Artykuł metodologiczny

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

DOI:

10.3791/60538

⸱

13 grudnia 2019

 ,  , 
1Center for Nanomedicine and Theranostics, Technical University of Denmark, 2Center for Intestinal Absorption and Transport of Biopharmaceuticals, Technical University of Denmark, 3Department of Health Technology, Technical University of Denmark

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość badań wykorzystujących liposomy jako systemy modelowe lub nośniki dostarczania leków opiera się na technikach masowego odczytu, a więc zakłada, że wszystkie liposomy w zespole są identyczne. Jednak nowe platformy eksperymentalne zdolne do obserwacji liposomów na poziomie pojedynczych cząstek umożliwiły przeprowadzenie wysoce zaawansowanych i ilościowych badań nad interakcjami białko-błona lub właściwościami nośnika leku na poszczególnych liposomach, unikając w ten sposób błędów związanych z uśrednianiem zespołowym. W tym miejscu przedstawiamy protokół przygotowania, wykrywania i analizy pojedynczych liposomów za pomocą testu mikroskopowego opartego na fluorescencji, ułatwiający takie pomiary pojedynczych cząstek. Konfiguracja pozwala na obrazowanie pojedynczych liposomów w masywny sposób równoległy i jest wykorzystywana do ujawniania niejednorodności wielkości i składu próbki. Ponadto protokół opisuje zalety badania liposomów na poziomie pojedynczego liposomu, ograniczenia testu oraz ważne cechy, które należy wziąć pod uwagę podczas jego modyfikacji w celu zbadania innych pytań badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liposomy to kuliste pęcherzyki na bazie fosfolipidów, które są intensywnie wykorzystywane zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych. Funkcjonują one jako doskonałe systemy modeli błonowych, ponieważ ich właściwościami fizykochemicznymi można łatwo manipulować poprzez różnicowanie składników lipidowych tworzących liposom1,2. Ponadto liposomy stanowią najczęściej stosowany system nanonośników dostarczający leki, oferując lepszą farmakokinetykę i farmakodynamikę, a także wysoką biokompatybilność3.

Przez wiele lat, liposomy były głównie badane przy użyciu technik masowych, dając dostęp tylko do średnich wartości odczytu zespołu. Doprowadziło to do tego, że większość tych badań zakłada, że wszystkie liposomy w zespole są identyczne. Jednak takie wartości uśrednione zespołowo są poprawne tylko wtedy, gdy bazowy zestaw danych jest równomiernie rozłożony wokół wartości średniej, ale mogą reprezentować fałszywy i tendencyjny wniosek, jeśli zestaw danych obejmuje na przykład wiele niezależnych populacji. Dodatkowo, zakładając, że średnia zespołu reprezentuje całą populację, można przeoczyć informacje zawarte w niejednorodności między liposomami. Dopiero niedawno pojawiły się testy ilościowe, które są w stanie badać pojedyncze liposomy, ujawniając duże niejednorodności między poszczególnymi liposomami w odniesieniu do ważnych właściwości fizykochemicznych, w tym wielkości liposomów4, składu lipidów5,6, oraz efektywność enkapsulacji7, podkreślając znaczenie badania liposomów na poziomie pojedynczego liposomu.

Obszar badań, w którym wykazano, że grupowe uśrednianie właściwości liposomów jest stronnicze, bada zależne od wielkości liposomów interakcje białko-błona8,9. Tradycyjnie, naukowcy badający takie procesy ograniczali się do przygotowywania liposomów o różnych średnich średnicach przez wytłaczanie przez filtry o różnych rozmiarach porów9. Jednak wyodrębnienie średnicy poszczególnych liposomów za pomocą testów pojedynczych liposomów ujawniło duże nakładanie się populacji, przy czym liposomy wytłaczane przy użyciu filtrów 100 nm i 200 nm wykazują do 70% nakładania się w rozkładzie wielkości4. Może to poważnie zniekształcić masowe pomiary zależnych od wielkości liposomów interakcji białko-błona10. Przeprowadzając badania interakcji błona-białko przy użyciu testu pojedynczego liposomu, naukowcy wykorzystali zamiast tego polidyspersyjność wielkości w próbce, co pozwoliło im zbadać szeroki zakres średnic liposomów w każdym pojedynczym eksperymencie, ułatwiając nowe odkrycia dotyczące tego, jak krzywizna i skład błony mogą wpływać na rekrutację białek do błon4,11,12. Inną dziedziną, w której zastosowanie pojedynczych testów liposomowych okazało się instrumentalne, są mechanistyczne badania fuzji błon za pośrednictwem białek13,14. W przypadku takich pomiarów kinetycznych możliwość badania pojedynczych zdarzeń fuzji zmniejszyła potrzebę eksperymentalnej synchronizacji procesu fuzji, umożliwiając nowe mechanistyczne spostrzeżenia, które w przeciwnym razie zostałyby utracone w uśrednianiu czasoprzestrzennym wykonywanym w masowych pomiarach zespołowych. Dodatkowo, pojedyncze liposomy zostały wykorzystane jako rusztowanie błonowe, umożliwiając pomiar pojedynczych białek i oferując nową wiedzę na temat dynamiki strukturalnej białek transbłonowych15,16. Co więcej, takie konfiguracje oparte na proteoliposomach umożliwiły zbadanie funkcji poszczególnych transporterów transbłonowych17 i tworzących pory kompleksów białkowych18, a także mechanizmu działania bioaktywnych peptydów przenikających błony19. Pojedyncze liposomy były również stosowane jako nanofluidyki miękkiej materii z unieruchomionymi powierzchniowo pojedynczymi liposomami służącymi jako komory do reakcji enzymatycznych w objętościach 10-19 l, zwiększając przepustowość i złożoność testów przesiewowych przy minimalnym zużyciu produktu20.

Ostatnio, testy pojedynczych liposomów były używane do charakteryzowania liposomów dostarczających leki na niespotykanym wcześniej poziomie szczegółowości. Naukowcom udało się określić ilościowo znaczące niejednorodności w ilości polimeru przyłączonego do powierzchni poszczególnych liposomów21. Testy pojedynczych liposomów pozwoliły również na pomiary liposomów dostarczających leki w złożonych podłożach, takich jak osocze krwi, ujawniając, w jaki sposób elementy zakotwiczone w powierzchni liposomu przez kotwice lipidowe mogą być podatne na dysocjację, gdy liposomy są wystawione na warunki naśladujące te doświadczane podczas krążenia in vivo22. Ogólnie rzecz biorąc, wszechstronność i użyteczność testów pojedynczego liposomu jest uzasadniona przez ogromną różnorodność problemów, do rozwiązania których te konfiguracje zostały zastosowane, i przewidujemy, że metodologia będzie nadal rozwijana i znajdzie zastosowanie w nowych dziedzinach naukowych.

Tutaj opisujemy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, który pozwala na badanie pojedynczych liposomów w sposób wysokoprzepustowy (Rysunek 1). Aby zilustrować metodę, używamy jej do ilościowego określenia wielkości i niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami w zespole. Test wykorzystuje obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym pojedynczych liposomów unieruchomionych na pasywowanej powierzchni szkła. Najpierw opisujemy krytyczne etapy procesu wytwarzania liposomów, które zapewniają prawidłowe znakowanie i unieruchomienie liposomów fluorescencyjnych. Następnie opisujemy przygotowanie powierzchni potrzebne do ułatwienia immobilizacji liposomów, zanim przedstawimy procedurę zapewnienia odpowiedniej gęstości powierzchni liposomów. Omawiamy parametry mikroskopowe ważne dla uzyskania wysokiej jakości obrazów i nakreślamy, w jaki sposób przeprowadzić prostą analizę danych, pozwalającą na ekstrakcję wielkości liposomów i niejednorodności składu. Ten ogólny protokół powinien stanowić dobrą podstawę dla zainteresowanego badacza do dalszego rozwijania testu w celu ukierunkowania na jego konkretne zainteresowania badawcze

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie liposomów

UWAGA: Krótko mówiąc, przygotowanie liposomów zazwyczaj obejmuje trzy kluczowe kroki: 1) przygotowanie suchych warstw lipidowych o pożądanym składzie lipidowym; 2) rehydratacja lipidów w celu wytworzenia liposomów; oraz 3) kontrolowanie wielkości i blaszkowatości populacji liposomów.

  1. Odważyć lipidy i rozpuścić je w tert-butanolu:wodzie (9:1) w szklanych fiolkach.
    1. Rozpuścić POPC (1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholinę; MW = 760 g/mol) do 50 mM.
    2. Rozpuścić cholesterol (MW = 387 g/mol) do 25 mM.
    3. Rozpuścić DOPE-Atto488 (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-Atto488; MW = 1,316 g/mol) do 0,1 mM.
    4. Rozpuścić DOPE-Atto655 (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę-Atto655; MW = 1,368 g/mol) do 0,1 mM.
    5. Rozpuścić DSPE-PEG2000-biotynę (1,2-distearylo-sn-glicero-3-fosforanoloaminę-N-[biotynylo(glikol polietylenowy)-2000]; MW = 3,017 g/mol) do 0,1 mM.
      UWAGA: Podgrzej lipidy do 55 °C i użyj mieszania magnetycznego w celu zapewnienia całkowitego rozpuszczenia lipidów. Alternatywnie można skorzystać z kąpieli sonizacyjnej. Niewykorzystane zapasy lipidów można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  2. Wymieszaj zapasy lipidów przygotowane w kroku 1.1 z stosunkiem molowym POPC:cholesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotyna 68,95:30:0,5:0,5:0,05, dodając 138 μl POPC, 120 μl cholesterolu, 500 μl każdego fluorescencyjnie znakowanego lipidu i 50 μl DSPE-PEG-biotyny do świeżej szklanej fiolki.
    UWAGA: Dokładny skład liposomów można łatwo zmodyfikować w celu rozwiązania konkretnego pytania będącego przedmiotem zainteresowania. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
  3. Poluzować pokrywkę szklanej fiolki i zatrzaskowo zamrozić fiolkę w ciekłym azocie.
  4. Liofilizuj zamrożoną mieszaninę lipidów przez noc.
  5. Dodać 1 ml 200 mM buforu D-sorbitolu (buforu sorbitolu) do suchych lipidów.
  6. Podgrzać mieszaninę do temperatury 45 °C i wystawić na mieszanie magnetyczne przez co najmniej 1 h.
    UWAGA: Bufor powinien odzwierciedlać konkretne pytanie, które jest poruszane (np. warunki fizjologiczne do badania interakcji błona-białko lub określony klinicznie zatwierdzony bufor do badania liposomów dostarczających leki). Jeśli jednak do badania nie jest wymagany określony bufor, można zastosować bufor bez jonów do ponownego nawodnienia w celu zmniejszenia wielopłytkowości liposomów.
  7. Zamrozić zawiesinę lipidową, zanurzając fiolkę w ciekłym azocie i poczekać, aż zawiesina zostanie całkowicie zamrożona.
  8. Zanurzyć zamrożoną zawiesinę w łaźni grzewczej o temperaturze 55 °C aż do całkowitego rozmrożenia mieszaniny.
  9. Powtarzaj kroki 1.7 i 1.8, aż zawiesina liposomowa zostanie wystawiona na działanie łącznie 11 cykli zamrażania/rozmrażania.
    UWAGA: Wykazano, że powtarzające się cykle zamrażania/rozmrażania zmniejszają wielopłytkowość liposomów23, co ma kluczowe znaczenie dla dokładności testu pojedynczego liposomu, ponieważ liposomy wielopłytkowe będą zniekształcać intensywność fluorescencji w stosunku do wielkości liposomów liposomów. Wielopłytkowość jest zwykle z natury niska, gdy w preparacie znajduje się więcej niż 0,5% pegylowanego lipidu (tak jak zwykle stosuje się w liposomach do dostarczania leków)24.
  10. Wytłacz zawiesinę liposomów raz przez filtr poliwęglanowy 800 nm za pomocą mini zestawu do wytłaczania. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi montażu zestawu do wytłaczania (patrz Tabela materiałów).
  11. Przechowuj liposomy w temperaturze 4 °C przez noc.

2. Przygotowanie powierzchni komory obrazowania

  1. Przygotować albuminę surowicy bydlęcej (BSA; 1 mg/ml), BSA-biotynę (1 mg/ml) i streptawidynę (0,025 mg/ml) w 10 mM buforze HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym) 95 mM NaCl (bufor HEPES).
    UWAGA: Aby zapobiec pęknięciu liposomalnemu, bufor sorbitolu używany do rehydratacji i bufor HEPES używany do przygotowania powierzchni powinny być izotoniczne. W związku z tym zaleca się sprawdzenie osmolarności przed eksperymentem.
  2. Zmieszać 1 200 μl BSA i 120 μl biotyny BSA i dodać 300 μl mieszaniny do każdej studzienki w 8-dołkowym szkiełku do mikroskopii.
    UWAGA: Tutaj używamy dostępnego na rynku 8-dołkowego szkiełka mikroskopowego ze szklanym dnem (patrz Tabela materiałów), ale protokół można łatwo dostosować do niestandardowych komór mikroskopowych.
  3. Inkubować szkiełko przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Przemyć szkiełko 8x 300 μl buforu HEPES.
    UWAGA: Uważaj, aby nie pozostawiać studzienek bez bufora na dłużej niż kilka sekund, ponieważ wysuszenie powierzchni spowoduje jej uszkodzenie. Ponadto należy uważać, aby nie zarysować powierzchni końcówką pipety, ponieważ może to również spowodować jej uszkodzenie. Tak więc, zasysając bufor ze studni, rób to od krawędzi lub rogu.
  5. Dodać 250 μl streptawidyny i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Powtórz 8 prań opisanych w kroku 2.4.
  7. Przechowywać szkiełko mikroskopowe z 300 μl buforu sorbitolu w każdym dołku w temperaturze 4 °C. Odparowanie rozpuszczalnika uszkodzi powierzchnię, dlatego umieścić szkiełko mikroskopowe na szalce Petriego i uszczelnić je parafilmem, chyba że przygotowany szkiełko zostanie natychmiast zużyty.

3. Unieruchomienie liposomów

  1. Rozcieńczyć zawiesinę liposomów do około 20 μM całkowitego lipidu w buforze sorbitolu. Procedura opisana w sekcji 1 pozwoli uzyskać zawiesinę liposomów o całkowitej zawartości lipidów około 10 mM.
  2. Umieść szkiełko na mikroskopie i skup się na powierzchni komory, wykorzystując jako wskazówkę zwiększony sygnał odbicia laserowego z interfejsu szkło/bufor
    3. .
  3. Przemyć komorę 4x 300 μL świeżego buforu HEPES.
  4. Dodać 10 μl rozcieńczonego wywaru liposomowego (20 μM całkowitego lipidu) do probówki mikrowirówkowej.
  5. Wyjąć 100 μl buforu z komory, dodać do probówki mikrowirówkowej przygotowanej w kroku 3.4, odpowiednio wymieszać i włożyć 110 μl z powrotem do komory.
  6. Umieść próbkę pod mikroskopem i użyj podstawowego ustawienia mikroskopu zdolnego do wykrywania sygnału z fluoroforu liposomowego, aby obserwować liposomy unieruchomione na powierzchni.
  7. Dąż do uzyskania gęstości powierzchni liposomów, która jest jednocześnie wystarczająco rzadka, aby zidentyfikować poszczególne liposomy i wystarczająco gęsta, aby ułatwić pomiary o wysokiej przepustowości. Zazwyczaj przy użyciu pola widzenia 50 μm x 50 μm, optymalna jest 300−400 liposomów na klatkę (Rysunek 2). Zwykle można to osiągnąć w ciągu 5−10 min.
    UWAGA: Jeżeli w polu widzenia wykryte są tylko szybko poruszające się cząstki fluorescencyjne, przyczyną może być brak lub zbyt niskie stężenie któregokolwiek ze składników krytycznych dla procesu immobilizacji (BSA-biotyna, streptawidyna, DOPE-PEG-biotyna). Jeśli nie zostaną wykryte żadne liposomy, może to być związane z niskim stężeniem liposomów, niewłaściwymi ustawieniami wykrywania fluorescencji lub potencjalnie obrazowaniem z płaszczyzną ogniskową nie na powierzchni szkła.
  8. Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości powierzchni liposomu należy przemyć komorę 3x 200 μL buforu HEPES.
    UWAGA: Należy pamiętać, że kinetyka immobilizacji zależy również od właściwości liposomów, takich jak rozmiar i ładunek, dlatego powinna być zawsze optymalizowana dla każdego preparatu liposomowego.

4. Akwizycja obrazu

UWAGA: Ta sekcja będzie w dużej mierze zależeć od systemu mikroskopowego dostępnego dla badacza przeprowadzającego eksperyment. W ten sposób zostaną opisane ogólne wytyczne dotyczące sposobu wykonywania obrazowania. Jednak dokładne ustawienia i sposób ich stosowania będą się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopu. Na przykład niektóre systemy umożliwiają wybór dowolnej kombinacji filtrów emisyjnych, podczas gdy inne mikroskopy są wyposażone w specjalne, wstępnie ustawione filtry.

  1. Ustaw mikroskop do obrazowania pojedynczych liposomów. Aby zapewnić optymalną jakość obrazu i późniejszą analizę danych, należy użyć wysokiej rozdzielczości w skali szarości i schematu pikseli, który pozwala na nadpróbkowanie poszczególnych liposomów. Zalecana jest głębia bitowa 16 i co najmniej 1 024 x 1 024 pikseli dla obszaru 50 μm x 50 μm. Jeśli jest to możliwe, można z korzyścią zastosować uśrednianie linii w celu zmniejszenia szumów (np. 3 skany na linię).
  2. Wybierz moc lasera wzbudzającego, która zapewnia zarówno nieznaczne wybielanie klatka po klatce, jak i wystarczająco silny sygnał, aby wyraźnie odróżnić poszczególne liposomy od tła. Optymalne ustawienie będzie zależało od konkretnego użytego mikroskopu, a także od kombinacji fluoroforów. Upewnij się, że detektory nie są nasycone, ponieważ spowoduje to odchylenie kwantyfikacji intensywności.
  3. Obrazowanie zarówno fluoroforów DOPE-Atto488, jak i DOPE-Atto655 w liposomach wymaga obrazowania wielu kanałów. Dlatego upewnij się, że każdy kanał jest obrazowany sekwencyjnie, aby uniknąć wzbudzenia krzyżowego. Na przykład, najpierw wykonaj jedno zdjęcie, wzbudzając przy 488 nm i odczytując emisję przy 495−560 nm. Następnie wykonaj kolejne zdjęcie, wzbudzając je przy długości fali 633 nm, ale odczytując emisję tylko przy długości fali 660−710 nm. Specyfika będzie zależeć od systemu mikroskopowego (np. jakie lasery i filtry) jest dostępny.
  4. Upewnij się, że pokryłeś różne obszary powierzchni, uzyskując co najmniej 10 obrazów próbki, obrazując w ten sposób co najmniej 3,000 pojedynczych liposomów. Jeśli gęstość powierzchni jest mniejsza niż 300 liposomów/klatkę, uzyskaj więcej obrazów. Upewnij się, że ponownie ustawiasz ostrość mikroskopu dla każdego nowego obrazu.
    UWAGA: W przypadku obrazowania dwukanałowego należy pamiętać o nazwaniu plików obrazów tak, aby można było łatwo zidentyfikować pary obrazów z tymi samymi liposomami w różnych kanałach fluorescencyjnych podczas analizy danych.
  5. W celu ilościowego określenia niepewności doświadczalnej związanej z pomiarem niejednorodności składu, należy zobrazować ten sam obszar liposomów przed i po ponownym ogniskowaniu (patrz Rysunek 3 i opis w tekście).
  6. Eksportuj obrazy z oprogramowania mikroskopu jako pliki .tiff. Eksportuj pojedynczo dwa kanały tych samych liposomów.

5. Analiza danych

UWAGA: Specjalnie opracowane zautomatyzowane procedury dopasowania Gaussa 2D były wcześniej stosowane6,11,12. Jednak, aby zwiększyć stosowalność metody, opisano proces analizy danych, który można łatwo wdrożyć we wszystkich laboratoriach.

  1. Załaduj odpowiednią parę obrazów .tiff dwóch różnych kanałów fluorescencyjnych w tym samym polu obrazowania do oprogramowania FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
  2. Z menu Obraz wybierz polecenie Kolor i użyj funkcji Scal kanał, aby utworzyć kompozyt dwóch kanałów.
  3. Obserwuj, czy liposomy zobrazowane w dwóch różnych kanałach wykazują dobrą kolokalizację lub czy wystąpił widoczny dryf.
    UWAGA: W przypadku dryftu między dwoma kanałami fluorescencyjnymi (rozpoznawanego jako systematyczne i równe przesunięcie X-Y między sygnałem w dwóch kanałach), jedna z ramek może zostać przetłumaczona za pomocą funkcji Transform > Translate w menu Obraz FIDŻI. Należy jednak zachować ostrożność przy takiej manipulacji obrazem. Dlatego zaleca się, aby zamiast tego unikać dryftu w jak największym stopniu podczas obrazowania liposomów.
  4. Upewnij się, że wtyczka ComDet (wersja 0.3.6.1 lub nowsza) jest zainstalowana lub zrób to w menu Wtyczki.
  5. Otwórz wtyczkę ComDet, aby wykryć cząsteczki, przechodząc do menu Wtyczki i wybierając ComDet v.0.3.6.1 > Wykryj cząstki.
  6. W ComDet upewnij się, że wybrałeś funkcję Wykrywaj cząstki na obu kanałach indywidualnie. Ustaw maksymalną odległość między kolokalizowanymi punktami podobną do przybliżonego rozmiaru cząstek. Zazwyczaj 4 piksele są odpowiednie dla opisanych tutaj ustawień.
  7. Stosunek sygnału do szumu powinien pozwolić na wykrycie nawet słabych cząstek o niskiej fluorescencji. W ComDet ustaw ten współczynnik na 3, ustawiając czułość wykrywania w obu kanałach na bardzo słabe cząstki (SNR = 3).
    UWAGA: Chociaż ta wartość SNR jest zwykle odpowiednia, może być konieczne ustawienie jej wyższej (np. jeśli występuje dużo szumów obrazu, które mogą być identyfikowane jako liposomy i prowadzić do wyników fałszywie dodatnich).
  8. Upewnij się, że pola z opcjami Oblicz kolokalizację i Wykreśl wykryte cząstki w obu kanałach są zaznaczone przed naciśnięciem przycisku OK.
  9. Po uruchomieniu analizy pojawią się dwa wyskakujące okienka z wynikami i podsumowaniem. Eksport tabeli danych Wyniki zawierające dane kolokalizacji (współrzędne cząstek i zintegrowana intensywność każdej wykrytej cząstki) do wybranego oprogramowania do obsługi danych, zapisując tabelę jako plik .txt i importując ją do oprogramowania.
  10. Upewnij się, że każdy liposom jest uwzględniony tylko raz w zestawie danych, a nie zarówno w stosunku kanał1/kanał2, jak i kanał2/kanał1. W związku z tym przefiltruj dane tak, aby w kroku 5.11.
    wykreślono tylko Abs_frame = 1 UWAGA: Wybierając opcję Kolokalizowany = 1, można usunąć z analizy wyniki fałszywie dodatnie wynikające z szumu na obrazach. Jednak wszelkie liposomy, w których obecny jest tylko jeden z dwóch składników fluorescencyjnych, zostaną również wyłączone z analizy, co potencjalnie usunie ważne punkty danych z analizy.
  11. Wykreśl histogram kolumny z danymi zawierającymi współczynnik intensywności dla każdego wykrytego liposomu.
  12. Stopień niejednorodności składu dla badanego układu liposomalnego jest reprezentowany przez szerokość rozkładu współczynnika intensywności. Aby określić ilościowo niejednorodność, dopasuj histogram współczynnika intensywności za pomocą funkcji Gaussa i wyodrębnij średnią (μ) i odchylenie standardowe (sigma). Zapoznaj się z sekcją Reprezentatywne wyniki.
  13. Wartość stopnia niejednorodności (DI) można teraz obliczyć przy użyciu współczynnika zmienności zdefiniowanego jako DI = sigma / μ.

6. Kalibracja wielkości liposomu

  1. Wyjmij część zapasu liposomu i przepuść 21x przez filtr poliwęglanowy 50 nm, jak opisano w kroku 1.10.
  2. Rozcieńczyć liposomy, dodając 10 μl zawiesiny liposomów do 800 μl buforu sorbitolu w probówce do mikrowirówki.
  3. Przenieś rozcieńczoną próbkę liposomu do jednorazowej kuwety z polipropylenu.
  4. Zmierz rozmiar za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Wykonaj co najmniej trzy niezależne przebiegi, aby zmierzyć rozmiar i polidyspersyjność zawiesiny liposomowej.
    UWAGA: W razie potrzeby do pomiaru użyj bardziej skoncentrowanej zawiesiny liposomowej. Alternatywy dla DLS (np. analiza śledzenia nanocząstek) mogą być również stosowane do pomiaru wielkości liposomów. Opis sposobu wykonywania takiego oznaczania wielkości cząstek wykracza poza zakres tego protokołu.
  5. Zobrazuj liposomy kalibracyjne pod mikroskopem, używając dokładnie tych samych ustawień eksperymentalnych, jak określono w krokach 4.1 i 4.2.
  6. Wyodrębnij zintegrowaną intensywność dla każdego liposomu kalibracyjnego na obrazach kalibracyjnych: Wyodrębnij przefiltrowany arkusz wyników zawierający intensywność fluorescencji liposomów, jak opisano w krokach 5.1−5.10. Z tabeli wyników wyodrębnij kolumnę "IntegratedInt".
  7. Ponieważ całkowita zintegrowana intensywność liposomu znakowanego w jego błonie jest proporcjonalna do powierzchni liposomu, a zatem jest proporcjonalna do kwadratu jego średnicy, należy narysować histogram intensywności pierwiastka kwadratowego intensywności fluorescencji liposomów kalibracyjnych.
  8. Dopasuj zintegrowany histogram intensywności utworzony w kroku 6.7 do logarytmicznego rozkładu normalnego i wyodrębnij średnią intensywność fluorescencji liposomów kalibracyjnych.
  9. Aby określić zależność między intensywnością pierwiastka kwadratowego (IntSqrt) a wielkością liposomu, należy obliczyć współczynnik korekcyjny (C), używając średniej średnicy liposomu (Dia) ważonej liczbą uzyskaną z pomiarów DLS: Dia = C x IntSqrt jest równoważne C = Dia / IntSqrt.
  10. Obliczyć wartości IntSqrt dla liposomów w eksperymencie niejednorodności składu i przeliczyć je na średnice, mnożąc przez współczynnik korekcyjny.
  11. Wykreślić wartość współczynnika intensywności w funkcji średnicy dla liposomów o niejednorodności składu, uzyskując w ten sposób niejednorodność w funkcji wielkości liposomu dla populacji liposomów o długości fali od około 50 nm do 800 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzeganie opisanego protokołu umożliwia obrazowanie pojedynczych liposomów w masowy równoległy sposób (Rysunek 1). Pomyślne unieruchomienie powierzchni liposomów powinno być natychmiast widoczne po dodaniu roztworu liposomu do komory (krok 3.6 w protokole), ponieważ na obrazie powinny pojawić się plamy o ograniczonej intensywności dyfrakcji ( Rysunek 1B i Rysunek 1C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ważne jest, aby pamiętać, że chociaż szczegółowo opisujemy, w jaki sposób test pojedynczych liposomów może być wykorzystany do badania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami, platforma jest bardzo wszechstronna. Jak wcześniej wykazano i omówiono we wprowadzeniu, protokół można łatwo dostosować do badania aspektów fuzji błona-błona, interakcji białko-błona lub charakterystyki liposomalnego nośnika leku. W przypadku wszelkich pytań naukowych, które są poruszane, siła testu pojedynczego liposomu polega na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Duńską Radę ds. Niezależnych Badań [numer grantu 5054-00165B].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
8-dołkowe szkiełka mikroskopowe (i mikroszkiełka)Ibidi80827Szkiełka mikroskopowe ze szklanym dnem
Zestaw do wytłaczania Avanti Mini AvantiPolar Lipids610000Materiały eksploatacyjne (filtry Whatman) można nabyć w GE Healthcare
BSASigmaA9418
BSA-BiotynaSigmaA8549
CholesterolAvanti Polar Lipids700000Traded trough Sigma
Computer z wtyczką FIJI (Fiji Is Just ImageJ)ComDet musi być zainstalowany. Ponadto oprogramowanie do obsługi danych (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism itp.) zdolne do załadowania .txt plików będzie potrzebne do wykreślenia danych
DOPE-Atto488Atto-TechAD488-165
DOPE-Atto655Atto-TechAD655-165
DOPE-PEG-BiotinAvanti Polar Lipids880129Traded trough Sigma
D-SorbitolSigmaS-6021
Liofilizacja, np. ScanVac Coolsafe firmy Labogene
Fiolki ze szkłabrązowego, chromatografii brązowej150903Fiolki szklane, odporne na błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Wersja fiolek o pojemności 8 ml ma rozmiar, który pasuje również do strzykawek zestawu do wytłaczania
HClHoneywell Fluka258148
ŁaźniaMożliwość podgrzania do minimum 65 &stopni; C
Płyta grzewcza z mieszadłemMożliwość podgrzania do minimum 65 & deg; C
HEPESSigmaH3375
Ciekły azotW tym pojemnik do przechowywania, np. Kąpiel gumowa
Mieszadła magnetyczneVWR442-4520 (EU)
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlEppendorf0030 120.086 (EU)
MikroskopDo obrazów w tym protokole mikroskop konfokalny Leica SP5 ma były używane
Na HEPESSigmaH7006
NaClSigmaS9888
NaOHHoneywell Fluka71686
POPCAvanti Polar Lipids850457Handel przez Sigma
StreptavidinSigmaS4762
tert-butanol (2-metylo-2-propanol)Honeywell Riedel-de Haë n24127
ultraczysta, np. MilliQ
grzewcza magnetycznym Woda

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  2. Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
  3. Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13(2015).
  4. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  5. Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
  6. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  7. Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372(2008).
  8. Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
  9. Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
  10. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  11. Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192(2015).
  12. Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
  13. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
  14. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
  15. Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
  16. Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
  17. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
  18. Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
  19. Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
  20. Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
  21. Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807(2019).
  22. Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
  23. Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
  24. Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
  25. Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
  26. Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Liposome AssayFluorescence MicroscopyLiposome CompositionSize InhomogeneityFreeze Thaw CyclesLipid ExtrusionStreptavidin Biotin BindingCo Localization AnalysisIntensity Ratio HistogramDynamic Light Scattering

Powiązane artykuły