowanie ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 |
Bibliografia
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
