Artykuł metodologiczny

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

DOI:

10.3791/60517

⸱

10 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda polega na podziale otoczki bakterii Gram-ujemnych na frakcje całkowite, wewnętrzne i zewnętrzne błony (OM) i kończy się testami oceniającymi czystość dwuwarstw. OM ma zwiększoną gęstość ogólną w porównaniu z błoną wewnętrzną, głównie ze względu na obecność lipooligosacharydów (LOS) i lipopolisacharydów (LPS) w płaszczu zewnętrznym. Cząsteczki LOS i LPS to glikolipidy amfipatyczne, które mają podobną strukturę, która składa się z disacharylipidu lipid-A i podstawnika rdzeniowo-oligosacharydowego. Jednak tylko cząsteczki LPS są ozdobione trzecią podjednostką znaną jako polisacharyd O lub antygen O. Rodzaj i ilość obecnych glikolipidów będzie miała wpływ na gęstość OM organizmu. W związku z tym sprawdziliśmy, czy błony bakterii o zróżnicowanej zawartości glikolipidów można podobnie wyizolować za pomocą naszej techniki. W przypadku organizmów wytwarzających LPS, Salmonella enterica, serowar Typhimurium i Escherichia coli, błony były łatwe do wyizolowania, a ugrupowanie antygenu O LPS nie wpływało na partycjonowanie dwuwarstwowe. Acinetobacter baumannii wytwarza cząsteczki LOS, które mają podobną masę do cząsteczek LPS z niedoborem antygenu O; Jednak błony tych drobnoustrojów początkowo nie mogły zostać rozdzielone. Doszliśmy do wniosku, że OM A. baumannii był mniej gęsty niż u Enterobacteriaceae, więc gradient sacharozy został dostosowany, a błony wyizolowane. Technika ta może być zatem dostosowywana i modyfikowana do stosowania w przypadku innych organizmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie błony, które są oddzielone przestrzenią peryplazmatyczną i ścianą komórkową peptydoglikanu1. Błona wewnętrzna (IM) otacza cytozol i jest symetryczną dwuwarstwą fosfolipidów. Peptydoglikan chroni przed ciśnieniem turgoru i nadaje bakterii kształt komórki, a także jest przyłączony do błony zewnętrznej (OM) przez lipoproteiny2,3. OM otacza peryplazmę i jest w przeważającej mierze asymetryczna. Ulotka wewnętrzna składa się z fosfolipidów, a ulotka zewnętrzna składa się z glikolipidów znanych jako lipooligosacharydy (LOS) lub lipopolisacharydy (LPS)4,5. Asymetria lipidów i biochemia cząsteczek LOS/LPS w ulotce zewnętrznej nadają powierzchni komórki właściwości barierowe, które chronią bakterię przed zagrożeniami w jej środowisku6,7.

Cząsteczki LPS składają się z trzech składników: disacharydu lipidowego A, oligosacharydu rdzeniowego i O-polisacharydu lub antygenu O. Lipid A jest wielokrotnie acylowanym disacharylipidem. Oligosacharydy rdzeniowe składają się z 10-15 cukrów znanych jako szorstki LPS lub R-LPS. Rdzeń jest podzielony na obszar wewnętrzny, składający się z kwasu 2-keto-3-deoksy-D-manno-oktulosonowego (kdo) i jednej lub więcej reszt heptozy, oraz obszar zewnętrzny, który składa się głównie z heksoz (glukozy lub galaktozy) i heptoz, czyli cukrów acetamido5. Zewnętrzny obszar jądra jest bardziej zmienny pod względem składników i struktury niż jądro wewnętrzne. U Salmonella spp. opisano tylko jedną strukturę rdzenia; jednak w Escherichia coli istnieje pięć różnych struktur rdzeniowych (oznaczonych jako K-12, R1, R2, R3 i R4)8. Bakteria E. coli K-12 DH5α, którego używamy w tej procedurze, niesie ze sobą mutację, która skutkuje produkcją R-LPS9. Cząsteczki R-LPS nie mają ugrupowania antygenu O i mają podobną masę cząsteczkową do cząsteczek LOS.

Dodanie antygenu O do R-LPS zamienia tę cząsteczkę w gładki LPS lub S-LPS. Antygeny O są zbudowane z krótkich 3-4 podjednostek węglowodanowych i składają się z wielu modalności o różnej długości łańcucha10. Niektóre bakterie wytwarzające LPS, takie jak Salmonella enterica serowar Typhimurium (S. Typhimurium), wyświetlają trimodalny rozkład cząsteczek LPS na ich powierzchni10,11. Antygeny O o bardzo długich łańcuchach mogą zawierać ponad sto podjednostek i ważyć ponad sto kilodaltonów. Antygeny O zapewniają bakterii właściwości powierzchniowe, które są niezbędne do oparcia się antybiotykom, unikania drapieżnictwa bakteriofagów i wywoływania choroby.

Gatunki Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria i inne generują cząsteczki LOS zamiast cząsteczek LPS na swojej powierzchni12. Cząsteczki LOS składają się z lipidu A i oligosacharydów rdzeniowych, ale nie mają antygenu O. Tego typu bakterie Gram-ujemne modyfikują swoje podstawowe oligosacharydy dodatkowymi cukrami i kombinacjami cukrów, aby zmienić właściwości powierzchniowe12. Zarówno mikroorganizmy wytwarzające LOS, jak i LPS wyprowadzają fosforany na lipid A i cząsteczki rdzeniowe z ugrupowaniami kationowymi7. Dodatki te obejmują podstawienie fosfoetanoloaminy, galaktozaminy i aminoarabinozy, które działają poprzez neutralizację anionowego ładunku powierzchniowego, a tym samym ochronę przed kationowymi peptydami przeciwdrobnoustrojowymi. Bakterie Gram-ujemne modyfikują również podstawową strukturę oligosacharydów za pomocą zmiennych niestechiometrycznych podstawień cukrów lub dodatkowych cząsteczek kdo i zmieniają liczbę łańcuchów acylowych na disacharylipidach lipid-A7.

Zdolność do izolowania IM od OM bakterii Gram-ujemnych była kluczowa dla zrozumienia roli otoczki komórkowej w oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i patogenezie choroby11,12. Wyprowadzenia tego podejścia wykorzystano do wydedukowania mechanizmów składania, utrzymywania i przebudowy składników białkowych, fosfolipidowych i glikolipidowych dla OM.

Nasze laboratorium rutynowo przeprowadza bakteryjne analizy lipidomiczne, aby badać regulację lipidów i funkcję lipidów za pośrednictwem białek u różnych gatunków Gram-ujemnych. Objętości użyte w protokole odzwierciedlają rutynowe stosowanie tej procedury do analizy fosfolipidów nieznakowanych radioaktywnie metodą chromatografii cienkowarstwowej i chromatografii cieczowej tandemowej spektrometrii mas13,14.

Protokół rozpoczyna się od wystawienia schłodzonej zawiesiny bakterii Gram-ujemnych na działanie wysokoosmolarnego roztworu sacharozy i dodania lizozymu w celu oddzielenia OM od leżącej poniżej warstwy peptydoglikanu (Rysunek 1)12. EDTA jest następnie dodawany, aby ułatwić penetrację lizozymu, ponieważ sekwestracja kationów dwuwartościowych zakłóca boczne elektrostatyczne interakcje mostkowe między sąsiednimi cząsteczkami LOS / LPS15. Pierwotny protokół, z którego został zaadaptowany, wymagał utworzenia sferoplastów, Gram-ujemnej formy komórek bakteryjnych, które składają się z błony plazmatycznej i cytozolu, ale brakuje warstwy peptydoglikanu i OM. Możliwe, że sferoplasty są wytwarzane dostosowaną metodą; Jednak technika ta nie opiera się ani nie zamierza polegać na ich formacji w celu osiągnięcia sukcesu. Zamiast tego bakterie traktowane lizozymem-EDTA są szybko zbierane przez wirowanie i ponownie zawieszane w roztworze sacharozy o mniejszym stężeniu przed lizą pod ciśnieniem. OM, które mogły zostać uwolnione przez tworzenie sferoplastów, powinny teoretycznie nadawać się do zebrania z supernatantów leczonych komórek, ale to podejście nie jest szczegółowo opisane w niniejszym dokumencie. Ostatecznie leczone komórki są poddawane konwencjonalnej homogenizacji i lizie, co zwiększa wydajność i odtwarzalność procedury separacji membranowej16.

Po lizie, całkowite membrany są zbierane przez ultrawirowanie i nakładane na nieciągły gradient gęstości sacharozy w celu frakcjonowania IMs i OMs. Podejście klasyczne wykorzystuje bardziej ciągły gradient, który składa się z co najmniej pięciu różnych roztworów sacharozy11,12. Nieciągły gradient w naszym protokole składa się z trzech roztworów sacharozy i dzieli dwie warstwy na dwie odrębne frakcje17. Cząsteczki LOS i LPS w OM bakterii Gram-ujemnych napędzają otoczkę, aby podzielić się na górną brązową frakcję IM o niskiej gęstości i dolną białą frakcję OM o wysokiej gęstości (Rysunek 1 i Rysunek 2).

Acinetobacter baumannii są ważnymi wielolekoopornymi ludzkimi patogenami, które wytwarzają cząsteczki LOS w swoim OM i tworzą otoczkę komórkową, która jest trudna do oddzielenia18,19. Ostatnie prace sugerują, że pochodna protokołu, który tutaj prezentujemy, może być wykorzystana do podziału dwuwarstw tych organizmów20. Dlatego przetestowaliśmy nasz protokół na A. baumannii 17978. Początkowo procedura była niewystarczająca. Jednak zmodyfikowaliśmy stężenie sacharozy w roztworze o średniej gęstości i znacznie poprawiliśmy separację (Rysunek 2). Test dehydrogenazy NADH oraz procedura ekstrakcji i wykrywania LOS/LPS zostały wykorzystane w celu potwierdzenia separacji A. baumannii, S. Typhimurium typu dzikiego i dwóch genotypów enterobakterii z niedoborem antygenu O; mianowicie galE-mutant S. Typhimurium i szczep laboratoryjny, E. coli DH5α (Rysunek 3 i Ryc. 4).

Intencją tej pracy jest dostarczenie uproszczonego podejścia do powtarzalnego izolowania błon bakterii Gram-ujemnych. Protokół może być wykorzystany do badania wielu rodzajów cząsteczek związanych z błoną dla tych drobnoustrojów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ogólne odczynniki i przygotowanie pożywek do ekstrakcji membranowej

  1. Pożywka do hodowli bakterii: Przygotować i wysterylizować 1 l pożywki bulionowej w dokładnie oczyszczonej i autoklawizowanej kolbie o pojemności 2 l.
  2. Ogólny bufor do sporządzania zawiesiny (1 M Tris Buffer pH 7,5; 50 mL): Rozpuścić 6,05 g zasady Tris w 30 ml H2O. Dostosować pH do 7,5 za pomocą 5 M HCl. Dostosować końcową objętość do 50 ml za pomocą ultraczystego H2O.
  3. Główny zapas roztworu chelatacji kationów dwuwartościowych (0,5 M EDTA pH 8; 100 ml): Dodać 18,6 g tetraoctanu disodu etylenu ·2H2O do 80 mlH2O. Energicznie wymieszać i dostosować pH do 8,0 za pomocą NaOH. Dostosuj końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystego H2O.
    nuta: Sól disodowa EDTA nie rozpuści się, dopóki pH roztworu nie zostanie dostosowane do ~8,0 przez dodanie NaOH.
  4. Bufor osmotyczny A (0,5 M sacharozy, 10 mM Tris pH 7,5; 1 l): Odważyć 171,15 g sacharozy i przenieść do butli o pojemności 1 l. Dodać 10 ml 1 M Tris pH 7,5. Doprowadzić do końcowej objętości 1 l za pomocą ultraczystegoH2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Lizozym (10 mg/ml; 5 ml): Odważyć 50 mg lizozymu (białka jaja kurzego) i rozpuścić w 5 ml ultraczystegoH2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Rozcieńczony dwuwartościowy roztwór chelatacyjny kationów (1,5 mM EDTA; 500 ml): Dodać 1,5 ml 0,5 M EDTA (krok 1.3) do 497,5 ml ultraczystegoH2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Bufor osmotyczny B (0,2 M sacharozy, 10 mM Tris pH 7,5; 2 l): Odważyć 136,8 g sacharozy i przenieść do butli o pojemności 2 l. Dodaj 20 ml 1 M Tris pH 7,5. Doprowadzić końcową objętość do 2 l za pomocą ultraczystegoH2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Kofaktor nukleazy (1 M MgCl2; 10 ml): Rozpuścić 2,03 g MgCl2·6H2O w 8 ml ultraczystego H2O. Dostosować objętość do 10 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  9. Koktajl roztworu nukleazy zawierający enzymy RNazy i DNazy: Patrz tabela materiałów. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  10. Koktajl inhibitorów proteazy: Patrz tabela materiałów. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  11. Gradientowy roztwór izopikeniczny sacharozy o niskiej gęstości (20% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM roztwór Tris pH 7,5; 100 ml): Odważyć 20 g sacharozy i przenieść do butli o pojemności 200 ml. Dodać 100 μl 1 M Tris Buffer pH 7,5 i 200 μL 0,5 M EDTA pH 8. Dostosować końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystegoH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  12. Izopikniczny roztwór gradientowy sacharozy o średniej gęstości (53% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM roztwór Tris pH 7,5; 100 ml): Odważyć 53 g sacharozy i przenieść do 200 ml cylindra miarowego. Dodać 100 μl 1 M Tris Buffer pH 7,5 i 200 μL 0,5 M EDTA pH 8. Dostosować końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystegoH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    nuta: Przygotuj ten roztwór w cylindrze z podziałką, aby zapewnić dokładność ze względu na wysoki procent sacharozy. Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj, aż sacharoza całkowicie rozpuści się w roztworze. Ten proces może potrwać kilka godzin.
  13. Izopikniczny roztwór gradientowy sacharozy o dużej gęstości (73% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM roztwór Tris pH 7,5; 100 ml): Odważyć 73 g sacharozy i przenieść do 200 ml cylindra z podziałką. Dodać 100 μl 1 M Tris Buffer pH 7,5 i 200 μL 0,5 M EDTA pH 8. Dostosować końcową objętość do 100 ml za pomocą ultraczystegoH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    nuta: Przygotuj ten roztwór w cylindrze z podziałką, aby zapewnić dokładność ze względu na wysoki procent sacharozy. Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj, aż sacharoza całkowicie się rozpuści. Ten proces może potrwać kilka godzin.
  14. Bufor do przechowywania z izolowaną membraną (10 mM Tris Buffer pH 7,5; 1 L): Dodać 1 ml 1 M Tris Buffer pH 7,5 do kolby o pojemności 1 l i dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą ultraczystegoH2O.
  15. Dinukleotyd β-nikotynamidoadeninowy (NADH) (roztwór 10 mg/ml): Zawiesić 10 mg NADH w ultraczystymH2O. Przygotuj świeże zapasy co tydzień. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  16. Roztwór fenolu zrównoważony z 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA: Patrz tabela materiałów. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  17. Zestaw barwników w żelu lipopolisacharydowym: Zobacz tabelę materiałów.
  18. Odczynnik Bradford: Patrz tabela materiałów.
    UWAGA: Wszystkie roztwory i pożywki należy przygotować w ciągu tygodnia od wykonania testu, aby zapewnić spójne wyniki.

2. Przygotowanie bakterii do ekstrakcji membranowej

  1. Przenieś bakterie z zamrożonych zapasów glicerolu na świeże płytki agarowe. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C po rozwinięciu się kolonii. Zaszczepij pojedynczą kolonię w probówce o pojemności 5 ml wypełnionej pożywką bulionową i hoduj bakterie według uznania przez noc.
  2. Rozcieńczyć wstecznie nocną kulturę bakteryjną w 1 litrze preferowanej pożywki bulionowej i hodować bakterie aż do osiągnięcia pożądanej gęstości optycznej.
    nuta: Inokulacja pojedynczej kolonii bakteryjnej w 1 litrze pożywki bulionowej jest zalecana w przypadku zmutowanych genotypów, które są podatne na hamowanie fenotypów wzrostu, ale niektóre bakterie Gram-ujemne po prostu rosną wolniej niż inne. Jeśli nie jest możliwe osiągnięcie wystarczającej gęstości hodowli przez inokulację pojedynczej kolonii, ponowne rozcieńczenie nocnej kultury do 1 litra pożywki jest jedną ze strategii synchronizacji wzrostu. Skład błony bakteryjnej różni się w zależności od fazy wzrostu kultury (faza logarytmiczna lub stacjonarna)13. Krzywe wzrostu mierzące zmianę gęstości optycznej kultur bakteryjnych w funkcji czasu powinny być wykonane dla wszystkich szczepów w celu skorelowania gęstości hodowli z fazą wzrostu.
  3. Kolby zawierające kultury bulionu umieścić na lodzie. Odczytaj gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) i oblicz objętość hodowli, która odpowiada między 6,0 a 8,0 x 1011 jednostek tworzących kolonie bakteryjne (cfu). W przypadku S. Typhimurium odpowiada to 1 litrowi kultury przy OD600 między 0,6-0,8, ponieważ OD600 1,0 jest równe około 1,0x109 jtk/ml. Dodać tę objętość do probówki wirówkowej i upewnić się, że pozostałe kultury pozostaną na lodzie do czasu, gdy będą miały być użyte.
  4. Bakterie osadzać przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przy 7 000-10 000 x g w wirówce szybkoobrotowej o stałym kącie przez 10 min.
    nuta: Wstępnie schłodzić i utrzymywać wirówki w niskiej temperaturze. Próbki należy utrzymywać na lodzie przez cały czas trwania procedury.
  5. Zdekantować i ostrożnie wyrzucić supernatant.
    nuta: Granulki mogą być błyskawicznie zamrażane i/lub przechowywane w temperaturze -80 °C, jeśli frakcje membranowe nie mają być natychmiast ekstrahowane. Zaleca się jednak bezpośrednie przystąpienie do plazmolizy w tym samym dniu, w którym pobierane są komórki, i jest to szczególnie zalecane w przypadku gatunków nieenterobakteryjnych.

3. Dysocjacja błony zewnętrznej i plazmoliza

  1. Rozmrozić granulki komórek na lodzie, jeśli były wcześniej przechowywane w temperaturze -80 °C, i zachować próbki na lodzie do końca procedury. Zawiesić każdą osadkę komórkową w probówce wirówkowej w 12,5 ml buforu A. Dodać mieszadło magnetyczne do zawiesiny komórek.
  2. Dodać 180 μl lizozymu 10 mg/ml (końcowe stężenie 144 μg/ml) do każdej zawiesiny komórek. Próbki należy przechowywać na lodzie, mieszając przez 2 minuty.
  3. Dodaj 12,5 ml 1,5 mM roztworu EDTA do każdej reprodukcji komórek i kontynuuj mieszanie na lodzie przez dodatkowe 7 minut.
  4. Zdekantować zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 9 000-11 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Wyrzuć supernatanty do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i zatrzymaj granulki na lodzie.
  6. Dodać 25 ml buforu B do osadu komórkowego.
  7. Dodać 55 μl 1 M MgCl2, 1 μl odczynnika nukleazy RNazy/DNazy (aby uniknąć problemów z lepkością związanych z bakteriami przechodzącymi plazmolizę przed homogenizacją) i 1 μl koktajlu inhibitorów proteazy do objętości buforu B, który znajduje się na wierzchu osadu komórkowego
  8. Zawiesić osad w mieszaninie buforu B. Energicznie pipetować i mieszać, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.
    nuta: Bardzo ważne jest, aby mieć jednorodny roztwór przed przejściem do kroku 4 tego protokołu. Zawieszone komórki powinny mieć lepki wygląd i konsystencję przypominającą ciasto.
  9. Wirować każdą próbkę przez 15 s. Zatrzymać zawiesiny na lodzie i przejść do kroku 4.

4. Homogenizacja i liza pod ciśnieniem

UWAGA: Do lizy można zastosować kilka metod. Sonikacja nie jest idealna ze względu na wytwarzanie ciepła. Można osiągnąć lizę osmotyczną, ale często jest ona nieefektywna. Dlatego zalecamy lizę pod wysokim ciśnieniem. Lizę pod wysokim ciśnieniem można osiągnąć za pomocą różnych przyrządów. Proponujemy maszyny do homogenizacji, takie jak French Press lub Emusliflex. Pracujemy z wieloma typami bakterii Gram-ujemnych, których reakcja na roztwory sacharozy o wysokiej zawartości osmolarnej jest różna. Etap homogenizacji wysokociśnieniowej poprawia wydajność, powtarzalność i wydajność.

  1. Schłodzić komorę French Press w temperaturze 4 °C lub włożyć metalową cewkę z homogenizatora na lód.
  2. Wlej próbkę do francuskiej celi ciśnieniowej lub cylindra homogenizatora i doprowadź do pożądanego ciśnienia homogenizacji (10 000 psi powinno być wystarczające w przypadku korzystania z prasy francuskiej lub 20 000 psi w przypadku stosowania homogenizatora).
  3. Dostosuj natężenie przepływu na wylocie do około jednej kropli na sekundę, utrzymując ciśnienie w przypadku korzystania z prasy francuskiej.
  4. Zebrać lizat komórkowy w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, trzymając próbki na lodzie.
  5. Powtórzyć kroki 4.2-4.4 trzy do pięciu razy, aby uzyskać całkowitą lizę, zwykle oznaczoną stopniowym wzrostem przezroczystości próbki.
    nuta: Komora na próbkę powinna być umyta i zrównoważona buforem B pomiędzy próbkami.
  6. Utrzymuj lizowane komórki na lodzie.

5. Całkowite frakcjonowanie membranowe

  1. Odwirować zlizowane próbki bakteryjne o masie 6,169 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia pozostałego nienaruszonego materiału komórkowego. (np. nielizowane komórki bakteryjne).
  2. Rozprowadzić pozostałą część supernatantu, która teraz zawiera homogenizowane membrany, do butelki z poliwęglanu w celu ultrawirowania.
    ostrożność: W razie potrzeby próbki komórek można zrównoważyć przez rozcieńczenie buforem B.
  3. Ultraodwirować lizaty komórkowe przy 184 500 x g przez co najmniej 1 godzinę, w temperaturze 4 °C. Ten etap można wykonać przez noc bez wpływu na jakość membran.
  4. Odrzuć pozostały supernatant obecny w probówce ultrawirówki i pozostaw granulki membrany na lodzie (Rysunek 1).
  5. Zawiesić granulki membrany w 1 ml gradientowego roztworu izopiknowo-sacharozowego o niskiej gęstości za pomocą homogenizatora szklanego. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś homogenat próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i pozostaw na lodzie.
    nuta: Jeśli pożądana jest tylko analiza całkowitego składu błony, zastąp 1 ml roztworu gradientu izopiknowo-sacharozowego o niskiej gęstości 1 ml buforu do przechowywania z izolowaną membraną. Krok 5.5 jest punktem końcowym izolacji, jeśli pożądane są tylko próbki błony całkowitej bakterii. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy wymagana jest dalsza analiza.

6. Ultrawirowanie gradientu gęstości w celu oddzielenia podwójnych membran

  1. Zbierz odpowiednią liczbę 13 ml polipropylenowych lub ultraprzezroczystych probówek z otwartym wierzchem, przeznaczonych do wahadłowego wirnika kubełkowego i ultrawirówki.
  2. Trzymaj probówkę w lekko pochylonej pozycji i przygotuj gradient sacharozy, powoli dodając roztwory sacharozy o większej gęstości do mniejszej gęstości w następującej kolejności:
    2 ml 73% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    4 ml 53% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    1. Następnie dodać całkowitą frakcję membranową (1 ml), która została ponownie zawieszona w 20% w/v roztworze sacharozy (krok 5.5). Unikaj mieszania frakcji membranowej z roztworem sacharozy, który znajduje się pod nią. Pomiędzy każdą z tych warstw powinny być widoczne podziały.
    2. Na koniec napełnij probówkę roztworem gradientu izopiknowo-sacharozowego o niskiej gęstości (ok. 6 ml). Polipropylenowe i ultraprzezroczyste rurki z otwartym wierzchem powinny być wypełnione tak bardzo, jak to możliwe (2 lub 3 mm od góry rury) w celu podparcia rury.
  3. Korekta dla Acinetobacter baumannii 17978
    1. Dostosuj dostosowany gradient sacharozy do stosowania z różnymi próbkami bakterii. W przypadku A. baumannii, następujący gradient sacharozy pozwolił na pełniejsze oddzielenie błon (Rysunek 2).
      2 ml 73% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
      4 ml 45% w/v sacharozy, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
    2. Następnie dodać całkowitą frakcję membranową (1 ml), która została ponownie zawieszona w 20% w/v roztworze sacharozy (krok 5.5). Unikaj mieszania frakcji membranowej z roztworem sacharozy, który znajduje się pod nią. Pomiędzy każdą z tych warstw powinny być widoczne podziały.
    3. Na koniec napełnij probówkę roztworem gradientu izopiknowo-sacharozowego o niskiej gęstości (ok. 6 ml). Polipropylenowe i ultraprzezroczyste rurki z otwartym wierzchem powinny być wypełnione tak bardzo, jak to możliwe (2 lub 3 mm od góry rury) w celu podparcia rury.
  4. Próbki należy ultraodwirować za pomocą rotora z wahliwym kubełkiem o temperaturze 288 000 x g i temperaturze 4 °C przez noc.
    nuta: Dla objętości użytych w poprzednich krokach zalecamy czas wirowania od 16 godzin do 23 godzin.
  5. Odetnij koniec końcówki pipety P1000 około 5 mm od punktu. Usuń górną brązową warstwę IM za pomocą pipety. Przenieść frakcję IM do butelki z poliwęglanu w celu ultrawirowania.
  6. Pozostawić około 2 ml roztworu sacharozy powyżej granicy faz 53-73%, aby upewnić się, że dolny biały OM nie jest zanieczyszczony krzyżowo frakcją IM. Powtórz procedurę pipetowania od kroku 6.4 dla frakcji OM (Rysunek 1).
    nuta: Membrany można również zebrać, nakłuwając probówki wirówkowe na dnie za pomocą igły i zbierając membrany w postaci frakcji kroplami.
  7. Wypełnić pozostałą pustkę probówki ultrawirówkowej buforem do przechowywania z izolowaną membraną i wymieszać przez odwrócenie lub pipetowanie. Próbki należy przechowywać na lodzie.
  8. Zebrane teraz umyte i wyizolowane membrany przez ultrawirowanie w temperaturze 184 500 x g przez 1 godzinę i 4 °C.
  9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić membrany przez homogenizację odbitą. Dodaj 500-1000 μl bufora do przechowywania. Próbki należy pobrać do probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml.
  10. Próbki błony bakteryjnej należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

7. Potwierdzenie separacji dwuwarstwowców

UWAGA: Niepełne rozdzielenie dwóch warstw może wystąpić z powodu błędu technicznego lub unikalnego składu otoczki komórkowej niektórych gatunków. Aby potwierdzić separację, zalecamy użycie dwóch niezależnych testów w celu ilościowego określenia stopnia zanieczyszczenia krzyżowego między dwiema warstwami. Pierwszy test wykrywa aktywność enzymatyczną dehydrogenazy NADH, która występuje wyłącznie w IM. Drugi test wykrywa obecność LOS lub LPS, który występuje głównie w OM.

  1. Potwierdzenie, że organizacje są odizolowane od zarządców infrastruktury
    1. Zmierz stężenie białka w każdej izolowanej frakcji błonowej za pomocą testu białka Bradforda.
    2. Dodać objętość próbki odpowiadającą między 50 a 500 μg białka do pustej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Stężenie będzie się różnić w zależności od gatunku, ale 50 μg jest zwykle wystarczające dla Enterobacteriaceae. Dodać odpowiednią objętość 10 mM buforu Tris, aby uzyskać całkowitą objętość 990 μl. Przenieść zawartość do kuwety w celu spektrofotometrii.
    3. Dodać 10 μl roztworu NADH o stężeniu 10 mg/ml do próbki i zmierzyć początkową absorbancję przy 340 nm.
    4. Kontynuuj pomiar absorbancji co 30 s przez 5 minut.
    5. Skompiluj dane i narysuj na wykresie zmianę absorbancji (oś y) w porównaniu ze zmianą w czasie (oś x) dla każdej frakcji membrany (Rysunek 3).
  2. Potwierdzenie, że zarządcy infrastruktury są odizolowani od organizacji pomiarowych
    1. Dodać objętość próbki odpowiadającą między 50 a 500 μg białka do pustej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Stężenie będzie się różnić w zależności od gatunku bakterii, ale 50 μg jest zwykle wystarczające dla Enterobacteriaceae. Napełnić do końcowej objętości 100 μl roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, zwanym dalej fazą wodną.
    2. Dodać 5 μl proteinazy K (zapas 800 j./ml) do fazy wodnej i inkubować przez noc w temperaturze 59 °C.
    3. Ogrzewać 10 ml podwielokrotności trinasyconego fenolu przez 10 minut w temperaturze 68 °C.
    4. Odwirować próbki fazy wodnej, które zostały potraktowane proteinazą K i dodać "gorący" fenol nasycony tris w stosunku 1:1 z fazą wodną, energicznie wirować i inkubować w temperaturze 68 °C przez 10 minut.
    5. Przenieść mlecznobiałe próbki z temperatury 68 °C do łaźni lodowo-wodnej i inkubować przez 10 minut.
    6. Odwirować próbki o masie 2 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki i przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C, jeżeli próbka nie ma być natychmiast użyta.
    8. Rozcieńczyć próbki w buforze ładującym SDS i załadować studzienki 4-20% żelem gradientowym tris-glicyny.
    9. Elektroforezę przez 45 minut lub do momentu, gdy czoło barwnika znajdzie się na dnie żelu.
    10. Zabejcuj żel za pomocą zestawu do barwienia LPS zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta technika zapewnia skuteczny sposób izolowania IM i OM dla bakterii Gram-ujemnych. Zarys całej procedury zilustrowano (Rysunek 1). Ogólnie rzecz biorąc, normalizacja kultur do OD600 wynoszącego 0,6-0,8 w 1 l pożywki lub zbiór między 6,0 a 8,0 x 1011 komórek bakteryjnych zapewni zebranie odpowiedniej ilości materiału błonowego do późniejszej separacji.

Po lizie bakterii i ultraodwirowaniu lizatu, na dnie probówki ultrawirówki pojawi się lepk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta będzie nadal pomagać naukowcom w zrozumieniu roli otoczki komórkowej w fizjologii i patogenezie bakterii. Po sekwencyjnych etapach ultrawirowania można uzyskać oczyszczoną frakcję całkowitą, wewnętrzną i OM. Błony te można badać w izolacji w celu przetestowania hipotez związanych z lokalizacją i funkcją białek błonowych, transportem i transportem przez peryplazmę oraz składem poszczególnych dwuwarstw w różnych warunkach środowiskowych. Badania biologiczne badające udział poszczególnych składników OM w patogenez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez P20GM10344 i R01AI139248 przyznana Z. D. Dalebroux.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelki wirówkowe 1 l, PC/PPCO, super speed, z nakrętką uszczelniającą, NalgeneVWR525-0466
Butelka do przechowywania 1 l Pyrex z nakrętką wysokotemperaturowąVWR10416-312
Kolba Erlenmeyera 2 000 mL, wąska szyjkaVWR10545-844
4-20% mini prefabrykowane żele białkowe PROTEAN, 12-dołkowe4561095BIORAD
4x próbka Laemmli Bufor 10 mlBIORAD1610747
50 ml sterylne probówki wirówkowe z polipropylenuVWR89049-174
Homogenizator tkanek 7 ml z dwoma szklanymi tłuczkamiVWR71000-518
Zespół butelki z poliwęglanu o pojemności 70 mlBeckman Coulter Life Sciences355622
Agar w proszkuVWRA10752
B10P pH-metr z sondą pHVWR89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (wersja stołowa)ThermoFisher Scientific50136146
Nukleaza benzonazowaMilliporeSigma70746-3
EDTA sól disodowa dwuwodna 99,0-101,0%, kryształy, ultraczysty Klasa bioodczynnika Klasa biologii molekularnej, J.T. BakerVWR4040-01
EmulsiFlex-C3Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Rotor o stałym kącienachylenia ThermoFisher Scientific75006526
Kwas solny 6,0 NVWRBDH7204
IBI Scientific Wytrząsarka orbitalnaFischer Scientific15-453-211
LB Młynek do bulionuVWR214906
lizozym, białko jaja, ultra czysty gatunekVWRVWRV0063
Chlorek magnezu sześciowodnySigma AldrichM2670
NADHSigma Aldrich10107735001
Optima XPN-80 - IVDBeckman Coulter Life SciencesA99839
Pharmco Products  CZYSTY ALKOHOL 200 PROOF GL 4/CS Fischer ScientificNC1624582
Roztwór fenolu, zrównoważony 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, BioReagent, do biologii molekularnejSigma - MilliporeP4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Zestaw testowyThermofisher23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolisacharyd Żel BejgdyThermofisherP20495
Proteacease -50, bez EDTAG Biosciences786-334
Proteinaza K, klasa biologii molekularnejNew England BiolabsP8107S
Wodorotlenek sodu ≥ 99,99%Wirówka VWRAA45780-22
Sorval RC 6 PlusThermoFisher Scientific36-101-0816
MiliporeSigmaSX1075-3
SW 41 Ti Wirnik wahadłowyBeckman Coulter Life Sciences331362
Tris(hydroksymetylo)aminometan (TRIS, Trometamol) ≥ 99,9% (sucha masa), ultraczysty bioodczynnik klasy biologii molekularnej, J.T. BakerVWRJT4109-6
Type 45 Ti Tytanowy wirnik o stałym kącieBeckman Coulter Life Sciences339160
Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mmBeckman Coulter Life Sciences344059
Vortex-Genie 2VWR102091-234

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414(2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153(2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. , (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gram negative BacteriaInner MembraneOuter MembraneSucrose Density GradientMembrane FractionationUltracentrifugationAcinetobacter baumanniiLipooligosaccharidesNADH Dehydrogenase AssayMembrane Purity

Powiązane artykuły