Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy prostą i tanią metodę, która pozwala na ilościowe określenie komórek nowotworowych adhezji do kriosekcji węzłów chłonnych (LN). Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo wiązania komórek nowotworowych do miąższu LN.

Streszczenie

Węzły chłonne drenujące guz (LN) nie są jedynie filtrami odpadów wytwarzanych przez guz. Są one jednym z najczęstszych regionalnych miejsc tymczasowego pobytu rozsianych komórek nowotworowych u pacjentów z różnymi typami raka. Wykrycie tych komórek nowotworowych znajdujących się w LN jest ważnym biomarkerem związanym ze złym rokowaniem i decyzjami dotyczącymi leczenia uzupełniającego. Ostatnie modele mysie wykazały, że komórki nowotworowe znajdujące się w LN mogą być istotnym źródłem komórek złośliwych dla odległych przerzutów. Zdolność do ilościowego określenia adhezji komórek nowotworowych do miąższu LN jest krytycznym wskaźnikiem w badaniach eksperymentalnych, które koncentrują się na identyfikacji genów lub szlaków sygnałowych istotnych dla rozprzestrzeniania się limfy/przerzutów. Ponieważ LN są złożonymi strukturami 3D o różnorodnym wyglądzie i składzie w skrawkach tkanek w zależności od płaszczyzny przekroju, ich matryce są trudne do eksperymentalnego odtworzenia in vitro w całkowicie kontrolowany sposób. Tutaj opisujemy prostą i niedrogą metodę, która umożliwia ilościowe określenie adhezji komórek nowotworowych do kriosekcji LN. Korzystając z odcinków szeregowych tego samego LN, dostosowujemy klasyczną metodę opracowaną przez Brodta do użycia nieradioaktywnych znaczników i bezpośredniego zliczania liczby przylegających komórek nowotworowych na powierzchni LN. Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo do miąższu LN, co jest sugestywnym dowodem na zmiany molekularne w powinowactwie wiązania integryn z ich korelowanymi ligandami LN.

Wprowadzenie

Przerzuty nowotworowe są główną przyczyną niepowodzenia leczenia i dominującym aspektem zagrażającym życiu raka. Jak postulowano 130 lat temu, rozprzestrzenianie się przerzutów następuje, gdy elita rozsianych komórek nowotworowych (DTC, "nasiona") nabywa specyficzne zdolności biologiczne, które pozwalają im uniknąć miejsc pierwotnych i ustanowić złośliwy wzrost w odległych miejscach ("gleba")¹. Ostatnio pojawiło się kilka nowatorskich koncepcji dotyczących relacji "ziarno i gleba", takich jak indukcja nisz premetastatycznych (konceptualizowanych jako "żyzna gleba" potrzebna do rozwoju "nasion"), samosiew guzów pierwotnych przez DTC, spoczynek "nasion" w narządach wtórnych i równoległy model progresji przerzutów².

W przypadku większości nowotworów złośliwych, DTC mogą być zlokalizowane i wykrywane w wielu narządach mezenchymalnych, takich jak szpik kostny i węzły chłonne (LN) u pacjentów z lub bez dowodów na kliniczne przerzuty. Ponieważ LN drenujące guz są pierwszym miejscem regionalnego rozprzestrzeniania się DTC, status LN jest ważnym wskaźnikiem prognostycznym i często wiąże się z decyzjami dotyczącymi leczenia uzupełniającego³. W przypadku niektórych typów nowotworów korelacja między statusem LN a gorszymi wynikami jest silna, w tym głowa i szyja^4,5, breast⁶, prostata⁷, lung⁸, gastric⁹, colorectal^10,11 i raki tarczycy¹².

LN to małe, jajowate organy układu limfatycznego, które są pokryte komórkami siatkowatymi i otoczone naczyniami limfatycznymi. Narządy te są absolutnie niezbędne do funkcjonowania układu odpornościowego¹³. LN działają jako platformy atraktantowe dla komórek krążących układu odpornościowego, łącząc limfocyty i komórki prezentujące antygen¹⁴. Jednak LN przyciągają również krążące komórki nowotworowe. Przez dziesięciolecia LN były przedstawiane jako pasywne drogi transportu przerzutowych komórek nowotworowych. Jednak ostatnie badania wykazały, że komórki nowotworowe mogą być również kierowane w kierunku LN przez sygnały chemotaktyczne (chemokiny) i/lub haptotaktyczne (elementy macierzy zewnątrzkomórkowej) wydzielane przez śródbłonek limfatyczny¹⁵. Na przykład, nadekspresja receptora CCR7 w komórkach nowotworowych ułatwia prowadzenie komórek czerniaka z przerzutami w kierunku drenujących guz LNs¹⁶. Ponadto zewnątrzkomórkowe białka LN stanowią adhezyjne rusztowanie do rekrutacji i przeżycia krążących komórek nowotworowych¹⁷. W rzeczywistości, drenujące nowotwory LN zapewniają żyzną glebę do wysiewu DTC, które mogą być utrzymywane w stanie proliferacyjnym lub uśpionym przez specyficzne sygnały mikrośrodowiskowe LN¹⁸. Ostateczny los tych DTC rezydujących w LN jest kontrowersyjny; Niektóre prace sugerują, że komórki te są pasywnymi wskaźnikami progresji przerzutów¹⁹, podczas gdy inne sugerują, że są one bardziej prawdopodobnymi założycielami oporności (poprzez samosiewy pierwotnych miejsc) i/lub działają jako rezerwuary komórkowe dla przerzutów (rozprzestrzeniając "nasiona" dla wzrostu raka trzeciego rzędu)^20,21. Niedawno, przy użyciu modeli przedklinicznych, wykazano, że część tych DTC znajdujących się w LN aktywnie atakuje naczynia krwionośne, dostaje się do krążenia krwi i kolonizuje płuca²¹.

Biorąc pod uwagę, że obecność komórek rakowych w LN jest markerem agresywności i inwazyjności raka, w tym badaniu zoptymalizowaliśmy klasyczną metodę opracowaną przez Brodt²² do ilościowego pomiaru adhezji komórek nowotworowych do LN in vitro. Zastosowanie testu opartego na fluorescencji pozwoliło nam opracować tani, szybki, czuły i przyjazny dla środowiska (nieradioaktywny) protokół wykrywania zmian adhezyjnych między komórkami nowotworowymi a kriosekcjami LN. Wykorzystując komórki raka piersi MCF-7 wyrażające różne poziomy ekspresji genu NDRG4 i zamrożone skrawki LN szczura w celu zilustrowania metody, wykazaliśmy, że protokół ten pozwolił na dobrą korelację między adhezją komórek nowotworowych do LN in vitro a przerzutami LN obserwowanymi u pacjentów z rakiem piersi²⁴.

Protokół

LN zostały odzyskane ze świeżych zwłok zdrowych dorosłych szczurów rasy Wistar, które zostały uśmiercone przez zwichnięcie szyjki macicy. Postępowaliśmy zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi bólu i stresu u zwierząt laboratoryjnych, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki i Badania na Zwierzętach Instytutu Badań i Edukacji szpitala Sírio-Libanês (CEUA P 2016-04).

UWAGA: Wszystkie świeżo zamrożone tkanki są uważane za biologicznie niebezpieczne i powinny być traktowane przy użyciu odpowiednich środków bezpieczeństwa biologicznego.

1. Limfadenektomia i kriosekcja

1. Świeże tusze dorosłych szczurów rasy Wistar (180-220 g) leżące w pozycji leżącej grzbietowej należy umieścić na czystej desce rozwarstwiającej w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: LN muszą być zebrane do 30 minut po eutanazji.
2. Spryskaj tuszę szczura 70% alkoholem izopropylowym i użyj wysterylizowanych narzędzi do zbioru LN.
3. Podnieś skórę brzucha za pomocą pęsety i otwórz jamę z nacięciem przyśrodkowym, nie uszkadzając leżącej poniżej tkanki, odsłaniając wnętrzności brzucha. Wyciągnij jelito, a LN klatki piersiowej i jamy brzusznej staną się widoczne (Rysunek 1).
4. Ostrożnie wytnij LN od każdego szczura za pomocą nożyczek z końcówką, aby uniknąć uszkodzenia górnej tętnicy krezkowej leżącej z tyłu.
   UWAGA: W zależności od lokalizacji wyciętego węzła chłonnego konieczne jest oczyszczenie innych przylegających do niego tkanek, takich jak tkanka krezkowa.
5. Zebrać LN do stożkowych probówek o pojemności 15 ml zawierających 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
6. Prawidłowo wyrzuć tusze szczurów.
7. Usuń świeże LN z PBS, zwiń i wysusz węzeł na suchej bibule filtracyjnej. Umieść go na małej szalce Petriego i dodaj roztwór do osadzania zamrożonych próbek tkanek (O.C.T.) na 2 minuty.
8. Przenieś i zorientuj LN stroną zadrukowaną do dołu w żądanej pozycji w podstawie krioformy, z wystarczającą ilością OCT, aby ją przykryć. Unikaj pęcherzyków w pobliżu tkanki. Powierzchnią przekroju jest spód krioformy.
9. Natychmiast zamroź kriodruk w styropianowej chłodziarce z suchym lodem. Gdy nadal pozostaje niewielka część niezamrożonego OCT (~20-35 s), przenieś próbkę na folię aluminiową i umieść ją w chłodziarce z suchym lodem, kontynuując zamrażanie innych próbek. Na koniec przechowywać wszystkie próbki w temperaturze -80 °C do momentu ich podziału.
10. Przeciąć LN za pomocą kriostatu regulującego grubość przekroju do 5-8 μm. Przenieść kriosekty na szkiełka mikroskopowe.
    UWAGA: Przed podziałem na sekcje należy wyjąć zamrożone próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić je do osiągnięcia temperatury w komorze mikrotomu kriostatu wynoszącej -22 °C przez około 30 minut. Szkiełka zawierające LN można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego miesiąca.

2. Znakowanie komórkowe za pomocą barwników fluorescencyjnych

UWAGA: Barwniki fluorescencyjne są szeroko stosowane w biologii komórki. Preferujemy znakowanie długołańcuchowymi dialkilokarbocyjaninami (DiI(C₁₈), wzbudzenie 549 nm, emisja 565 nm), ponieważ są one jasne, stabilne i mogą być dodawane bezpośrednio do pożywek hodowlanych, nie wpływają na żywotność komórek ani właściwości adhezyjne komórek^25,26.

1. Dysocjuj komórki rosnące w idealnych warunkach (tj. w kompletnym pożywce) i ponownie zawieś w pożywce bez surowicy o gęstości 10-6 komórek/ml.
2. Dodać 1 ml zawiesiny komórek (10⁶ komórek) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i oznaczyć etykietą Dil(C₁₈) (2 μg/ml) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Po 5 minutach delikatnie porusz probówki, aby uniknąć sedymentacji komórek i niedobarwienia osadzonych komórek. Większe gęstości wymagają dłuższego czasu inkubacji w celu równomiernego barwienia. Optymalny czas inkubacji do barwienia komórek różni się w zależności od linii komórkowej. Można go lepiej określić ilościowo za pomocą konwencjonalnego kanału detekcji cytometrii przepływowej FL2 ( Rysunek 2A).
3. Odwirować oznakowane probówki z zawiesiną o masie 300 x g przez 4 min.
4. Usunąć supernatant i przemyć dwukrotnie w 10 ml podłoża niezawierającego surowicy. Odzyskaj komórki w postaci czerwonych granulek. Zawiesić komórki w stężeniu^10-6 komórek/ml w podłożu bez surowicy z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).

3. Wstępne powlekanie naczyń roztworem poli-L-lizyny lub BSA jako kontrola wysiewu (opcjonalnie)

UWAGA: Użyliśmy naczyń do hodowli komórkowych wstępnie pokrytych PLL jako powierzchni do kontroli obciążenia, aby zapewnić, że różne eksperymentalne grupy komórek nowotworowych zostały wysiane w tej samej liczbie, a także powierzchnie pokryte BSA jako kontrole negatywne.

1. W sterylnych warunkach, w celu przygotowania studzienek pokrytych PLL lub BSA, należy dodać 300 μl PLL (0,1% w/v w H₂O) lub BSA (rozcieńczonych w stężeniu 2,5% w/v w H₂O) bezpośrednio do płytki 24-dołkowej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Usunąć roztwór przez aspirację, delikatnie spłukać powierzchnię sterylnym PBS i wysuszyć płytkę na powietrzu w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowych przed wysiewem komórek.
   UWAGA: Końcowe objętości PLL lub BSA należy dostosować do obszaru różnych płyt dołkowych.

4. Wysiewanie komórek nowotworowych znakowanych fluorescencyjnie na kriosekcjach LN lub studzienkach pokrytych PLL/BSA

UWAGA: Jako eksperymentalne kontrole, użyliśmy (1) naczyń do hodowli komórkowych wstępnie pokrytych PLL lub BSA i (2) kolejnych sekcji tego samego LN na eksperyment (zobacz ten szczegół w Rysunek 2D), gdzie ten ostatni zminimalizuje regionalne różnice w składzie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) każdej sekcji LN, co z kolei może dyktować szybkość adhezji komórek. Do poniższego testu adhezji komórek nowotworowych wybierz wysokiej jakości i sekwencyjne kriosekcje LN.

1. Delikatnie umyj kriosekcje dwukrotnie PBS i ponownie nawodnij PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
2. Zablokuj niespecyficzną adhezję do kriosekcji za pomocą 2,5% BSA przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Użyj komór do mycia immunohistochemicznego i kołysek blaszki, aby upewnić się, że cały OCT został usunięty podczas płukania i inkubacji.
3. Odcedź nadmiar BSA na suchym ręczniku papierowym, osusz kontur odcinków LN bawełnianym wacikiem i owiń sekcje za pomocą pisaka PAP.
4. W celu przeprowadzenia testu adhezji komórek nowotworowych dodać 100 μl zawiesiny komórkowej (z kroku 2.4) do każdego otoczonego odcinka LN lub studzienki na 24-dołkowych płytkach pokrytych PLL i umieścić je w wilgotnym stojaku komorowym na 1-2 godziny w temperaturze 37 °C w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych.
   UWAGA: Ostateczna objętość zawiesiny komórek musi być dostosowana do obszaru różnych otoczonych LN.
5. Delikatnie zmyj nieprzylegające komórki cztery razy za pomocą PBS. Utrwal pozostałe przylegające komórki fluorescencyjne za pomocą 3,7% formaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

5. Ręczna kwantyfikacja wskaźnika adhezji

UWAGA: Wskaźnik adhezji (tj. komórki nowotworowe/LN mm²) został osiągnięty przy użyciu 10-krotnego obiektywu i ręcznego liczenia liczby komórek nowotworowych, łatwo zidentyfikowanych przez mikroskopię świetlną i potwierdzonych przez mikroskopię fluorescencyjną (Rysunek 2D), na obszary węzłów chłonnych kilku niezależnych pól (uzyskane za pomocą oprogramowania ImageJ/FIJI Narodowego Instytutu Zdrowia).

1. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10x, aby wykonać oddzielne obrazy TIFF w dwóch kanałach odpowiadających jasnym i czerwonemu polu fluorescencyjnemu (Rysunek 2D). Nazwij i zapisz te obrazy systematycznie.
2. Uruchom ImageJ/FIJI, otwórz obrazy i ustaw skalę. Konieczne jest użycie skali kalibracyjnej (np. linijki mikrometrycznej 1 mm) (Rysunek 2C).
3. Otwórz zdjęcie linijki mikrometrycznej (lub mikrometru stolikowego), wybierz narzędzie Linia prosta i narysuj linię prostą określającą znaną odległość.
4. W menu Analizuj wybierz opcję Ustaw skalę. Odległość w pikselach zostanie wypełniona na podstawie długości (w pikselach) linii narysowanej w kroku 5.3. Znana odległość zostanie wypełniona rzeczywistą odległością (w tym przypadku w milimetrach) i jednostką długości w polu Jednostka długości (w tym przypadku w milimetrach).
5. Kliknij Globalne (ta kalibracja dotyczy wszystkich obrazów otwartych w tej sesji ImageJ/FIJI) i naciśnij OK.
6. Kwantyfikacja obszaru węzłów chłonnych: Wybierz narzędzie Różdżka i klikając dwukrotnie, otwórz ustawienia narzędzia Różdżka. Ustaw tryb na 8-connected. Kliknij na zdjęciu i ustaw tolerancję, aż zaznacz wszystkie węzły chłonne na zdjęciu i naciśnij OK. Aby zmierzyć powierzchnię, otwórz punkt menu Analizuj | Zmierz (CTRL + M). Powierzchnia wyrażona jest w jednostkach ustalonych wcześniej.
7. Kwantyfikacja komórek nowotworowych: Otwórz obrazy mikroskopii świetlnej/fluorescencji w oprogramowaniu FIJI. Wybierz Wtyczki | Analizowanie | Licznik komórek | Licznik komórek. Kliknij zdjęcie, które chcesz określić ilościowo, i naciśnij przycisk Inicjalizuj w oknie licznika komórek. Wybierz typ licznika (1-8) i kliknij komórki na zdjęciu. Aby zainicjować następne zdjęcie, naciśnij przycisk Resetuj w oknie licznika komórek, otwórz nowe zdjęcie i powtórz wszystkie kroki.
   UWAGA: Wskaźnik adhezji LN jest wyrażony jako liczba przylegających komórek nowotworowych na obszar pokryty LN (komórki/mm²).

Wyniki

Ilustrujemy test, oceniając potencjał adhezyjny LN komórek raka piersi MCF-7 o czerwonej fluorescencji, wyrażających różne poziomy genu NDRG4 (określanych jako komórki NDRG4-dodatnie i NDRG4-ujemne), negatywny modulator grupowania beta1-integryny na powierzchni komórki²⁴, badając frakcje szczurzych komórek nowotworowych przylegających do LN. Przykłady surowych obrazów tego protokołu są pokazane w Rysunek 2. Jak zaobserwowano w

Dyskusja

Rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych w układzie limfatycznym wymaga wielu złożonych zdarzeń sterowanych przez komórki. Rozpoczynają się one od oderwania komórek od guza pierwotnego i przebudowy architektury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i są wspierane przez uporczywą chemotaksję i aktywną migrację przez aferentne limfy w drodze do wartowniczych LN. Jeśli komórki rakowe przylegają i przeżywają w LN, mogą łatwo rozprzestrzenić się na inne narządy wtórne. W tym miejscu opisujemy łatwą metodę szybkiej i taniej an...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki stożkowe 15 ml	Corning	352096
2-propanol	Merck	109634
Benchtop Laminar Flow	Esco Pojemnik do hodowli
na dysk	Leica	14020139126
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A9647-100
Kolba do hodowli komórkowych T-25 cm2	Corning	430372
Cryostat	Leica	CM1860
z magnesem	Sondy
DiIC18 Cell Traker Dye		V-22885
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Life Technologies	12657-029
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon Eclipse 80
Inkubator CO2 Forma Series II	Thermo Scientific
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
Wysokoprofilowa jednorazowa maszynka do golenia		Leica
(IHC)	KASVI	K560030
Mikroskop odwrócony	Olympus	CKX31
Isofluran 100 mL	Crist&aaostry; lia
Liquid Bloquer Super Pap Pen	Abcam, odczynniki do nauk przyrodniczych	ab2601
Optymalna temperatura cięcia Związek "OCT"	Sakura	4583
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Life Technologies	70011-044
Poli-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	Gibco	31800-022
Pipety serologiczne 1 ml	Jet Biofil	GSP010001
Pipety serologiczne 10 ml	Jet Biofil	GSP010010
Pipety serologiczne 2 ml	Jet Biofil	GSP010002
Pipety serologiczne 5 ml	Jet Biofil	GSP010005
Pipety serologiczne 50 ml	Jet Biofil	GSP010050
Pipetor serologiczny Easypet 3	Eppendorf
Tissue-Tek cryomold	Sakura	4557
Błękit trypanowy 0,4%	Invitrogen	T10282
Trypsyna	Instituto Adolfo Lutz	ATV