Mikroskopia przyżyciowa (IVM) jest powszechnie stosowanym narzędziem w dziedzinie biologii leukocytów. Rekrutacja leukocytów następuje po kaskadzie dobrze zdefiniowanych zdarzeń zainicjowanych przez wychwyt, zwijanie i przyleganie leukocytów do ściany śródbłonka, a na końcu transmigrację i wynaczynienie leukocytów do właściwego miejsca zapalenia1. Każdy etap jest pośredniczony i kontrolowany przez różne chemokiny (np. IL-8/CXCL8), receptory (np. LFA-1, Mac-1) i odpowiadające im cząsteczki adhezyjne komórek śródbłonka (np. ICAM-1, VCAM-1 i E-Selectin)2,3. Interakcja różnych miejsc regulacyjnych, czynników kontrolujących i mediatorów kaskady rekrutacji leukocytów, takich jak receptor końcowych produktów zaawansowanej glikacji (RAGE), międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 1 (ICAM-1), ligand motywu C-X-C (CXCL)1/2 i ich receptor CXCR2 zostały odkryte za pomocą IVM4,5,6,7,8,Rozdział 9.
Metoda IVM została opisana dla wielu różnych narządów i tkanek, takich jak jelito10, skin11, węzły chłonne12, embrionalny worek z żółtkiem13 i inne. Jednak najszerzej badaną metodą IVM jest model cremaster, po raz pierwszy opisany w rats14. Chociaż metoda ta jest nadal stosowana u szczurów15, obecnie stosowana głównie u myszy ze względu na dużą obfitość różnych linii transgenicznych. Nasza grupa niedawno podkreśliła potencjalną rolę cremaster IVM w dziedzinie zapalnych muskopatii, takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), badając myszy mdx z niedoborem dystrofiny16. Ze względu na cienką przeplataną i łatwo dostępną kompozycję włókien, mięsień cremaster stanowi idealny mięsień kandydujący do badania jako całość za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Rekrutacja i wynaczynienie leukocytów odbywa się głównie w żyłkach pozakapilarnych, które można łatwo zidentyfikować na ciągłej warstwie mięśniowej w mięśniu cremaster.
Zaletą obrazowania in vivo w porównaniu z innymi testami in vitro jest jego biologiczny kontekst w żywym organizmie. Jednocześnie określenie specyficznego dla komórki wkładu w zmienioną rekrutację leukocytów może wymagać dodatkowych modeli in vitro, takich jak komory przepływowe lub testy śródbłonka. Połączenie wielu metod przyniesie najbardziej przekonujące dane. Naukowcy powinni zdawać sobie sprawę z ograniczeń modelu cremaster, ponieważ każda manipulacja chirurgiczna doprowadzi do zwiększonego transportu i rekrutacji leukocytów. W związku z tym rekrutacja wyjściowa jest trudna do oszacowania tą metodą. Pomimo szerokiego zastosowania, IVM cremastera może być wyzwaniem, a stworzenie nowatorskiej konfiguracji może wymagać czasu i zasobów. Teraz udostępniamy prosty protokół, który pomoże uniknąć niektórych typowych błędów w IVM. Omówione zostaną również ograniczenia, a w stosownych przypadkach zostaną podkreślone metody uzupełniające.
IVM cremastera reprezentuje idealne podejście do wdrożenia w dziedzinie badań nad stanami zapalnymi i zakaźnymi. Mówiąc dokładniej, model cremaster może być bardzo interesujący dla naukowców zajmujących się biologią mięśni szkieletowych w kontekście chorób zapalnych.