Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60523

⸱

27 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2School of Life Science, University of Science and Technology of China, 3State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Streszczenie

T Follicular Helper (Tfh) to niezależny podzbiór limfocytów T CD4+, wyspecjalizowany w dostarczaniu pomocy w rozwoju centrum rozrodczego (GC) i wytwarzaniu przeciwciał o wysokim powinowactwie. W zakażeniu wirusem grypy indukowane są silne odpowiedzi komórek B Tfh i GC, aby ułatwić skuteczną eliminację wirusa, co zapewnia wykwalifikowany model myszy do badania związanego z Tfh. W tym artykule opisaliśmy protokoły wykrywania podstawowej odpowiedzi immunologicznej związanej z Tfh podczas infekcji wirusem grypy u myszy. Protokoły te obejmują: donosowe inokulowanie wirusa grypy; barwienie cytometrią przepływową i analiza poliklonalnych i swoistych antygenowo komórek Tfh, komórek GC B i komórek plazmatycznych; wykrywanie immunofluorescencji GCs; test immunoenzymatyczny (ELISA) przeciwciała swoistego dla wirusa grypy w surowicy. Testy te zasadniczo określają ilościowo różnicowanie i funkcję komórek Tfh w zakażeniu wirusem grypy, zapewniając w ten sposób pomoc w badaniach nad wyjaśnieniem mechanizmu różnicowania i strategii manipulacji.

Wprowadzenie

W ostatnim dziesięcioleciu, liczne badania koncentrowały się na nowo zidentyfikowanym podzbiorze limfocytów T CD4+, podzbiorze komórek Tfh, ze względu na jego kluczowe role w rozwoju centrum zarodkowego (GC) B. Chłoniak z komórek B 6 (Bcl6), który jest głównie uważany za represor genów, jest czynnikiem definiującym linię komórek Tfh dla dowodu, że ektopowa ekspresja Bcl6 jest wystarczająca do napędzania różnicowania Tfh, podczas gdy niedobór Bcl6 powoduje zanik różnicowania Tfh1,2,3. W przeciwieństwie do innych podzbiorów pomocniczych T CD4 + pełniących swoją funkcję efektorową poprzez migrację do miejsc zapalenia, komórki Tfh zapewniają komórkom B pomoc głównie w strefie pęcherzykowej komórek B śledziony i węzła chłonnego. Cząsteczki kostymulujące ICOS i CD40L odgrywają znaczącą rolę w interakcji między komórkami B Tfh i GC. Podczas różnicowania Tfh ICOS przesyła niezbędne sygnały z pokrewnych komórek B, a także działa jako receptor odbierający sygnały migracji od komórek B osób postronnych w celu lokalizacji strefy komórek B4,5. CD40L jest mediatorem sygnałów z komórek Tfh dla proliferacji i przeżycia limfocytów B6. Innym czynnikiem pełniącym podobną rolę jak CD40L jest cytokina IL21, która jest wydzielana głównie przez komórki Tfh. IL21 bezpośrednio reguluje rozwój komórek GC B i produkcję przeciwciał o wysokim powinowactwie, ale jej rola w różnicowaniu Tfh jest nadal kontrowersyjna7,8. PD-1 i CXCR5, które są obecnie najczęściej używane do identyfikacji komórek Tfh w analizie cytometrii przepływowej, również odgrywają znaczącą rolę w różnicowaniu i funkcji tego podzbioru. CXCR5 jest receptorem chemokiny pęcherzykowej komórek B i pośredniczy w lokalizacji komórek Tfh w pęcherzykach komórek B9. PD-1 jest teraz identyfikowany, ponieważ nie tylko ma funkcję kierowania pęcherzykami, ale także przekazuje krytyczne sygnały w procesie dojrzewania powinowactwa komórek GC B10. Opierając się na tych odkryciach, ocena ekspresji tych cząsteczek może zasadniczo odzwierciedlać dojrzewanie i funkcję komórek Tfh.

GC jest indukowaną przejściową strukturą mikroanatomiczną w wtórnych narządach limfatycznych i wysoce zależną od komórek Tfh, dlatego jest doskonałym odczytem do oceny odpowiedzi Tfh. W GC, po otrzymaniu sygnałów, w których pośredniczą cytokiny i cząsteczki kostymulujące, limfocyty B podlegają zamianie klas i hipermutacji somatycznej w celu wytworzenia przeciwciał o wysokim powinowactwie11. Różnicowa zamiana klas przeciwciał zachodzi w niszy cytokin różnicowych, w której IL4 i IL21 indukują przełączanie klasy IgG1, podczas gdy IFNγ indukuje przełączanie klasy IgG212. Komórki plazmatyczne są producentami wydzielanych przeciwciał i są komórkami ostatecznie zróżnicowanymi. Podobnie jak w przypadku komórek Tfh, rozwój limfocytów B w GC wiąże się z dynamiczną ekspresją wielu istotnych cząsteczek. Na podstawie obecnego badania, komórki GC B można zidentyfikować jako komórki B220 + PNA + Fas + lub B220 + GL7 + Fas + i komórki plazmatyczne, w porównaniu z ich prekursorami, regulują w dół ekspresję B220 i zwiększają ekspresję CD138 13. Co więcej, obie te cechy mogą być wykryte w cytometrii przepływowej i analizie immunofluorescencyjnej, co stanowi właściwą ocenę odpowiedzi GC.

Silne odpowiedzi komórkowe i humoralne są indukowane w infekcji wirusem grypy, przy czym komórki Tfh i Th1 dominują nad odpowiedzią limfocytów T CD4+14, co czyni go idealnym modelem do badania różnicowania komórek Tfh. Grypa A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), która jest powszechnie stosowanym szczepem przystosowanym do myszy, jest często używana w tym badaniu14,15,16. Tutaj opisujemy kilka podstawowych protokołów testu istotnego dla badania Tfh w zakażeniu wirusem grypy: 1) donosowa inokulacja wirusa PR8; 2) swoiste dla antygenu komórki Tfh, GC B i komórki plazmatyczne oraz detekcja IL21 za pomocą cytometrii przepływowej; 3) wizualizacja histologiczna GKK; 4) wykrywanie miana przeciwciał swoistych dla antygenu w surowicy za pomocą testu ELISA. Protokoły te zapewniają niezbędne techniki dla nowych badaczy w badaniach związanych z Tfh.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Pasteura w Szanghaju, Chiny. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w oparciu o protokoły na zwierzętach zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

UWAGA: Infekcja wirusowa myszy i izolacja narządów powinna być przeprowadzona w warunkach ABSL2.

1. Inokulacja wirusa grypy PR8 i rejestracja wagi myszy

  1. Przygotuj 8-tygodniowego samca myszy C57BL/6 do infekcji w pokoju ABSL2.
    UWAGA: Ten protokół jest również odpowiedni w eksperymentach na samicach myszy.
  2. Rozcieńczanie wirusa PR8: wyjąć wirusa z zamrażarki o temperaturze -80 °C i inkubować na lodzie, aż rozpuści się w płyn. Wirus podstawowy należy dokładnie przemieszać i rozcieńczyć go do 2 PFU/μl sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) we wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 ml.
  3. Znieczulenie myszy: zważyć każdą mysz i obliczyć objętość (4-krotność (μL) masy myszy (g)) pentobarbitalu sodu (2 mg/ml), który należy zastosować. Obliczoną objętość pentobarbitalu sodu wstrzyknąć dootrzewnowo.
    UWAGA: Ten krok ma na celu sprawienie, aby myszy oddychały równomiernie i spokojnie, tak aby można było zaszczepić donosowo dokładne miano wirusa. Zbyt szybkie lub wolne bicie serca wskazuje na niewłaściwe znieczulenie. Ponadto zaleca się stosowanie maści weterynaryjnej, aby uniknąć suchości oczu.
  4. Inokulacja donosowa: dokładnie odwiruj rozcieńczonego wirusa PR8. Odpipetować 10 μl i ostrożnie wykonać inokulację donosową z jednej strony, kropla po kropli. Po zakończeniu inokulacji wszystkich myszy w jednej klatce (maksymalnie 5 myszy) po tej stronie, powtórz inokulację po drugiej stronie (utrzymuj spokojny i stabilny oddech myszy przez cały czas szczepienia). Każda mysz jest zainfekowana łącznie 40 PFU wirusa PR8.
  5. Umieść myszy w pozycji leżącej mostka w ciepłych klatkach, aby uzyskać lepsze ożywienie.
  6. Monitoruj wagę myszy codziennie przez 10 dni. (Dzień zakażenia jest rejestrowany jako Dzień 0).

2. Izolacja limfocytów ze śledziony i węzła chłonnego śródpiersia (mLN)

  1. Eutanazja myszy: umieść myszy w małej komorze i poddaj je eutanazji, spokojnie pompując do CO2 z dna komory. Wyjmij myszy, gdy się nie poruszają i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby upewnić się, że myszy całkowicie umrą. Zanurz myszy w 75% etanolu i przenieś do kaptura bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Unieruchamić myszy za pomocą igieł preparacyjnych na chłonnej, pokrytej papierem płytce piankowej do preparacji. Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej brzucha i tylnych nóg nożyczkami preparacyjnymi i rozciągnij skórę pęsetą. Unieruchomić rozciągniętą skórę za pomocą igieł preparacyjnych.
  3. Przygotuj dwie 6-centymetrowe naczynia dla każdej myszy i trzymaj je na lodzie. Umieść sitko o wielkości 70 μm w każdym naczyniu i dodaj 5 ml DMEM uzupełnionego 1% płodową surowicą bydlęcą (DMEM (1% FBS))
  4. Izolacja śledziony: przeciąć otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną za pomocą nożyczek preparacyjnych. Weź śledzionę i włóż ją do przygotowanego naczynia.
  5. Izolacja mLN: przeciąć przeponę i dolną część żebra klatki w okolice grasicy. Odciągnij żebro na bok i przypnij je igłami do preparowania, aby odsłonić klatkę piersiową. Odciągnij płuco na prawą stronę i za pomocą pęsety pobierz mLN, pod sercem i w pobliżu brzusznej strony tchawicy.
  6. Umieść mLN w przygotowanym naczyniu.
  7. Otrzymać zawiesiny jednokomórkowe: delikatnie oprzeć śledzionę lub mLN za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml przez sitko do komórek o średnicy 70 μm. Przepłucz sitko komórkowe 1 ml świeżego DMEM (1% FBS). Zawiesić zawiesinę komórek i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  8. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 1 ml DMEM (1% FBS).
  9. Dokładnie zawiesić osad komórkowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Dodaj 4 ml DMEM (1% FBS) do zawiesin komórek śledziony i trzymaj je na lodzie do następujących operacji.
    UWAGA: Konieczne jest ponowne zawieszenie osadu komórkowego za pomocą 1 ml pożywki, a nie 5 ml, w celu całkowitego odizolowania pojedynczych komórek od osadu.
    Od tego kroku wszystkie operacje mogą być wykonywane w zwykłym laboratorium.
  10. Zliczanie komórek śledziony
    1. Zawieś komórki, kilkakrotnie obracając rurki w górę iw dół. Weź 10 μl do 90 μl buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 155mM NH4Cl). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 minuty i dodać 900 μl zimnego PBS w celu zakończenia reakcji.
    2. Wirować przy 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Zawiesić w 100 μl zimnego PBS. Weź 10 μl komórek do 10 μl 0,4% w/v błękitu trypanowego i wyjmij 10 μl z mieszaniny do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru.
    3. Obliczanie: obliczanie komórek jak zwykłą metodą. Krótko mówiąc, policz numery komórek w dwóch ukośnych kwadratach narożnych na hemocytometrze i uzyskaj N1, N2 dla każdego kwadratu narożnego. Stężenie komórek w 5-mililitrowej zawiesinie komórek należy obliczyć jako (N1+N2)/2 x 10,4/ml.

3. Barwienie immunologiczne poliklonalnych komórek Tfh za pomocą PD-1 i CXCR5

  1. Barwienie przeciwciałem anty-CXCR5 z biotyną.
    1. Ponownie zawiesiny komórek należy zawiesić poprzez obracanie rurki w górę iw dół. Weź 2 x 106 komórek do probówki FACS i dodaj 2 ml buforu barwiącego (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Umyć przez wir na urządzeniu oscylacyjnym vortex.
    2. Wirować przy 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant przez wylanie cieczy i dwukrotnie zanurzyć otwór probówki na bibule chłonnej.
    3. Poluzuj osad komórkowy z pozostałościami płynu, stukając w spód probówki. Umieść probówkę w uchwycie probówki na lodzie.
      UWAGA: Objętość płynnej pozostałości wynosi około 25 μl.
    4. Dodać 0,2 μl anty-mysiego CD16/CD32 (blokera receptora Fc) do każdej probówki. Wirować, delikatnie stukając w dno rurki i inkubować na lodzie przez 10 min.
      UWAGA: Przygotować mieszaninę przeciwciał dla wielu próbek, rozcieńczając 5 μl buforu barwiącego dla każdej probówki. Recepturę mieszaniny należy przygotować przez rozcieńczenie (n/10+1) x 0,2 μl blokera receptora Fc do (n/10+1) x 5 μL buforu barwiącego i dodanie 5,2 μl mieszaniny do każdej probówki.
    5. Dodaj 0,3 μl biotyny-anty myszy CXCR5 do pozostałości 30 μl buforu barwiącego dla każdej probówki i przekręć wir, stukając w dno probówki.
      UWAGA: Przygotować mieszaninę zgodnie z opisem w kroku 3.1.4.
    6. Inkubować na lodzie przez 1 godzinę z delikatnie zawieszającymi się komórkami, stukając w probówkę po 30 min.
      UWAGA: Wir po 30 minutach ma na celu uniknięcie zagregowań komórek w celu lepszego barwienia.
    7. Dodaj 2 ml buforu barwiącego i zawiruj na urządzeniu do oscylacji wirowej. Wirować przy 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant zgodnie z opisem w kroku 3.1.2. Wiruj, stukając w rurkę i inkubuj na lodzie w celu późniejszego barwienia.
  2. Barwienie innymi markerami powierzchniowymi.
    1. Przygotować mieszaninę przeciwciał (tabela 1) zgodnie z opisem w kroku 3.1.4.
    2. Dodać mieszaninę przeciwciał do każdej probówki. Wirować, stukając w dno rurki i inkubować na lodzie przez 30 minut.
    3. Umyj komórki 2 ml buforu barwiącego. Wirować przy 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odrzucić sklarkatent i dodać 400 μl buforu barwiącego. Odwiruj rurkę na urządzeniu do oscylacji wirowej i trzymaj rurkę w ciemności do czasu analizy cytometrii przepływowej.

4. Barwienie immunologiczne komórek Tfh specyficznych dla NP wirusa grypy PR8

UWAGA: Ten protokół barwienia komórek Tfh specyficznych dla NP pochodzi z poprzednich badań15,17.

  1. Przeprowadzić barwienie biotyną-CXCR5 zgodnie z opisem w kroku 3.1, z wyjątkiem tego, że liczba komórek pobrana do barwienia wynosi 3 x 106, aby zarejestrować wystarczającą liczbę komórek specyficznych dla antygenu w cytometrii przepływowej.
  2. Dodać 0,3 μl tetrameru MHC klasy II (NP311-325) sprzężonego z APC-IAbNP311-325 do probówki z 3.1.7. Przygotować mieszaninę dla wielu próbek, jak w kroku 3.1.4
    UWAGA: Ważne jest, aby wybarwić tetramer przed dodaniem przeciwciała anty-CD4, ponieważ wiązanie między CD4 a przeciwciałem anty-CD4 zakłóciłoby optymalne barwienie tetrameru.
  3. Zawiesić mieszaninę komórek, delikatnie stukając w probówkę i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: Przykryj mokry papier na wylocie rurek, aby zmniejszyć parowanie
  4. Dodać mieszaninę innych znaczników powierzchniowych (tabela 1) i kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Umyj i ponownie zawieś ogniwa zgodnie z opisem w krokach 3.2.3 i 3.2.4.

5. Barwienie immunologiczne Bcl6 w poliklonalnych komórkach Tfh

  1. Wykonać barwienie markerami powierzchniowymi (Tabela 2) zgodnie z opisem w sekcji 3, z wyjątkiem ostatniego przemycia 2 ml PBS, zamiast buforu do barwienia.
  2. Wirować przy 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek, delikatnie stukając w dno probówki.
  3. Dodaj 300 μl 3,7% roztworu formaldehydu (rozcieńczonego z 37% formaldehydu z PBS) do probówki w celu utrwalenia komórek. Wirować na urządzeniu oscylacyjnym wirowym i inkubować w temperaturze RT przez 20 minut.
  4. Dodać 2 ml buforu barwiącego do przemywania i odwirowywać w temperaturze 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki, delikatnie stukając w probówkę.
  5. Dodać 300 μl 0,2% Triton-X 100 i ponownie zawiesić komórki za pomocą wiru na urządzeniu do oscylacji wirowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  6. Dodaj 2 ml buforu barwiącego do prania. Wirować przy 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki, delikatnie stukając w dno probówki.
  7. Dodać 1,5 μl przeciwciała PE-anty-Bcl6 do każdej probówki. Delikatnie stukaj w dno probówki w celu ponownego wymieszania mieszaniny i inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie delikatnie stukaj w probówkę co 30 min.
    UWAGA: Przykryj mokry papier na wylocie probówek, aby zmniejszyć parowanie mieszaniny.
  8. Dodać do probówki 2 ml PBS uzupełnionego 0,01% Triton-X 100. Wirować i odwirowywać przy 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Powtórz pranie jak w kroku 5.8. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 400 μl buforu barwiącego. Utrzymuj komórki w ciemności na lodzie do czasu analizy cytometrii przepływowej.

6. Barwienie wewnątrzkomórkowe IL21

  1. Stymuluj komórki za pomocą PMA (12-mirystynian 13-octanu forbolu) i jonomycyny.
    1. Pobrać 2 x 106 komórek z zawiesiny komórek śledziony i odwirować w sile 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 500 μl kompletnej pożywki z komórek T. Przenieś komórki do płytki 24-dołkowej.
    2. Dodać 20 nmol PMA i 2 μmol jonomycyny do 500 μl kompletnego podłoża18 i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
    3. Dodać roztwór przygotowany w kroku 6.2 do zawiesiny komórek w płytce 24-dołkowej i wymieszać, wstrząsając płytką. Ustaw niestymulowaną kontrolę, dodając 500 μl kompletnej pożywki z limfocytów T bez dodatku PMA i jonomycyny do komórek. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C przez 4 godziny.
    4. Dodać 10 μmol BFA (Brefeldin A, rozpuszczony w metanolu) do każdej studzienki, aby zablokować transport białek za pośrednictwem aparatu Golgiego. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze komórkowym i inkubować przez 2 godziny.
  2. Wykonaj barwienie markerem powierzchni komórki.
    1. Zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść komórki do probówki FACS. Dodać 1 ml buforu barwiącego do probówki i odwirowywać przy 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Wykonaj barwienie blokerem receptora Fc zgodnie z krokiem 3.1.4.
    3. Przeprowadzić barwienie markerami powierzchni komórek (Tabela 3) zgodnie z opisem w krokach 3.2.1 do 3.2.3, z wyjątkiem mycia komórek 2 ml PBS.
    4. Wirować przy 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki, stukając w dno probówki.
  3. Dodać 0,2 μl odczynnika z zestawu do barwienia żywych/martwych komórek Aqua Dead Cell i inkubować probówkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby przeprowadzić barwienie martwych komórek.
  4. Dodaj 2 ml PBS do probówki i zawiruj na urządzeniu do oscylacji wirowej. Wirować przy 350 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  5. Wykonaj utrwalanie komórek zgodnie z opisem w krokach 5.3 i 5.4.
  6. Dodać 300 μl buforu barwiącego w celu ponownego zawieszenia komórek i przechowywać probówki w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc. Wirować przy 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia supernatantu.
    UWAGA: Ten krok można pominąć i przejść do kroku 6.7 bezpośrednio po kroku 6.5.
  7. Dodaj 1 ml buforu saponin (bufor barwiący uzupełniony 0,2% (w/v) saponiny) do probówki i przeprowadź wir na urządzeniu do oscylacji wirowej. Inkubować na lodzie przez 20 minut, aby przeprowadzić przepuszczalność komórek.
  8. Wirować przy 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  9. Do każdej probówki dodać 0,5 μl ludzkiego receptora Fc-IL21. Przygotować mieszaninę przeciwciał do wielokrotnego jak w kroku 3.1.4, z wyjątkiem tego, że rozcieńczyć przeciwciało buforem saponinowym zamiast buforem barwiącym.
  10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie stukając w dno probówki, aby ponownie zawiesić komórki po 30 minutach.
  11. Dodać 2 ml buforu saponin do przemywania komórek i odwirowywać przy 500 x g przez 6 minut. Odrzucić supernatant i powtórzyć płukanie raz.
  12. Dodaj 0,1 μl APC-anty-ludzkiego Ig(H+L) do każdej probówki. Przygotować mieszaninę dla wielu próbek zgodnie z krokiem 3.1.4, z wyjątkiem rozcieńczenia przeciwciała buforem saponinowym zamiast buforu barwiącego.
  13. Inkubować próbki na lodzie przez 30 minut i przemyć zgodnie z krokiem 6.11.
  14. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 400 μl buforu barwiącego. Próbkę należy przechowywać w ciemności na lodzie do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.

7. GC B i barwienie komórek plazmatycznych

  1. Pobrać komórki i przeprowadzić barwienie przeciwciałami anty-receptora Fc w krokach od 3.1.1 do 3.1.4.
  2. Barwienie markerami powierzchniowymi (tabela 4) należy przeprowadzić w krokach od 3.1.5 do 3.1.7, z tym wyjątkiem, że czas inkubacji wynosi 30 minut zamiast 1 godziny.
  3. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 400 μl buforu barwiącego. Próbki należy przechowywać w ciemności na lodzie do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.

8. Izolacja surowicy od krwi

  1. W 14 dniu po zakażeniu (d.p.i 14) należy pobrać krew z żyły twarzowej i przechowywać próbki krwi w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Wykonaj pobranie krwi w stanie ABSL2 i od tego kroku wszystkie procedury mogą być wykonywane w zwykłym laboratorium.
  2. Odwirować krew o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyizolować surowicę za pomocą pipety o pojemności 200 μl, aby uniknąć zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi. Porcjować do 3 probówek dla każdej próbki i przechowywać je w temperaturze -80°C.

9. Test miana przeciwciał swoistych dla HA za pomocą testu ELISA

  1. Pokryj płytki ELISA 50 μl roztworu białka HA o stężeniu 2 μg/ml na studzienkę i inkubuj je w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Umyj trzykrotnie 200 μl rozcieńczonego PBS 0,05% tween (PBST). Dodać 100 μl 5% odtłuszczonego mleka rozcieńczonego PBST do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.
  3. Rozcieńczanie surowicy i inkubacja: przygotować 3% BSA w PBS jako bufor do rozcieńczania. Rozcieńczyć surowicę w buforze do rozcieńczania w stosunku 1:50, 1:150, 1:450 ...... do 1:36450 (zalecane jest 3-krotne rozcieńczenie seryjne). Dodać 50 μl rozcieńczonej surowicy do każdego dołka i inkubować w lodówce o temperaturze 4°C przez noc.
  4. Wyrzuć surowicę i szybko umyj studzienki raz, dodając 200 μl PBST do każdej studzienki (delikatnie wstrząsnij, a następnie wyrzuć). Następnie powoli umyj płytki na wytrząsarce 200 μl PBST trzy razy przez 5 minut każde.
  5. Dodać 100 μl znakowanego HRP przeciwciała drugorzędowego swoistego dla całkowitych IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, rozcieńczonego PBST) i inkubować w temperaturze RT przez 1 godzinę. Przemyć płytki PBST zgodnie z opisem w ppkt 9.4.
  6. Wyjąć równą objętość buforu A i buforu B (TMB) z magazynu w temperaturze 4 °C i rozgrzać przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Wymieszać A i B i dodać 100 μl TMB do każdej studzienki i inkubować je przez 10-30 minut w temperaturze sotej, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: To jest krótki opis instrukcji obsługi zestawu odczynników do substratów TMB (BD,555214).
  7. Odpipetować 100 μL 2MH 2SO4 do każdego dołka, aby zakończyć reakcję. Odczytaj wartość OD450 za pomocą przyrządu.
  8. Analiza danych: uzyskaj końcową wartość OD450, odejmując sygnał tła (wartość OD450 pustej studni). Narysuj krzywą odpowiadającą izotypowi przeciwciała każdej próbki ze współczynnikiem rozcieńczenia na osi X i wartością OD450 na osi Y.

10. Histologia

  1. Odizoluj śledziony w DPI 10. Utrwalić je w 3,7% roztworze formaldehydu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić bufor utrwalający i myć PBS przez 5 minut na wytrząsarce trzy razy.
  2. Odwodnić śledziony w PBS (10% sacharozy) w temperaturze 4°C przez 1 godzinę, a następnie odwodnić je w PBS (30% sacharozy) w temperaturze 4°C, delikatnie potrząsając, aż śledziony opadną na dno probówki o pojemności 15 ml.
  3. Wyjmij odwodnione śledziony, zanurz je w masie o optymalnej temperaturze cięcia i poddaj kriosekcji.
  4. Wstępnie schłodzić aceton w temperaturze -20°C. Inkubować skrawki tkanki ze wstępnie schłodzonym acetonem przez 10 minut. Przemyć tkankę trzykrotnie PBS.
  5. Przepuszczalność skrawków tkanek za pomocą PBS zawierającego 0,2% Triton X-100 przez 20 minut i trzykrotne mycie ich PBS.
  6. Zablokować niespecyficzne wiązanie z PBS zawierającym 10% normalnej surowicy koziej (bufor blokujący) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i raz przemyć skrawki tkanki PBS.
  7. Zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą zestawu blokującego STREPTAWIDYNĘ/BIOTYNĘ.
    UWAGA: Nie pozwól, aby próbki wyschły od tego kroku.
  8. Barwienie przeciwciałem pierwszorzędowym: ostrożnie dodać rozcieńczoną buforem blokującą biotynę-PNA (25 μg/ml) i szczurzą anty-mysią IgD (2,5 μg/ml) na skrawki tkanki. Skrawki tkanek inkubować przez noc w komorze mokrej w zamrażarce o temperaturze 4 °C.
  9. Szybko umyj skrawki chusteczki raz PBST. Szybko umyj skrawki tkanek w PBST, potrząsając powoli przez 5 minut. Powtórz pranie trzy razy.
  10. Rozcieńczyć przeciwciała Alexa Fluor 488-streptawidyna (1:500) i Alexa Fluor 555-koza-anty szczurze IgG (1:500) z buforem blokującym i ostrożnie dodać je do skrawków tkanki
  11. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  12. Umyj skrawki chusteczki zgodnie z krokiem 10.8 i ostrożnie zamontuj z roztworem przedłużającym. Ostrożnie przykryj tkankę szkiełkami nakrywkowymi i trzymaj ją w ciemności w temperaturze 4°C do czasu analizy konfokalnej.
  13. Przeanalizuj wielkość reakcji GC, licząc liczby GC na rozmiar obszaru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystyka chorobowości myszy w zakażeniu wirusem grypy
Po zakażeniu wirusem grypy myszy są mniej aktywne i doświadczają anoreksji z powodu choroby, co objawia się silną utratą masy ciała – powszechnie stosowanym objawem monitorowania chorobowości myszy19. Jak pokazano na Rysunku 1a, myszy zakażone wirusem PR8 zaczęły tracić na wadze w 6. dniu, osiągnęły największy poziom utraty w 8. dniu, a w 10. dniu wróciły do początkowej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na wyspecjalizowane role w zapewnianiu pomocy limfocytów B w wytwarzaniu przeciwciał o wysokim powinowactwie, komórki Tfh zostały szeroko przebadane w mechanizmach różnicowania i manipulacji, aby zapewnić nowe strategie projektowania szczepionek. Zakażenie wirusem grypy indukuje silne odpowiedzi komórek B Tfh i GC, dzięki czemu jest odpowiednim modelem dla tej dziedziny badań. W niniejszej pracy opisano protokoły zakażenia wirusem grypy przez inokulację donosową, ocenę odpowiedzi związanej z Tfh za pomocą cyto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy personelowi zakładu cytometrii przepływowej, zakładu ABSL2 i zakładu SPF dla zwierząt Instytutu Pasteura w Szanghaju za ich pomoc techniczną i porady. Prace te były wspierane przez następujące granty: Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (XDB29030103), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFA0502202), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (31570886).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Immunologiczne barwienie komórek Tfh, komórek Tfh swoistych dla NP i Bcl-6
37% formaldehyduSigmaF1635
Anti-CD16/32 myszThermo Fisher Scientific14-0161-86
APC-sprzężony-IAbNP311-325 Tetramer MHC klasy IINIH
Bcl-6 PEBiolegend358504klon:7D1
Biotyna-CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82klon: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82klon: GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42klon: IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82klon: IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150klon: MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070klon: 7E.17G9
PD1 PE / Cy7Biolegend135216klon: 29F.1A12
Streptawidyna BV421BD Pharmingen563259
Streptawidyna PEBD Pharmingen554081
Barwienie wewnątrzkomórkowe IL21
37% formaldehydSigmaF1635
anty-ludzki IgGJackson ImmunoResearch Laboratories109-605-098
Brefeldin ASigmaB6542
ludzki receptor FCc IL-21R& System D
SigmaI0634
Żywy/martwy zestaw do barwienia Aqua Dead CellThermo Fisher ScientificL34966
PMASigmaP1585
SaponinaMP102855
GC B i barwienie komórek plazmatycznych
B220 APCThermo Fisher Scientific17-0452-81klon: RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070klon: 281-2
CD95 (FAS) PE / Cy7Klon 557653 Pharmingen: Jo2
IgD eFluor 450Thermo Fisher Scientific48-5993-82klon: 11-26c
PNA FITCSigmaL7381
Test miana przeciwciał swoistych dla HA za pomocą ELISA
PR8-HASino Biological11684-V08H
BSASSBC
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Koza anty mysie IgM (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Kozioł anty mysz IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Koza anty mysia IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Kozioł anty mysz IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
TMB Zestaw odczynników substratowychBD Pharmingen555214
Histology
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgGLife TechnologyA21434
anty-mysie IgDBiolegend405702
biotynylowane laboratoria wektorowe PNAB-1075
rozcieńczony Alexa Fluor 488-streptawidynaLife TechnologyS11223
normalna surowica koziaSouthernBiotech0060-01
Odczynnik przeciw blaknięciu Pro-long goldThermo Fisher ScientificP3630
Zestaw blokujący STREPTAWIDYNĘ/BIOTYNĘVector laboratoriesSP-2002
jonomycyna

Bibliografia

  1. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  3. Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  4. Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
  5. Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
  6. Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
  7. Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
  8. Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
  9. Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
  10. Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
  11. Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
  12. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
  13. Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
  14. Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
  15. Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495(2014).
  16. He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
  17. León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
  18. Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
  19. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  20. Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
  21. Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  22. Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
  23. Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
  24. Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza cytometrycznabarwienie CXCR5test ELISAdetekcja immunofluorescencyjnaizolacja węzłów chłonnychzawiesina komórek śledzionyprotokół inokulacji wirusem
Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.