Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inkubacja strachu przy użyciu rozszerzonego protokołu warunkowania strachu dla szczurów

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60537

⸱

22 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy rozszerzony protokół warunkowania strachu, który powoduje przetrenowanie i inkubację strachu u szczurów. Protokół ten obejmuje pojedynczą sesję treningową z 25 parami ton-shock (tj. przetrenowanie) i porównaniem reakcji warunkowego zamrażania podczas testów kontekstowych i cue 48 godzin (krótkoterminowo) i 6 tygodni (długoterminowo) po treningu.

Streszczenie

Pamięć emocjonalna była przede wszystkim badana za pomocą paradygmatów warunkowania strachu. Warunkowanie strachu jest formą uczenia się, dzięki której jednostki uczą się relacji między awersyjnymi zdarzeniami a innymi neutralnymi bodźcami. Najpowszechniej stosowane procedury badania wspomnień emocjonalnych wiążą się z warunkowaniem strachu u szczurów. W tych zadaniach bodziec bezwarunkowy (US) to wstrząs stopy prezentowany raz lub kilka razy w ciągu jednej lub kilku sesji, a reakcja warunkowa (CR) to zamrożenie. W wersji tych procedur, zwanej warunkowaniem strachu z sygnałem, ton (bodziec warunkowy, CS) jest połączony z wstrząsami stóp (US) podczas fazy treningu. Podczas pierwszego badania zwierzęta są wystawione na ten sam kontekst, w którym odbywało się szkolenie, a reakcje zamrażania są testowane przy braku wstrząsów stopami i tonów (tj. test kontekstowy). Podczas drugiego testu mierzy się zamrożenie, gdy zmienia się kontekst (np. poprzez manipulowanie zapachem i ścianami komory doświadczalnej), a ton jest prezentowany przy braku wstrząsów stopą (tj. test wskazówek). Większość procedur warunkowania strachu z sygnałem obejmuje kilka par ton-szok (np. 1-3 próby w jednej sesji). Rośnie zainteresowanie mniej powszechnymi wersjami obejmującymi dużą liczbę par (tj. przetrenowanie) związanych z długotrwałym efektem zwanym inkubacją strachu (tj. reakcje strachu nasilają się z czasem bez dalszej ekspozycji na zdarzenia awersyjne lub bodźce warunkowe). Rozszerzone zadania warunkowania strachu były kluczem do zrozumienia behawioralnych i neurobiologicznych aspektów inkubacji strachu, w tym jej związku z innymi zjawiskami psychologicznymi (np. zespołem stresu pourazowego). Tutaj opisujemy rozszerzony protokół warunkowania strachu, który powoduje przetrenowanie i inkubację strachu u szczurów. Protokół ten obejmuje pojedynczą sesję treningową z 25 parami ton-shock (tj. przetrenowanie) i porównaniem reakcji warunkowego zamrażania podczas testów kontekstowych i cue 48 godzin (krótkoterminowo) i 6 tygodni (długoterminowo) po treningu.

Wprowadzenie

Pamięć to proces psychologiczny obejmujący różne fazy: zdobywanie informacji, konsolidację (pozwala na stabilność nabytych informacji) i wyszukiwanie (dowody na proces konsolidacji)1. W fazie konsolidacji dochodzi do tworzenia nowych połączeń synaptycznych i modyfikacji wcześniej istniejących połączeń. Sugeruje to konieczność istnienia okresu czasu, w którym zachodzą zdarzenia molekularne i fizjologiczne odpowiedzialne za te zmiany1,2. Te fizjologiczne lub molekularne zmiany różnią się w zależności od tego, czy odzyskane zdarzenia są naładowane emocjonalnie, czy nie (tj. pamięć emocjonalna). Na przykład badania wykazały, że jądro boczne i kompleks ciała migdałowatego podstawno-bocznego są szczególnie istotne dla pamięci emocjonalnej3,4,5.

Zjawiska pamięci emocjonalnej były głównie badane za pomocą paradygmatów warunkowania strachu5,6. Warunkowanie strachu jest formą uczenia się, dzięki której jednostki uczą się relacji między zdarzeniami awersyjnymi a bodźcami neutralnymi7. Paradygmaty warunkowania strachu powodują zmiany molekularne, komórkowe i strukturalne w ciele migdałowatym. Ponadto warunkowanie strachu modyfikuje łączność hipokampa podczas procesów konsolidacji i odzyskiwania pamięci emocjonalnej.

Jedną z najczęściej używanych procedur do badania wspomnień strachu jest klasyczne (Pawłowa) warunkowanie u szczurów. Ta procedura zazwyczaj wykorzystuje wstrząs stopą (US) jako bodziec awersyjny, który jest dostarczany raz lub kilka razy w ciągu jednej lub kilku sesji. Reakcją warunkową (CR) szczurów poddanych tej procedurze jest zamrożenie (tj. "uogólniony bezruch spowodowany uogólnioną reakcją toniczną mięśni szkieletowych zwierząt, z wyjątkiem mięśni używanych w oddychaniu"7 ). Odpowiedź tę można ocenić za pomocą dwóch rodzajów testów: testów kontekstowych i testów podpowiedzi. W teście kontekstowym badany przechodzi określoną liczbę wstrząsów stopą podczas sesji treningowej, a następnie jest usuwany z komory eksperymentalnej na określony czas. Podczas testu badany jest przenoszony do tego samego kontekstu, w którym odbywał się trening, i zbierane są różne miary zamrożenia w przypadku braku wstrząsów stopą (np. czas trwania, procent lub częstotliwość epizodów zamrożenia) i porównywane z poziomami wyjściowymi ustalonymi podczas fazy treningu. W przypadku drugiego rodzaju testu, testu wskazówek, bodziec (zazwyczaj ton) jest sparowany z wstrząsami stopy podczas fazy treningu (tj. bodziec warunkowy, CS). Po zakończeniu szkolenia zwierzę jest usuwane z kontekstu treningowego na określony czas, a następnie umieszczane w zmodyfikowanym kontekście (np. w innej komorze doświadczalnej, która ma inne kształty ścian i inny zapach). Cue jest następnie prezentowany określoną liczbę razy, a reakcje zamrożenia na cue są mierzone i porównywane z poziomami wyjściowymi zebranymi podczas treningu. Najpowszechniejsza wersja tego paradygmatu wykorzystuje od 1 do 3 par ton-shock podczas jednej sesji treningowej, a następnie testy kontekstu i wskazówek przeprowadzane przez kilka godzin lub kilka dni później.

Inne, rzadziej wdrażane procedury warunkowania strachu obejmują dużą liczbę par sygnałów szokujących (tj. prób), które często nazywano procedurami przetrenowania8. Rosnące zainteresowanie tymi zadaniami jest związane z ich długotrwałymi i zwiększonymi efektami pamięciowymi zwanymi inkubacją strachu (tj. uwarunkowane reakcje strachu nasilają się z czasem przy braku dalszej ekspozycji na zdarzenia awersyjne lub bodźce warunkowe)9,10,11. Przykładem takich procedur przetrenowania jest faza treningowa składająca się ze 100 par ton-shock rozłożonych na 10 sesji, po której następują testy kontekstu i wskazówek przeprowadzane 48 godzin i 30 dni później11,12. Aby uniknąć intensywnego treningu rozłożonego na kilka dni, Maren (1998) poinformowała, że przetrenowanie można ustalić i zoptymalizować w jednej sesji z 25 parami8. Efekt inkubacji jest udowodniony w znacznie wyższym poziomie uwarunkowanego strachu u szczurów badanych 31 dni po treningu, w porównaniu ze szczurami testowanymi 48 godzin po. Rozszerzone zadania warunkowania strachu były kluczem do zrozumienia behawioralnych i neurobiologicznych aspektów leżących u podstaw inkubacji strachu, w tym jej związku z innymi zjawiskami psychologicznymi (np. zespołem stresu pourazowego o opóźnionym początku)11,12,13.

Tutaj opisujemy rozszerzony protokół warunkowania strachu, który wywołuje przetrenowanie i inkubację strachu u szczurów. W przeciwieństwie do innych paradygmatów, które wymagają kilku dni treningu11, obecny protokół koncentruje się na pojedynczej sesji treningowej8. Użyliśmy 25 par ton-szok, aby uzyskać wyższe reakcje warunkowego zamrożenia podczas testów kontekstowych i cue przeprowadzonych 6 tygodni po treningu, w porównaniu z testami przeprowadzonymi 48 godzin po.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC-KL) Fundación Universitaria Konrad Lorenz. Przestrzegano uniwersalnej deklaracji praw zwierząt wydanej przez Międzynarodową Ligę Praw Zwierząt w Genewie w Szwajcarii (1989) oraz zasad etycznych eksperymentowania na zwierzętach wydanych przez ICLAS.

1. Przygotowanie obiektu

  1. Wybierz dorosłe samce szczurów Wistar (n = 12). Zakwateruj je w grupach po cztery osobniki w klatce na trzy dni aklimatyzacji przed rozpoczęciem protokołu treningowego i testowego. Zapewnij szczurom swobodny dostęp do wody przez cały czas trwania eksperymentu. Kontroluj temperaturę w pomieszczeniu w zakresie od 20 °C do 25 °C, przy zastosowaniu 12-godzinnego cyklu światło-ciemność (włączanie światła o godzinie 07:00 h).
    UWAGA: Różne szczepy szczurów wykazywały zróżnicowane wyniki podczas warunkowania lękowego. Na przykład Schaap i wsp. (2013) zgłosili, że szczepy Wistar i Lewis wykazywały dłuższy czas trwania reakcji zamrożenia w porównaniu ze szczurami Fawn Hooded i Brown Norway12. W związku z tym należy ocenić różnice w progu bólu i progu termicznym, aby dostosować intensywność i czas trwania wstrząsów.
  2. Utrzymuj masę ciała szczurów na poziomie 85% masy przy swobodnym dostępie do pokarmu (masa normalna między 350-40 g) poprzez ograniczony dostęp do jedzenia o tej samej godzinie każdego dnia. Waż szczury codziennie o tej samej godzinie podczas cyklu świetlnego. Oblicz masę ad lib (10% masy) przez trzy dni przed rozpoczęciem rozszerzonego treningu warunkowania lękowego.
    UWAGA: Zwierzęta wykorzystane w niniejszym eksperymencie zostały poddane dodatkowym testom instrumentalnym, których nie opisano w tym materiale. Dla tych dodatkowych testów wymagane było głodzenie. To zróżnicowanie proceduralne ma na celu rozszerzenie zakresu obecnej procedury, sugerując potencjał dla połączonych testów instrumentalno-lękowych. Jednak badania wykorzystujące wyłącznie testy warunkowania lękowego nie wymagają głodzenia.
  3. Przypisuj osobniki losowo do jednej z następujących grup: testowanie emocjonalne 6 tygodni po treningu (n = 6); testowanie emocjonalne 48 h po treningu (n = 6).
  4. Przeprowadzaj trening i testy o podobnych godzinach, podczas fazy świetlnej cyklu ciemność-światło. Przypisz zwierzęta do tej samej komory eksperymentalnej i zachowaj tę samą kolejność zwierząt podczas treningu i testowania.
    UWAGA: Dodatkową kontrolą, którą można wdrożyć, jest zrównoważenie (counterbalancing) kolejności zwierząt podczas faz treningowych i testowych. Zalecamy stosowanie tej techniki, gdy ocenianych jest wiele grup lub gdy w różnych eksperymentach stosuje się różne zadania, aby zredukować możliwy wpływ kolejności zadań na zachowanie.

2. Konfiguracja aparatury i kalibracja wstrząsu

  1. Oczyścić wszystkie wewnętrzne powierzchnie komory eksperymentalnej oraz stalową kratkę podłogi 10% etanolem. Powtarzać tę czynność przed badaniem każdego zwierzęcia.
  2. Podłączyć urządzenie do komputera za pomocą kabla USB i uruchomić system detekcji zamrażania: jednostkę CPU, szafkę sterującą, światło podczerwone, stymulator/scrambler awersyjny oraz kalibrator natężenia wstrząsu.
    UWAGA: Choć niniejszy protokół został przeprowadzony przy użyciu instrumentów dostępnych w handlu (Tabela materiałów), można użyć sprzętu i oprogramowania innych marek. Aparatura składa się z wewnętrznej kwadratowej komory akrylowej (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, nazywanej komorą eksperymentalną), osadzonej w drewnianym pudełku pokrytym plastikową formiką. Zewnętrzne drzwi umożliwiają izolację od dźwięków, hałasu lub światła (drzwi skrzyni tłumiącej). Kamera znajduje się bocznie w wewnętrznej części zewnętrznych drzwi. Wewnętrzne pudełko akrylowe z metalową kratką podłogową (36 prętów ze stali nierdzewnej, każdy o średnicy 3 mm i odstępach 8 mm od środka do środka) umożliwia podawanie wstrząsów łapowych. W jednej z wewnętrznych ścian bocznych, 6 cm nad podłogą, znajduje się głośnik do emitowania sygnału dźwiękowego.
  3. Podłączyć czerwony i czarny zacisk kalibratora natężenia wstrząsu (tj. złącza dodatnie i ujemne) do dowolnych dwóch różnych prętów kratki podłogowej. Podłączyć kabel USB do odpowiedniego portu komputera. Należy upewnić się, że czerwony i czarny zacisk są podłączone do prętów przedzielonych innym prętem.
    UWAGA: Ta sekcja opisuje proces kalibracji natężenia wstrząsu przy użyciu konkretnej marki sprzętu wspomnianej w Tabeli materiałów. Proces kalibracji można jednak przeprowadzić przy użyciu sprzętu innych marek. Zaleca się kalibrację natężenia wstrząsu w trzech sektorach kratki podłogowej, aby zweryfikować jego spójność. Ponadto należy zawsze usuwać pozostałości kału i moczu z kratki podłogowej, aby uniknąć zakłóceń podczas podawania wstrząsu.
  4. Uruchomić oprogramowanie kalibratora natężenia wstrząsu (Tabela materiałów). Wybrać w aplikacji natężenie 1,0 mA, klikając strzałkę zakresu. Następnie przełączyć przełącznik Run/Stop na pozycję Run.
    UWAGA: Proponujemy wartość 1,0 mA w oparciu o nasze badania na modelach gryzoni w naszym laboratorium oraz literaturę, która wskazuje zakres od 0,75 mA do 1,5 mA jako odpowiedni dla badań nad warunkowaniem lękowym3,34,35.
  5. Włączyć stymulator awersyjny lub urządzenie służące do podawania wstrząsów łapowych i sprawdzić natężenie wstrząsu wyświetlane na panelu aplikacji. W razie potrzeby skorygować natężenie do 1,0 mA za pomocą pokrętła na stymulatorze awersyjnym.
    UWAGA: Stymulator awersyjny powinien być ustawiony na „OUT”, aby prawidłowo przetestować, skalibrować i przeprowadzić eksperyment.

3. Kalibracja systemu wykrywania zamarzania

  1. Zamknąć komorę eksperymentalną oraz drzwi skrzynki wygłuszającej. Nie wprowadzać zwierzęcia na tym etapie, ponieważ zostanie ono umieszczone w komorze po zakończeniu kalibracji systemu detekcji zamarcia. Sprawdzić, czy natężenie światła wewnątrz skrzynki wynosi od 20 do 30 luksów.
  2. Uruchomić oprogramowanie systemu detekcji zamarcia i otworzyć okno dialogowe Experiment setup (Konfiguracja eksperymentu). Wprowadzić dane każdego obiektu (takie jak numer identyfikacyjny obiektu, datę i grupę) oraz wczytać plik o nazwie „Training protocol VFC.pro” (dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    UWAGA: Testy kontekstowe i sygnałowe wykorzystują inną konfigurację programu; dlatego należy upewnić się, że podczas każdego testu użyty zostanie właściwy plik. Na tym etapie właściwy plik to „Training protocol VFC.pro”. Należy pamiętać, że w fazach testowych plik będzie inny niż w sesji treningowej.
  3. Wybrać odpowiednią kamerę lub kamery i zaznaczyć opcję Save Video (Zapisz wideo), jeśli jest to wymagane. Ustawić Motion Threshold (Próg ruchu) na 10 oraz Min Freeze Duration (Minimalny czas zamarcia) na 30 klatek.
    UWAGA: Wartość progu ruchu zależy od wielkości użytego gatunku (na podstawie liczby pikseli). Wartość minimalnego czasu zamarcia jest zalecana przez producenta. Wartości te służą zapewnieniu prawidłowego rozpoznawania zwierzęcia w komorze.
  4. Upewnić się, że obraz z wybranej kamery lub kamer pojawia się na ekranie wraz z wykresem progu ruchu oraz osią czasu różnych bodźców prezentowanych podczas treningu (np. dźwięku i wstrząsu).
    UWAGA: Przy zastosowaniu sprzętu innej marki konfiguracja powinna oferować możliwość pomiaru ruchów zwierzęcia w celu wykrycia „indeksu” ruchu, co pozwoli na porównanie czasu, w którym zwierzę się porusza lub zamiera. inną możliwością jest zastosowanie oprogramowania, które na podstawie samego źródła wideo (w trakcie lub po eksperymencie) potrafi wykryć czas ruchu lub zamarcia zwierzęcia, takiego jak bezpłatne oprogramowanie ImageFZ13, otwarta biblioteka narzędzi w Matlab14 lub bezpłatny klasyfikator zachowań zwierząt, taki jak JAABA15.
  5. Kliknąć opcję Calibrate (Kalibruj) trzykrotnie, upewniając się, że indeks ruchu pozostaje poniżej 10 (progu). Następnie zablokować ustawienia sprzętu, klikając odpowiedni przycisk na ekranie (lock).
    UWAGA: Ta sekcja opisuje proces kalibracji systemu detekcji zamarcia przy użyciu konkretnej marki sprzętu wymienionej w Tabeli materiałów. Jak wspomniano wcześniej, proces kalibracji można przeprowadzić przy użyciu sprzętu różnych marek (przegląd różnych opcji sprzętowych i programowych znajduje się w pracy Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Przedłużony trening warunkowania lękowego

  1. Przetransportuj szczury w ich domowych klatkach, przykrytych tkaniną, z pomieszczenia dla zwierząt do sali treningu behawioralnego w laboratorium. Podczas transportu zwierząt do sali treningu behawioralnego unikaj ekspozycji na hałas lub warunki generujące stres. Jeśli transportowanych jest kilka zwierząt jednocześnie, przenieś tylko te, które mają zostać poddane testom, a pozostałe szczury pozostaw w pomieszczeniu oczekującym, aby zwiększyć kontrolę eksperymentalną. Przed rozpoczęciem treningu delikatnie manipuluj zwierzętami przez 2 min.
    UWAGA: W protokole zwierzęta były manipulowane każdego dnia przez 2 minuty przed treningiem behawioralnym. Po manipulacji zwierzęta wprowadzano do komory eksperymentalnej. Zalecamy manipulowanie zwierzętami, aby szczury przyzwyczaiły się do badacza.
  2. Wprowadź szczura do komory eksperymentalnej. Chwyć go delikatnie u nasady ogona i umieść w środku komory. Zamknij drzwi komory eksperymentalnej oraz wyciszającej skrzyni.
  3. Rozpocznij sesję, klikając przycisk Record. Pozwól szczurowi aklimatyzować się w komorze przez 3 min. Ten 3-minutowy okres jest standardem zalecanym przez producenta sprzętu i służy jako czas bazowy oraz czas habituacji do komory.
  4. Wykonaj dwadzieścia pięć paręć ton-wstrząs (prób) z 60 s odstępem między próbami (ITI), zaczynając od 3. minuty sesji. Prezentuj ton (bodziec warunkowy – CS; 90 dB SPL, 20 Hz, czas narastania 50-ms) podczas ostatnich 10 s każdego ITI oraz wstrząs (bodziec bezwarunkowy – US) podczas ostatnich 2 s każdego ITI.
    UWAGA: Aktywacja przycisku Record jest uwarunkowana prawidłową kalibracją i zablokowaniem kamer.
  5. Wyjmij szczura z komory eksperymentalnej po zakończeniu 28-minutowej sesji. Zwróć zwierzęta do ich odpowiednich domowych klatek. Przetransportuj szczury w ich domowych klatkach przykrytych tkaniną z sali treningu behawioralnego do pomieszczenia dla zwierząt.
  6. Powtórz kalibrację systemu detekcji zamierania (kroki 3.1-3.5) oraz warunkowanie lękowe (kroki 4.1 i 4.3), aby przeszkolić wszystkie osobniki.
    UWAGA: Zdecydowanie zalecamy ponowną kalibrację systemu detekcji dla każdego zwierzęcia, aby upewnić się, że oprogramowanie zachowuje te same parametry podczas przetwarzania informacji w celu detekcji zamierania.
  7. Okres odpoczynku: W tym czasie zwierzęta powinny odpoczywać indywidualnie w swoich domowych klatkach. Monitoruj masę ciała zwierząt dwa razy w tygodniu podczas 6-tygodniowego okresu inkubacji. Delikatnie manipuluj każdym zwierzęciem przez dwie minuty podczas ważenia.

5. Test kontekstowy – pojedyncza 10-minutowa sesja

  1. Po fazie treningowej poddaj zwierzęta pierwszemu testowi pamięci, zwanemu testem kontekstowym. Podczas tej 10 min fazy umieść szczury w tym samym kontekście, w którym odbył się trening, ale nie prezentuj sygnałów ani nie podawaj wstrząsów. Przenoś szczury w ich zakrytych klatkach domowych (np. za pomocą tkaniny) z pomieszczenia opieki nad zwierzętami do pokoju treningu behawioralnego. Należy pamiętać, że zwierzęta zostały podzielone na grupy, zatem jedną grupę testuje się 48 h po fazie treningowej, a drugą grupę 6 tygodni po treningu (patrz Rysunek 1).

Schemat eksperymentu z warunkowaniem lękowym; protokół parowania sygnału dźwiękowego z wstrząsem oraz procedura testowania dla myszy w dwóch grupach.
Rycina 1: Harmonogram eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Oczyścić wszystkie powierzchnie wewnętrzne komory eksperymentalnej oraz stalową kratkę podłogi 10% etanolem. Czynność tę powtórzyć przed testem każdego zwierzęcia.
  2. Powtórzyć kalibrację systemu detekcji zamierania (kroki 3.1 do 3.5). Otworzyć okno dialogowe Experiment setup i wczytać plik o nazwie „Context test protocol.pro”, który jest dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    UWAGA: Plik ten zawiera ustawienia dla tej fazy eksperymentalnej, która nie obejmuje podawania wstrząsów ani sygnałów dźwiękowych.
  3. Wprowadzić zwierzę do komory eksperymentalnej. Chwycić je delikatnie za nasadę ogona i umieścić w środku komory. Zamknąć drzwi komory eksperymentalnej oraz izolacyjnej skrzyni akustycznej.
  4. Rozpocząć sesję, klikając przycisk Record. Podczas tej pojedynczej, 10 min sesji testowej w kontekście nie podaje się żadnych bodźców (ani wstrząsów, ani dźwięków).
  5. Wyjąć badane zwierzę z komory eksperymentalnej po zakończeniu 10 min sesji. Zwrócić zwierzęta do ich odpowiednich klatek i przetransportować szczury w zakrytych klatkach domowych z pomieszczenia do treningu behawioralnego do zwierzęciatarni. Powtórzyć kroki 5.2-5.5, aby przetestować wszystkie badane osobniki.

6. Test z sygnałem – pojedyncza 13 min sesja

  1. Jeden dzień po teście kontekstowym należy przeprowadzić u zwierząt drugi test pamięci, zwany testem sygnałowym (cue test). W tej fazie szczury przebywają w innym kontekście niż podczas treningu przez 13 min.; prezentowane są sygnały (tony), ale nie podaje się wstrząsów. Przetransportuj szczury w ich domowych klatkach przykrytych osłoną z pomieszczenia opieki nad zwierzętami do pokoju treningu behawioralnego. Przetestuj jedną grupę 72 h po treningu warunkowania lękowego, a drugą grupę 6 tygodni i jeden dzień po treningu (Rysunek 1).
    UWAGA: Można zastosować inny system transportu (z pomieszczenia opieki nad zwierzętami do pokoju eksperymentalnego), aby bardziej zróżnicować testy kontekstowe i sygnałowe. Ponieważ zwierzęta były transportowane na sesję treningową i sesję testu kontekstowego w ich domowych klatkach, podczas transportu na sesję testu sygnałowego można użyć innej klatki transportowej, ściółki i/lub osłony.
  2. Oczyść wszystkie wewnętrzne powierzchnie komory eksperymentalnej oraz stalową kratnicę podłogową 10% etanolem. Powtórz czynność przed testowaniem każdego zwierzęcia.
  3. Aby zmienić kontekst wizualny, włóż plastikową ściankę otaczającą do komory eksperymentalnej.
  4. Aby zmienić kontekst węchowy, nanieś 1% kwas octowy na patyczek z bawełnianą końcówką i umieść go w metalnej tacce pod kratnicą podłogową17,18,19.
  5. Powtórz kalibrację systemu wykrywania zamarcia (kroki 3.1-3.5). Wczytaj plik o nazwie „Cue test protocol.pro”, który jest dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    UWAGA: Plik ten zawiera ustawienia dla tej fazy eksperymentalnej, która polega na podawaniu tych samych tonów, które były prezentowane podczas fazy treningowej (CS), ale w nieobecności wstrząsów (US).
  6. Wprowadź zwierzę do komory eksperymentalnej. Chwyć je delikatnie u nasady ogona i umieść na środku komory. Zamknij drzwi komory eksperymentalnej oraz skrzyni wygłuszającej.
  7. Rozpocznij sesję, klikając przycisk Record. Podczas pojedynczej 13 min sesji testu sygnałowego bodziec CS (ton) jest prezentowany 10 razy, zaczynając od 3. minuty sesji.
    UWAGA: Pierwsze 3 min odpowiada linii bazowej tej sesji, po której następuje 10 prób testu sygnałowego (po 10 s każda) z 50 s ITIs w nieobecności wstrząsów. Podawanie tonów odbywa się automatycznie za pomocą wcześniej wczytanego pliku.
  8. Wyjmij zwierzę z komory eksperymentalnej po zakończeniu 13 min sesji. Zwróć zwierzęta do odpowiednich klatek i przetransportuj je w sposób osłonięty do pomieszczenia opieki nad zwierzętami. Powtórz kroki od 6.2 do 6.5, aby przetestować wszystkie osobniki.

7. Analiza danych

  1. Wyznacz ogólny indeks aktywności (tj. indeks ruchu) pochodzący z strumienia wideo przy użyciu oprogramowania systemu detekcji zamierania. Oprogramowanie to automatycznie przekształca indeks ruchu, aby podać procent czasu zamierania na sesję oraz liczbę epizodów zamierania. Ustaw próg zamierania zgodnie z domyślnym ustawieniem Minimalnego Czasu Trwania Zamierania systemu (1 s = 30 klatek).
  2. Użyj dodatkowego, dedykowanego programu (plik dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ), aby uzyskać:
    1. Użyj programu do określenia procentu zamierania podczas pierwszych trzech minut sesji treningowej (tj. bazowego zamierania, ponieważ przed lub w trakcie tego 3-minutowego okresu nie podawano wstrząsów ani sygnałów dźwiękowych) oraz podczas pierwszych trzech minut sesji testu sygnałowego.
    2. Użyj programu do określenia procentu zamierania dla każdego z ośmiu 3-minutowych przedziałów sesji treningowej.
    3. Użyj programu do określenia procentu zamierania podczas prezentacji sygnałów (tj. zamierania podczas dźwięków) oraz w okresach braku sygnału (interwały między próbami; ITIs), zarówno dla sesji treningowej, jak i sesji testu sygnałowego.
  3. Aby uzyskać te dane, otwórz oprogramowanie systemu detekcji zamierania.
    1. Wybierz File | Reports | Batch Component summary.
    2. Wybierz plik z rozszerzeniem .CMP dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Nazwij plik wyjściowy i zmień Motion Threshold na 10. Następnie kliknij OK.
    4. Wybierz pliki do analizy (rozszerzenie .RAW). Pliki te są automatycznie generowane przez oprogramowanie systemu detekcji zamierania po zakończeniu sesji i odpowiadają surowym danym z każdej sesji. Początkowo pliki są zapisywane na pulpicie komputera, ale mogą zostać przeniesione do folderu użytkownika (np. Documents-Fear conditioning), aby ułatwić ich późniejszą identyfikację i otwieranie podczas analizy.
    5. Otwórz pliki wyjściowe (rozszerzenie .CSV). Mogą być one edytowane w programie do arkuszy kalkulacyjnych w celu dalszej analizy. Plik ten zawiera wyniki zamierania podczas sesji eksperymentalnej.
      UWAGA: Aby uzyskać całkowity procent zamierania, podziel czas, w którym obiekt pozostawał w bezruchu, przez całkowity czas sesji. Liczbę epizodów zamierania można obliczyć, licząc liczbę zdarzeń zamierania w trakcie sesji. W obu przypadkach konieczne jest zdefiniowanie progu ruchu w oparciu o minimalny czas trwania zamierania. Jest to kryterium czasowe określające, czy dany epizod zamierania zostanie zarejestrowany. Zautomatyzowane systemy rejestracji mogą używać określonej liczby klatek na sekundę (fps) jako miary minimalnego czasu trwania zamierania. Na przykład, przy częstotliwości próbkowania 30 fps, minimalny czas trwania zamierania wynoszący 15 klatek zarejestruje jako zamieranie przypadek bezruchu trwający 0,5 s.
  4. Oblicz średni czas trwania każdego epizodu zamierania dla każdej sesji (treningowej oraz obu testów: kontekstowego i sygnałowego), dzieląc całkowity czas trwania zamierania (w sekundach) przez całkowitą liczbę epizodów zamierania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analizowano zmiany procentowego czasu unieruchomienia w różnych etapach sesji treningowej dla wszystkich badanych osobników (n = 12) przy użyciu testu t dla zależnych grup (Tabela 1). Zwierzęta były aktywne i eksplorowały komorę doświadczalną przez pierwsze trzy minuty sesji treningowej (pierwszy dzień protokołu), w czasie których nie podawano żadnych dźwięków ani bodźców elektrycznych (tj. okres podstawowy – BL). Jak pokazano na Rysunku 2A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny rozszerzony protokół warunkowania strachu jest skutecznym i ważnym podejściem do oceny pamięci emocjonalnej w krótkich (48 godzin) i długoterminowych okresach (6 tygodni). Tym samym protokół pozwala na badanie zjawisk przetrenowania i inkubacji strachu u szczurów. Wśród różnych zalet tego protokołu są następujące. Oferuje dwa rodzaje testów pamięciowych, a mianowicie kontekst i cue, które pozwalają zidentyfikować efekt różnicowy dwóch opóźnień (48 godzin i 6 tygodni) w manipulacjach kontekstem i cue. Po drugie, za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie finansowe dla tych badań zostało zapewnione przez Fundación Universitaria Konrad Lorenz - grant numer 9IN15151. Autorzy pragną podziękować Działowi Komunikacji Uniwersytetu Konrada Lorenza za pomoc w nagraniu i montażu filmu, a w szczególności Natalii Riverze i Andrésowi Serrano (producenci). Nicole Pfaller-Sadovsky i Lucia Medina za komentarze do manuskryptu oraz Johanna Barrero, dziekan Corporacion Universitaria Iberoamericana, za współpracę instytucjonalną. Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy (kwas etanowy)https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Pakiet prądowy stymulacji awersyjnejMED Associates IncENV-420https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Test kontekstowy protocol.pro
http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ Test Cue protocol.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Zakrzywiona wkładkaścienna MED Associates IncVFC-008-CWIhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.ziphttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Skrzynka kontrolna NIR/światła białegoMED Associates IncNIR-100
Szybka wymiana Jednostka podłogowa/patelnia do myszyMED Associates IncENV-005FPU-Mhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Mała szafka stołowa i zasilaczMED Associates IncSG-6080Dhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Samodzielny stymulator awersyjny/scrambler (115 V / 60 Hz)MED Associates IncENV-414Shttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standardowa komora do kondycjonowania strachuMED Associates IncVFC-008https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Protokół treningowy VFC.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Pakiet kondycjonowania strachu wideo dla szczuraMED Associates IncMED-VFC-SCT-R
https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

Bibliografia

  1. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
  2. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
  3. Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
  4. Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
  5. LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
  6. Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
  7. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  8. Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
  9. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, Unit-6.27 (2013).
  10. Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
  11. Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
  12. Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339(2013).
  13. Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871(2014).
  14. Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349(2014).
  15. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  16. Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
  17. Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
  18. Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99(2018).
  19. Chang, C. H., et al. Fear extinction in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 (SUPPL. 47) (2009).
  20. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, 1-18 (2013).
  21. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  22. Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
  23. Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 - Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
  24. Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
  25. Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
  26. Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
  27. Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
  28. Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
  29. Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824(2019).
  30. Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
  31. Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
  32. Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091(2019).
  33. Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
  34. Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  35. Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , Elsevier B.V. (2018).
  36. Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M'hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
  37. Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
  38. Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266(2020).
  39. Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
  40. Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
  41. Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
  42. Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
  43. Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
  44. Frey, P., Eng, S., Gavinf, W. Conditioned suppression in the gerbil. Behavior Research Methods & Instrumentation. 4 (5), 245-249 (1972).
  45. Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
  46. Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
  47. Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Parowanie ton-wstrząstest kontekstowytest wskazówkireakcja zamarciaprotokół nadmiernego trenowaniapamięć emocjonalnaszczury Wistar
Inkubacja strachu przy użyciu rozszerzonego protokołu warunkowania strachu dla szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.