Artykuł metodologiczny

Inkubacja strachu przy użyciu rozszerzonego protokołu warunkowania strachu dla szczurów

DOI:

10.3791/60537

⸱

22 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Psychology, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, 2Animal Behavior Laboratory, Fundación Universitaria Konrad Lorenz, 3Department of Psychology, Universidad de Los Andes, 4School of Veterinary Medicine, Animal Health Department, Universidad Nacional de Colombia, 5Department of Psychology, Troy University, 6Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy rozszerzony protokół warunkowania strachu, który powoduje przetrenowanie i inkubację strachu u szczurów. Protokół ten obejmuje pojedynczą sesję treningową z 25 parami ton-shock (tj. przetrenowanie) i porównaniem reakcji warunkowego zamrażania podczas testów kontekstowych i cue 48 godzin (krótkoterminowo) i 6 tygodni (długoterminowo) po treningu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pamięć emocjonalna była przede wszystkim badana za pomocą paradygmatów warunkowania strachu. Warunkowanie strachu jest formą uczenia się, dzięki której jednostki uczą się relacji między awersyjnymi zdarzeniami a innymi neutralnymi bodźcami. Najpowszechniej stosowane procedury badania wspomnień emocjonalnych wiążą się z warunkowaniem strachu u szczurów. W tych zadaniach bodziec bezwarunkowy (US) to wstrząs stopy prezentowany raz lub kilka razy w ciągu jednej lub kilku sesji, a reakcja warunkowa (CR) to zamrożenie. W wersji tych procedur, zwanej warunkowaniem strachu z sygnałem, ton (bodziec warunkowy, CS) jest połączony z wstrząsami stóp (US) podczas fazy treningu. Podczas pierwszego badania zwierzęta są wystawione na ten sam kontekst, w którym odbywało się szkolenie, a reakcje zamrażania są testowane przy braku wstrząsów stopami i tonów (tj. test kontekstowy). Podczas drugiego testu mierzy się zamrożenie, gdy zmienia się kontekst (np. poprzez manipulowanie zapachem i ścianami komory doświadczalnej), a ton jest prezentowany przy braku wstrząsów stopą (tj. test wskazówek). Większość procedur warunkowania strachu z sygnałem obejmuje kilka par ton-szok (np. 1-3 próby w jednej sesji). Rośnie zainteresowanie mniej powszechnymi wersjami obejmującymi dużą liczbę par (tj. przetrenowanie) związanych z długotrwałym efektem zwanym inkubacją strachu (tj. reakcje strachu nasilają się z czasem bez dalszej ekspozycji na zdarzenia awersyjne lub bodźce warunkowe). Rozszerzone zadania warunkowania strachu były kluczem do zrozumienia behawioralnych i neurobiologicznych aspektów inkubacji strachu, w tym jej związku z innymi zjawiskami psychologicznymi (np. zespołem stresu pourazowego). Tutaj opisujemy rozszerzony protokół warunkowania strachu, który powoduje przetrenowanie i inkubację strachu u szczurów. Protokół ten obejmuje pojedynczą sesję treningową z 25 parami ton-shock (tj. przetrenowanie) i porównaniem reakcji warunkowego zamrażania podczas testów kontekstowych i cue 48 godzin (krótkoterminowo) i 6 tygodni (długoterminowo) po treningu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pamięć to proces psychologiczny obejmujący różne fazy: zdobywanie informacji, konsolidację (pozwala na stabilność nabytych informacji) i wyszukiwanie (dowody na proces konsolidacji)1. W fazie konsolidacji dochodzi do tworzenia nowych połączeń synaptycznych i modyfikacji wcześniej istniejących połączeń. Sugeruje to konieczność istnienia okresu czasu, w którym zachodzą zdarzenia molekularne i fizjologiczne odpowiedzialne za te zmiany1,2. Te fizjologiczne lub molekularne zmiany różnią się w zależności od tego, czy odzyskane zdarzenia są naładowane emocjonalnie, czy nie (tj. pamięć emocjonalna). Na przykład badania wykazały, że jądro boczne i kompleks ciała migdałowatego podstawno-bocznego są szczególnie istotne dla pamięci emocjonalnej3,4,5.

Zjawiska pamięci emocjonalnej były głównie badane za pomocą paradygmatów warunkowania strachu5,6. Warunkowanie strachu jest formą uczenia się, dzięki której jednostki uczą się relacji między zdarzeniami awersyjnymi a bodźcami neutralnymi7. Paradygmaty warunkowania strachu powodują zmiany molekularne, komórkowe i strukturalne w ciele migdałowatym. Ponadto warunkowanie strachu modyfikuje łączność hipokampa podczas procesów konsolidacji i odzyskiwania pamięci emocjonalnej.

Jedną z najczęściej używanych procedur do badania wspomnień strachu jest klasyczne (Pawłowa) warunkowanie u szczurów. Ta procedura zazwyczaj wykorzystuje wstrząs stopą (US) jako bodziec awersyjny, który jest dostarczany raz lub kilka razy w ciągu jednej lub kilku sesji. Reakcją warunkową (CR) szczurów poddanych tej procedurze jest zamrożenie (tj. "uogólniony bezruch spowodowany uogólnioną reakcją toniczną mięśni szkieletowych zwierząt, z wyjątkiem mięśni używanych w oddychaniu"7 ). Odpowiedź tę można ocenić za pomocą dwóch rodzajów testów: testów kontekstowych i testów podpowiedzi. W teście kontekstowym badany przechodzi określoną liczbę wstrząsów stopą podczas sesji treningowej, a następnie jest usuwany z komory eksperymentalnej na określony czas. Podczas testu badany jest przenoszony do tego samego kontekstu, w którym odbywał się trening, i zbierane są różne miary zamrożenia w przypadku braku wstrząsów stopą (np. czas trwania, procent lub częstotliwość epizodów zamrożenia) i porównywane z poziomami wyjściowymi ustalonymi podczas fazy treningu. W przypadku drugiego rodzaju testu, testu wskazówek, bodziec (zazwyczaj ton) jest sparowany z wstrząsami stopy podczas fazy treningu (tj. bodziec warunkowy, CS). Po zakończeniu szkolenia zwierzę jest usuwane z kontekstu treningowego na określony czas, a następnie umieszczane w zmodyfikowanym kontekście (np. w innej komorze doświadczalnej, która ma inne kształty ścian i inny zapach). Cue jest następnie prezentowany określoną liczbę razy, a reakcje zamrożenia na cue są mierzone i porównywane z poziomami wyjściowymi zebranymi podczas treningu. Najpowszechniejsza wersja tego paradygmatu wykorzystuje od 1 do 3 par ton-shock podczas jednej sesji treningowej, a następnie testy kontekstu i wskazówek przeprowadzane przez kilka godzin lub kilka dni później.

Inne, rzadziej wdrażane procedury warunkowania strachu obejmują dużą liczbę par sygnałów szokujących (tj. prób), które często nazywano procedurami przetrenowania8. Rosnące zainteresowanie tymi zadaniami jest związane z ich długotrwałymi i zwiększonymi efektami pamięciowymi zwanymi inkubacją strachu (tj. uwarunkowane reakcje strachu nasilają się z czasem przy braku dalszej ekspozycji na zdarzenia awersyjne lub bodźce warunkowe)9,10,11. Przykładem takich procedur przetrenowania jest faza treningowa składająca się ze 100 par ton-shock rozłożonych na 10 sesji, po której następują testy kontekstu i wskazówek przeprowadzane 48 godzin i 30 dni później11,12. Aby uniknąć intensywnego treningu rozłożonego na kilka dni, Maren (1998) poinformowała, że przetrenowanie można ustalić i zoptymalizować w jednej sesji z 25 parami8. Efekt inkubacji jest udowodniony w znacznie wyższym poziomie uwarunkowanego strachu u szczurów badanych 31 dni po treningu, w porównaniu ze szczurami testowanymi 48 godzin po. Rozszerzone zadania warunkowania strachu były kluczem do zrozumienia behawioralnych i neurobiologicznych aspektów leżących u podstaw inkubacji strachu, w tym jej związku z innymi zjawiskami psychologicznymi (np. zespołem stresu pourazowego o opóźnionym początku)11,12,13.

Tutaj opisujemy rozszerzony protokół warunkowania strachu, który wywołuje przetrenowanie i inkubację strachu u szczurów. W przeciwieństwie do innych paradygmatów, które wymagają kilku dni treningu11, obecny protokół koncentruje się na pojedynczej sesji treningowej8. Użyliśmy 25 par ton-szok, aby uzyskać wyższe reakcje warunkowego zamrożenia podczas testów kontekstowych i cue przeprowadzonych 6 tygodni po treningu, w porównaniu z testami przeprowadzonymi 48 godzin po.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Fundación Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL). Powszechna Deklaracja Praw Zwierząt wydana przez Międzynarodową Ligę Praw Zwierząt w Genewie w Szwajcarii (1989) oraz zasady etyczne eksperymentowania na zwierzętach wydane przez ICLAS były przestrzegane.

1. Przygotowanie przedmiotu

  1. Wybierz samce dorosłych szczurów Wistar (n = 12). Trzymaj je w grupach po cztery w klatce na trzy dni aklimatyzacji, przed rozpoczęciem protokołu szkolenia i testów. Zapewnij szczurom swobodny dostęp do wody przez cały czas trwania eksperymentu. Kontroluj temperaturę w pomieszczeniu w zakresie od 20 °C do 25 °C, w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność (światło włącza się o 07:00 godzin).
    UWAGA: Szczepy szczurów wykazywały różną wydajność podczas warunkowania strachu. Na przykład Schaap i in. (2013) stwierdzili, że szczepy Wistar i Lewis wykazywały dłuższy czas zamarzania w porównaniu ze szczurami płowymi z kapturem i brązowymi Norwegami12. W związku z tym należy ocenić różnice w bólu i progu termicznym w celu dostosowania intensywności i czasu trwania wstrząsów.
  2. Utrzymuj szczury na poziomie 85% ich wagi wolnej paszy (normalna waga między 350-400 g), zapewniając ograniczony dostęp do pożywienia o tej samej porze każdego dnia. Waż szczury codziennie o tej samej godzinie podczas cyklu światła. Oblicz wagę ad lib (100% wagi) na trzy dni przed rozpoczęciem rozszerzonego treningu kondycjonowania strachu.
    UWAGA: Zwierzęta wykorzystane w niniejszym eksperymencie zostały przetestowane na dodatkowych testach instrumentalnych, które nie są tutaj opisane. Do wykonania tych dodatkowych badań konieczne było przeprowadzenie deprywacji żywnościowej. Zakłada się, że ta zmiana proceduralna prawdopodobnie rozszerzy zakres obecnej procedury, ponieważ sugeruje możliwość stosowania testów łączonych z instrumentalnym strachem. Jednak badania wykorzystujące wyłącznie testy warunkowania strachu nie będą wymagały deprywacji żywności.
  3. Losowo przydziel badanych do jednej z następujących grup: testy emocjonalne 6 tygodni po treningu (n = 6); testy emocjonalne 48 godzin po treningu (n = 6).
  4. Wykonuj treningi i testy w podobnych godzinach, podczas fazy światła w cyklu ciemnego światła. Przypisz zwierzęta do tej samej komory doświadczalnej i utrzymuj tę samą kolejność zwierząt podczas treningu i testów.
    UWAGA: Dodatkową kontrolą, którą można wdrożyć, jest równoważenie kolejności zwierząt podczas faz treningu i testów. Zalecamy stosowanie tej techniki, gdy ocenianych jest wiele grup lub stosowane są różne zadania w eksperymentach, aby zmniejszyć możliwy wpływ kolejności zadań na zachowanie.

2. Ustawianie aparatury i kalibracja wstrząsów

  1. Oczyść wszystkie wewnętrzne powierzchnie komory doświadczalnej i podłogi z siatki ze stali nierdzewnej 10% etanolem. Powtórz tę czynność przed badaniem każdego zwierzęcia.
  2. Podłącz sprzęt do komputera za pomocą USB i uruchom sprzęt systemu wykrywania zamarzania: procesor, szafę sterowniczą, światło podczerwone, awersyjny stymulator/scrambler i kalibrator intensywności wstrząsów.
    UWAGA: Chociaż protokół ten został wykonany przy użyciu dostępnych na rynku instrumentów (Tabela materiałów), można korzystać ze sprzętu i oprogramowania różnych marek. Aparatura składa się z wewnętrznej akrylowej kwadratowej komory (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, zwanej komorą eksperymentalną) osadzonej w drewnianej skrzynce pokrytej plastikowym formikiem. Drzwi zewnętrzne pozwalają na izolację dźwięku, hałasu lub światła (drzwi skrzynkowe tłumiące). Kamera znajduje się z boku w wewnętrznej części drzwi zewnętrznych. Wewnętrzna akrylowa skrzynka z metalowymi kratkami podłogowymi (36 prętów ze stali nierdzewnej, każdy o średnicy 3 mm i rozstawionych 8 mm, od środka do środka) umożliwia przenoszenie wstrząsów nożnych. W jednej ze ścian wewnętrzno-bocznych w odległości 6 cm od podłogi znajduje się głośnik, który emituje sygnał dźwiękowy.
  3. Podłącz czerwone i czarne zaciski kalibratora intensywności wstrząsów (tj. złącza dodatnie i ujemne) do dwóch dowolnych prętów na podłodze siatki. Podłącz USB do odpowiedniego portu komputera. Upewnij się, że czerwone i czarne klipsy są połączone z prętami oddzielonymi innym prętem.
    UWAGA: W tej sekcji opisano proces kalibracji intensywności wstrząsów przy użyciu sprzętu określonej marki wymienionego w Tabeli materiałów. Jednak proces kalibracji można przeprowadzić przy użyciu sprzętu różnych marek. Zaleca się kalibrację intensywności wstrząsu w trzech sektorach dna siatki, aby sprawdzić, czy jest ona spójna. Ponadto należy zawsze usuwać resztki kału i moczu z podłogi siatki, aby uniknąć zakłóceń podczas dostarczania wstrząsu.
  4. Uruchom oprogramowanie kalibratora intensywności wstrząsów (Tabela materiałów). Wybierz natężenie 1,0 mA w aplikacji, klikając strzałkę zakresu. Następnie zmień przełącznik Uruchom/Stop na Uruchom.
    UWAGA: Proponujemy 1,0 mA w oparciu o nasze badania z modelami gryzoni w naszym laboratorium i literaturę, która podaje zakres od 0,75 mA do 1,5 mA jako odpowiedni do badań nad warunkowaniem strachu33,34,35.
  5. Włącz stymulator awersyjny lub sprzęt używany do dostarczania wstrząsów nożnych i spójrz na intensywność wstrząsu wyświetlaną na panelu aplikacji. W razie potrzeby ustaw intensywność na 1.0 mA za pomocą pokrętła na stymulatorze awersyjnym.
    UWAGA: Stymulator awersyjny powinien być ustawiony na "OUT", aby odpowiednio przetestować, skalibrować i przeprowadzić eksperyment.

3. Kalibracja systemu wykrywania zamarzania

  1. Zamknąć komorę doświadczalną i drzwi skrzynki wyciszającej. Nie należy w tym momencie wprowadzać zwierzęcia, ponieważ zostanie ono umieszczone w komorze po zakończeniu kalibracji systemu wykrywania zamarzania. Sprawdź, czy natężenie światła wewnątrz pudełka wynosi od 20 do 30 luksów.
  2. Uruchom oprogramowanie systemu wykrywania zamarzania i otwórz okno dialogowe Konfiguracja eksperymentu. Wprowadź szczegóły każdego tematu (takie jak numer identyfikacyjny uczestnika, data i grupa) i załaduj plik zatytułowany "Protokół treningowy VFC.pro" (dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    UWAGA: Testy kontekstu i cue używają innej konfiguracji programu; Dlatego upewnij się, że używasz właściwego pliku w każdym teście. W tym momencie prawidłowy plik odpowiada "Protokół treningowy VFC.pro". Pamiętaj, że w fazach testowych plik odpowiadający sesji treningowej będzie inny niż sesja treningowa.
  3. Wybierz odpowiednią kamerę (kamery) i zaznacz opcję Zapisz wideo (w razie potrzeby). Ustaw próg ruchu na 100, a minimalny czas zamrożenia na 30 klatek.
    UWAGA: Ta wartość progu ruchu zależy od rozmiaru użytego gatunku (na podstawie liczby pikseli). Minimalna wartość czasu zamrożenia jest zalecana przez producenta. Wartości te służą do zapewnienia prawidłowego rozpoznania zwierzęcia w komorze.
  4. Sprawdź, czy na ekranie pojawia się obraz na żywo z wybranej kamery (kamer) wraz z wykresem progu ruchu i osią czasu różnych bodźców, które są prezentowane podczas treningu (np. dźwięk i wstrząs).
    UWAGA: Korzystając z innej marki, konfiguracja sprzętu powinna oferować możliwość pomiaru ruchów zwierzęcia w celu wykrycia "indeksu" ruchu, który powinien umożliwić porównanie czasu, w którym zwierzę się porusza lub zamarza. Inną możliwością jest użycie oprogramowania, które tylko za pomocą źródła wideo (w trakcie lub po eksperymencie) może wykryć czas, w którym zwierzę jest w ruchu lub zamarza, takie jak darmowe oprogramowanie ImageFZ13, open-source toolbox w Matlab14, lub darmowy klasyfikator zachowania zwierząt jako JAABA15.
  5. Kliknij opcję Kalibruj trzy razy, sprawdzając, czy wskaźnik ruchu pozostaje poniżej 100 (próg). Następnie ustaw sprzęt tak, aby się zablokował, klikając odpowiedni przycisk na ekranie.
    UWAGA: W tej sekcji opisano proces kalibracji systemu wykrywania zamarzania przy użyciu sprzętu określonej marki wymienionego w Tabeli materiałów. Jak wspomniano wcześniej, proces kalibracji może być przeprowadzany przy użyciu sprzętu różnych marek (przegląd różnych opcji w sprzęcie i oprogramowaniu patrz Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Rozszerzony trening warunkowania strachu

  1. Szczury należy przetransportować w ich domowych klatkach, przykrytych szmatką, z placówki opieki nad zwierzętami do sali treningu behawioralnego w laboratorium. Unikaj narażenia na hałas lub warunki generujące stres podczas transportu zwierząt do sali szkolenia behawioralnego. Jeżeli w tym samym czasie transportowanych jest kilka zwierząt, należy przywieźć tylko te zwierzęta do badań, a inne szczury trzymać w pomieszczeniu w celu zwiększenia kontroli doświadczalnej. Delikatnie obchodź się ze zwierzętami przez 2 minuty przed rozpoczęciem treningu.
    UWAGA: W protokole zwierzęta były dotykane codziennie przez 2 minuty przed treningiem behawioralnym. Po obróbce zwierzęta zostały wprowadzone do komory doświadczalnej. Zalecamy manipulowanie zwierzętami, aby szczury przyzwyczaiły się do badacza.
  2. Wprowadź szczura do komory doświadczalnej. Chwyć go delikatnie za podstawę ogona i umieść na środku komory. Zamknąć komorę doświadczalną i drzwi skrzynki wyciszającej.
  3. Rozpocznij sesję, klikając przycisk Nagraj. Pozwól szczurowi zaaklimatyzować się w komorze przez 3 minuty. Ten 3-minutowy okres jest standardem zalecanym przez producenta sprzętu i służy jako punkt odniesienia i czas przyzwyczajenia do komory.
  4. Dostarcz dwadzieścia pięć par ton-szok (próby) z 60-sekundowym interwałem międzypróbnym (ITI), zaczynając od 3 minuty sesji. Przedstaw ton (bodziec warunkowy – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50-ms Rise Time) podczas ostatnich 10 s każdego ITI, a szok (bodziec bezwarunkowy – US) podczas ostatnich 2 s każdego ITI.
    UWAGA: Aktywacja przycisku nagrywania jest uzależniona od prawidłowej kalibracji i zablokowania kamer.
  5. Usuń szczura z komory doświadczalnej po zakończeniu 28-minutowej sesji. Umieść zwierzęta z powrotem w odpowiedniej klatce domowej. Przetransportuj szczury w ich domowych klatkach przykrytych szmatką z sali treningu behawioralnego do placówki opieki nad zwierzętami.
  6. Powtórz kalibrację systemu wykrywania zamarzania (kroki 3.1-3.5) i warunkowanie strachu (kroki 4.1 i 4.3), aby wyszkolić wszystkich badanych.
    UWAGA: Zdecydowanie zalecamy ponowną kalibrację systemu wykrywania dla każdego zwierzęcia, aby upewnić się, że oprogramowanie utrzymuje te same parametry podczas przetwarzania informacji w celu wykrycia zamrożenia.
  7. Okres spoczynku: W tym okresie zwierzęta powinny odpoczywać pojedynczo w swoich klatkach domowych. Monitorować masę ciała zwierząt dwa razy w tygodniu przez 6 tygodni okresu inkubacji. Delikatnie manipuluj każdym zwierzęciem przez dwie minuty, gdy są ważone.

5. Test kontekstowy – pojedyncza 10-minutowa sesja

  1. Po fazie treningu poddaj zwierzęta pierwszemu testowi pamięci zwanemu testem kontekstowym. Podczas tej 10-minutowej fazy wystaw szczury na ten sam kontekst, w którym odbył się trening, ale nie prezentuj wskazówek ani wstrząsów. Szczury należy przetransportować w ich zakrytych klatkach domowych (np. za pomocą szmatki) z placówki opieki nad zwierzętami do sali treningu behawioralnego. Należy pamiętać, że zwierzęta zostały podzielone na grupy, więc jedna grupa jest testowana 48 godzin po fazie treningu, a druga grupa jest testowana 6 tygodni po treningu (patrz Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Kalendarium eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Oczyść wszystkie wewnętrzne powierzchnie komory doświadczalnej i podłogi z siatki ze stali nierdzewnej 10% etanolem. Powtórz tę czynność przed badaniem każdego zwierzęcia.
  2. Powtórz kalibrację systemu wykrywania zamarzania (kroki od 3.1 do 3.5). Otwórz okno dialogowe Ustawienia eksperymentu i załaduj plik o nazwie "Context test protocol.pro", który jest dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    UWAGA: Ten plik zawiera konfigurację dla tej fazy eksperymentalnej, która nie składa się z żadnych wstrząsów ani tonów.
  3. Wprowadź zwierzę do komory doświadczalnej. Chwyć go delikatnie za podstawę ogona i umieść na środku komory. Zamknąć komorę doświadczalną i drzwi skrzynki wyciszającej.
  4. Rozpocznij sesję, klikając przycisk Nagraj. Podczas tej pojedynczej 10-minutowej sesji testu kontekstowego nie są prezentowane żadne bodźce (szok ani dźwięk).
  5. Usuń testera z komory eksperymentalnej po zakończeniu 10-minutowej sesji. Wróć zwierzęta do odpowiednich klatek i przetransportuj szczury w ich zadaszonych klatkach domowych z sali treningu behawioralnego do placówki opieki nad zwierzętami. Powtórz kroki 5.2-5.5, aby przetestować wszystkich badanych.

6. Test Cue – pojedyncza 13-minutowa sesja

  1. Dzień po teście kontekstowym niech zwierzęta poddają się drugiemu testowi pamięci zwanemu testem wskazówek. Podczas tej fazy szczury będą w innym kontekście treningu przez 13 minut; Sygnały (tony) są prezentowane, ale nie są dostarczane żadne wstrząsy. Przetransportuj szczury w ich domowych klatkach przykrytych przykryciem z placówki opieki nad zwierzętami do sali treningu behawioralnego. Przetestuj grupę 72 godziny po treningu warunkowania strachu i przetestuj inną grupę 6 tygodni i jeden dzień po treningu (Rysunek 1).
    UWAGA: Można by zastosować inny system transportu (z placówki opieki nad zwierzętami do pomieszczenia doświadczalnego), aby bardziej zróżnicować kontekst i testy wskazówek. Ponieważ zwierzęta były transportowane na sesję treningową i sesję testu kontekstowego w swoich klatkach domowych, podczas transportu na sesję testową można było użyć innej klatki transportowej, ściółki i/lub pokrywy.
  2. Oczyść wszystkie wewnętrzne powierzchnie komory doświadczalnej i podłogi z siatki ze stali nierdzewnej 10% etanolem. Powtórz tę czynność przed badaniem każdego zwierzęcia.
  3. Aby zmienić kontekst wizualny, włóż plastikową ścianę otaczającą do komory doświadczalnej.
  4. Aby zmienić kontekst węchowy, nałóż 1% kwas octowy na wacik z bawełnianą końcówką i umieść go w metalowej tacy pod podłogą siatki17,18,19.
  5. Powtórz kalibrację systemu wykrywania zamarzania (kroki 3.1-3.5). Załaduj plik o nazwie file "Cue test protocol.pro", który jest dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    UWAGA: Ten plik zawiera ustawienia dla tej fazy eksperymentalnej, która polega na dostarczaniu tych samych tonów, które są prezentowane podczas fazy treningu (CS), ale przy braku wstrząsów (US).
  6. Wprowadź zwierzę do komory doświadczalnej. Chwyć go delikatnie za podstawę ogona i umieść na środku komory. Zamknąć komorę doświadczalną i drzwi skrzynki wyciszającej.
  7. Rozpocznij sesję, klikając przycisk Nagraj. Podczas pojedynczej 13-minutowej sesji testowej cue, bodziec CS (ton) jest prezentowany 10 razy, począwszy od 3 minuty sesji.
    UWAGA: Pierwsze 3 minuty odpowiadają linii bazowej tej sesji, po której następuje 10 prób testowych wskazówek (to znaczy 10 s każda) przeprowadzonych z 50-sekundowymi ITI przy braku wstrząsów. Dostarczanie tonów odbywa się automatycznie, poprzez wykorzystanie wcześniej załadowanego pliku.
  8. Usuń zwierzę z komory doświadczalnej po zakończeniu 13-minutowej sesji. Zwróć zwierzęta do odpowiedniej klatki i przetransportuj je pod przykryciem do placówki opieki nad zwierzętami. Powtórz kroki od 6.2 do 6.5, aby przetestować wszystkich badanych.

7. Analiza danych

  1. Uzyskaj ogólny wskaźnik aktywności (tj. indeks ruchu), który jest uzyskiwany ze strumienia wideo, za pomocą oprogramowania systemu wykrywania zamarzania. To oprogramowanie automatycznie przekształca indeks ruchu, aby zapewnić procent czasu zamrażania na sesję i liczbę epizodów zamrożenia. Ustaw próg zamrożenia na domyślne ustawienie Minimalny czas trwania zamrożenia systemu (1 s = 30 klatek).
  2. Użyj dodatkowego, specjalnie przygotowanego programu (plik dostępny pod adresem http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ), aby uzyskać:
    1. Użyj programu, aby określić procent zamrożenia podczas pierwszych trzech minut sesji treningowej (tj. zamrożenia linii bazowej, ponieważ przed lub w trakcie tego 3-minutowego okresu nie wystąpiły żadne wstrząsy ani dźwięki) oraz podczas pierwszych trzech minut sesji testu cue.
    2. Użyj programu, aby określić procent zamrożenia dla każdego z ośmiu 3-minutowych przedziałów sesji treningowej.
    3. Użyj programu, aby określić procent zamrożenia podczas prezentacji cue (tj. zamrożenia podczas tonów) i okresów braku cue (interwały międzypróbne; ITI), zarówno dla sesji szkoleniowych, jak i cue-testowych.
  3. Aby uzyskać te dane, otwórz oprogramowanie systemu wykrywania zamarzania.
    1. Wybierz punkt menu Plik | Raporty | Podsumowanie składnika wsadowego.
    2. Wybierz plik z rozszerzeniem . CMP dostępny od http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Nazwij plik wyjściowy i zmień wartość Próg ruchu na 100. Następnie kliknij przycisk OK.
    4. Wybierz pliki, które mają być analizowane (rozszerzenie . SUROWE). Pliki te są generowane automatycznie z oprogramowania systemu wykrywania zawieszania się po zakończeniu sesji i odpowiadają nieprzetworzonym danym każdej sesji. Początkowo pliki są zapisywane na pulpicie komputera, ale mogą być przechowywane w niestandardowym folderze (np. Documents-Fear conditioning), aby ułatwić ich późniejszą identyfikację i otwarcie, gdy trzeba je przeanalizować.
    5. Otwórz pliki wyjściowe (rozszerzenie . Plik CSV). Można je edytować w arkuszu kalkulacyjnym w celu dalszej analizy. Ten plik zawiera wyniki zawieszania się podczas sesji eksperymentalnej.
      UWAGA: Aby uzyskać całkowity procent zamrożenia, podziel czas, który badany spędził w bezruchu, przez całkowity czas sesji. Liczbę epizodów zawieszania można obliczyć, zliczając liczbę zdarzeń zawieszania się w trakcie sesji. W obu przypadkach konieczne jest zdefiniowanie progu ruchu w oparciu o minimalny czas trwania zamrożenia. Jest to kryterium czasowe, które określa, czy odcinek Zamrożenia jest nagrywany. Zautomatyzowane systemy nagrywania mogą wykorzystywać określoną liczbę klatek na sekundę (fps) jako miarę minimalnego czasu trwania zamrożenia. Na przykład, przy częstotliwości próbkowania 30 kl./s, minimalny czas trwania zamrożenia wynoszący 15 klatek spowoduje zarejestrowanie jako zamrożenie wystąpienia bezruchu, które trwa 30 s.
  4. Oblicz średni czas trwania każdego epizodu zamrożenia dla każdej sesji (trening i oba testy, kontekst i wskazówka), dzieląc całkowity czas trwania zamrożenia (w sekundach) przez całkowitą liczbę epizodów zamrożenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnice w procentowym czasie zamrożenia podczas różnych etapów sesji treningowej zostały przeanalizowane dla wszystkich badanych (n = 12) za pomocą testu zależnego t (Tabela 1). Zwierzęta były aktywne i eksplorowały komorę eksperymentalną przez pierwsze trzy minuty sesji treningowej (pierwszy dzień protokołu), w czasie, w którym nie wydano żadnych dźwięków ani wstrząsów (tj. linia bazowa BL). Jak pokazano w Rysunek 2A, procent czasu zamrożenia pod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny rozszerzony protokół warunkowania strachu jest skutecznym i ważnym podejściem do oceny pamięci emocjonalnej w krótkich (48 godzin) i długoterminowych okresach (6 tygodni). Tym samym protokół pozwala na badanie zjawisk przetrenowania i inkubacji strachu u szczurów. Wśród różnych zalet tego protokołu są następujące. Oferuje dwa rodzaje testów pamięciowych, a mianowicie kontekst i cue, które pozwalają zidentyfikować efekt różnicowy dwóch opóźnień (48 godzin i 6 tygodni) w manipulacjach kontekstem i cue. Po drugie, za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe dla tych badań zostało zapewnione przez Fundación Universitaria Konrad Lorenz - grant numer 9IN15151. Autorzy pragną podziękować Działowi Komunikacji Uniwersytetu Konrada Lorenza za pomoc w nagraniu i montażu filmu, a w szczególności Natalii Riverze i Andrésowi Serrano (producenci). Nicole Pfaller-Sadovsky i Lucia Medina za komentarze do manuskryptu oraz Johanna Barrero, dziekan Corporacion Universitaria Iberoamericana, za współpracę instytucjonalną. Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy (kwas etanowy)https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Pakiet prądowy stymulacji awersyjnejMED Associates IncENV-420https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Test kontekstowy protocol.pro
http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ Test Cue protocol.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Zakrzywiona wkładkaścienna MED Associates IncVFC-008-CWIhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.ziphttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Skrzynka kontrolna NIR/światła białegoMED Associates IncNIR-100
Szybka wymiana Jednostka podłogowa/patelnia do myszyMED Associates IncENV-005FPU-Mhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Mała szafka stołowa i zasilaczMED Associates IncSG-6080Dhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Samodzielny stymulator awersyjny/scrambler (115 V / 60 Hz)MED Associates IncENV-414Shttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standardowa komora do kondycjonowania strachuMED Associates IncVFC-008https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Protokół treningowy VFC.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Pakiet kondycjonowania strachu wideo dla szczuraMED Associates IncMED-VFC-SCT-R
https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
  2. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
  3. Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
  4. Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
  5. LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
  6. Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
  7. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  8. Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
  9. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, Unit-6.27 (2013).
  10. Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
  11. Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
  12. Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339(2013).
  13. Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871(2014).
  14. Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349(2014).
  15. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  16. Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
  17. Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
  18. Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99(2018).
  19. Chang, C. H., et al. Fear extinction in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 (SUPPL. 47) (2009).
  20. Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, 1-18 (2013).
  21. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
  22. Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
  23. Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 - Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
  24. Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
  25. Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
  26. Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
  27. Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
  28. Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
  29. Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824(2019).
  30. Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
  31. Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
  32. Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091(2019).
  33. Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
  34. Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  35. Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , Elsevier B.V. (2018).
  36. Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M'hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
  37. Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
  38. Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266(2020).
  39. Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
  40. Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
  41. Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
  42. Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
  43. Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
  44. Frey, P., Eng, S., Gavinf, W. Conditioned suppression in the gerbil. Behavior Research Methods & Instrumentation. 4 (5), 245-249 (1972).
  45. Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
  46. Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
  47. Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Parowanie ton wstrz stest kontekstowytest wskaz wkireakcja zamarciaprotok nadmiernego trenowaniapami emocjonalnaszczury Wistar

Powiązane artykuły